Introduction
营养物质和有毒物质的吸收和分布强烈地影响植物生长。因此，底层传输过程对调查构成的植物生物学和研究农业科学1,2的一个主要领域，特别是在营养优化和环境压力的环境中（ 例如 ，盐胁迫，铵毒性）。对于通量植物的测量方法中，最主要是利用放射性同位素示踪物，这是显著在20世纪50年代开发的。（ 例如 ，3），一直持续到今天被广泛使用。其他方法，如养分耗竭的从根介质和/或积累在组织中，使用的离子选择性微电极的振动测量，如MIFE（微电极的离子通量的估计）和SIET（扫描离子选择性电极法），并使用离子选择性荧光染料，也被广泛应用，但在他们的检测净感能力是有限XES（ 即 ，流入和流出之间的差异）。使用放射性同位素的，另一方面，允许研究者的独特能力来分离和量化单向通量，这可以被用来解决动力学参数（ 例如 ，K M和V max）和洞察能力，热力学，机制的运输系统和调节。与放射性示踪剂制成单向磁通测量条件下在相反的方向上的磁通量是高下特别有用的，并且细胞内池的周转迅速4。此外，放射性示踪方法允许较高的底物浓度下进行测量时，与许多其它的技术（参见“讨论”，下同），因为所跟踪的同位素是针对相同的元件的另一同位素背景观察。
这里，我们提供的单向和n中的放射性同位素的测量的详细步骤矿质营养等通量和毒物的完整植株。重点是对钾（K +）通量测量，植物大量营养5，和氨/铵制成（NH 3 / NH 4 +），另一个常量营养素是，然而，中毒性时在高浓度下（ 例如本，1 10毫米）2。我们将用放射性同位素42的K +（叔2 = 12.36小时）和13 NH13分之3NH 4 +（T 2 = 9.98分钟），分别在该模型系统中的大麦的完整的苗（ 大麦 Ļ ），在两个关键协议的描述：通过示踪剂流出（CATE）直接流入（DI）和室分析。我们应该注意到，从本文简单介绍了需要执行的每个协议的步骤开始。每种技术在适当的时候，提供计算和理论的简要说明，但详细的论述，的背景和理论能够在这个问题4,6-9几个关键物品被发现。重要的是，这些协议大致上可转移到磁通的其他营养素/毒物分析（ 例如 ，24的Na +，22的Na +，86 Rb的+，13 NO 3 - ）和其它植物物种的，尽管有一些需要说明的（参见下文） 。我们还强调，放射性物质工作的所有研究者必须在通过自己的机构的电离辐射安全监管机构设置许可工作的重要性。
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Protocol
1，植物文化和准备
- 大麦种植水培苗7天的气候控制生长室（详见10）。
注意：要考虑审查的植物在不同的发育阶段，因为营养需求会随着年龄的变化是很重要的。 - 前一天的实验，捆绑了几个苗在一起，使一个单一的重复（每包3植物的DI，每束6植物CATE）。丛苗通过包装有2厘米件聚乙烯管的周围芽的基部，并确保管道用胶带来创建一个“围脖”。
注：每捆植物的数目可以根据实验条件10,13,14而有所不同。集束做是为了提高统计和测量精度，特别是当根质量和/或比活性也低。
2，准备实验方案/材料
内容“>注：以下是典型的执行前1天的实验。- 对于直接投资，备齐下列各项：预贴标，标签和解吸的解决方案（详见11），离心管（离心式脱水干燥的植物样品），和样品瓶（植物材料和比活度[S O;见下文]）。曝气和混合所有的解决方案。
- 对于美食，备齐下列各项：嗯混合，加气的标签和洗脱解决方案（有关详细信息，请参阅第10），外排液漏斗，离心管（离心式脱水干燥的植物样品），和样品瓶（为洗脱液，植物样品，并确定S 0和稀释因子[D F;见下文]）。
3，放射性示踪剂准备
注意：以下的安全步骤，应先与放射性工作的措施。
- 确保radioac的要求略去材料许可被理解和遵守。穿戴适当的安全设备（ 如护目镜，手套，实验室外套，铅背心/领）和剂量计（ 例如 ，TLD环和徽章）。设置屏蔽（ 即有机玻璃和铅砖），并执行它后面的放射性工作。确保盖革 - 米勒计数存在以定期监测污染。
- 42 K的制备+
- 放置在天平上一个干净，干燥的烧杯中。零余额。
- 从包装中取出示踪剂小瓶（42 K 2 CO 3 20毫居里，呈粉末状）和倒示踪剂放入烧杯中。注意质量的。
- 吸取19.93毫升DH 2 O，随后0.07毫升H 2 SO 4，放入烧杯中。这将推动下列化学反应：
42，K 2 CO 3的 （S）+ H 2 SO 4（L）+ H 2 O（L）→42 2 SO 4 （L）+ CO 2（V）+ 2H 2 O（L） - 计算出的放射性原液的浓度，给定的K 2 CO 3的质量和分子量，并且体积（20毫升）中。
注：如果有13的NH 3月 13日 NH 4 +的示踪剂是产于通过水的氧原子的质子轰击回旋加速器工作（通常产生100-200毫居里活动;生产的详细信息，请参阅第12）。由于14 NH 十四分之三 NH + 4的量是非常低的，这些解决方案中，N浓度的储备溶液是可以忽略不计。
4，直接流入（DI）测量
- 为42 K +，吸取放射性原液到达K +的所需最终浓度为标记溶液所需的量。
- 为13的NH13分之3NH + 4，吸管少量（<0.5毫升）到标记溶液。允许的标签解决方案，以充分混匀（通过曝气）。
- 吸管标签解决方案1毫升子样品放入样品瓶（共4个样本）重复3次。
- 测量放射性小瓶（在“每分钟计数”，CPM），用γ计数器。确保该计数器进行编程，使得每分钟的读数被用于校正同位素衰变（这是针对这样短暂的示踪剂特别重要）。
- 通过计算四个样本的计数（CPM毫升-1），通过底物的浓度在溶液中除（微摩尔毫升-1）计算S 0（表示为每分钟微摩尔-1）。
- 沉浸在预标记（非放射性）溶液根部5分钟，进行预平衡的植物在试验条件下（见例如 ，10,13,14为变化前的标签时）。
- 沉浸在根标签（放射性）溶液中5分钟。
注：标注时间可以根据实验3,4,7-10而有所不同。 - 传送根部到解吸溶液中5秒以去除大量的表面附着的放射性。转移的根放入的解吸液的第二烧杯5分钟以外示踪剂进一步明确根。
- 解剖和独立笋，竹笋基部和根。
- 在低速放置于离心管中，根和自旋的样品30秒，临床级离心机（〜5000 XG），以除去表面和间隙水。
- 称取根（鲜重，FW）。
- 放射性计数植物样品中（拍摄，拍摄基础和根本，见步骤4.2.1）。
- 计算的通量。使用下面的公式计算出流入到植物
Φ= Q * / S 0重量Ł
其中Φ是通量（微摩尔克-1小时-1），Q *为示踪剂在组织中累积的量（CPM，通常在根，芽，和基底的拍摄，结合），S o为标记溶液（CPM微摩尔的比活性- 1），w是根鲜重（g），而t L是标记时间（hr）。
注：更复杂的计算可以由标签和解吸过程中考虑到从根部同时示踪剂流出的基础上，从CATE获得的参数（见下文;有关详细信息，请参阅第4）。
5，房室分析示踪流出（CATE）测量
- 准备标签解决方案和措施，S 0（见步骤4.1 - 4.2以上）。
- 测量稀释因子（D F）。
注意：通常情况下，相对于所述检测器中的γ射线计数样品的位置可以影响量辐射测量。详情请参阅讨论。- 测定S 0后，添加19为h毫升2 O到各样品（使得最终体积=洗脱液体积= 20毫升）中。放射性计数每20毫升样品中（见步骤4.2.1）。
- 通过将1毫升样品的平均CPM由20毫升样品的平均CPM计算D F。
- 沉浸在标签解决方案的根为1小时。
- 从标签解决方案和转让植物去除植物外排液漏斗中，确保所有根材料的漏斗内。要流出漏斗一侧轻轻的安全设备通过应用一小片胶带在塑料套。
- 轻轻倒出所述第一洗脱液进入漏斗。启动定时器（计数）。
- 打开该轴颈和后15秒收集在样品瓶的洗脱物（注：洗脱时间会有所不同，见下文）。关闭插口。轻轻倒出下一洗脱液进入漏斗。
- Repea吨步骤5.6的溶出系列，其中如下，从第一到最后的洗脱物的剩余部分：15秒（4次），20秒（3倍），30秒（两次），40秒（一次），50秒（一次），1分钟（25次），为29.5分钟的总洗脱时间
注：解吸系列可根据实验条件7-10,13,14而有所不同。 - 一旦洗脱协议完成后，收获的植物（步骤4.6 - 4.8以上）。
- 计数放射性洗脱液和植物样品中的伽马射线计数器（阅读每个洗脱液用D F相乘，见5.2）。
- 情节示踪剂释放（CPM克（根FW）-1分-1）为洗脱时间的函数。对于稳态条件下，进行线性回归和通量计算，半衰期交流和池大小（详见6-9）。
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Representative Results
图1示出了使用DI技术（13 N）中的等温线，用于NH 3的流入，在高生长完好大麦幼苗的根部（10毫米）的NH 4 +，和任一低（0.02毫摩尔）或高（5毫）K +。的等温线显示米氏动力学时NH 3通量被绘制为外部的NH 3浓度（[NH 3]分机号码 ;可以通过改变调节溶液的pH 13）的函数。 NH 3通量分别为显著更高的低K +比在高K +。米氏动力学参数分析表明，K M保持K +水平（150对比90μM按照低和高K +，分别）之间相对稳定，而V， 最大值是强烈减少在高K +（205对比80微摩尔克-1小时-1）。因此，该数据表明，K +水平regulatES氮交通（V（ 最大值 ）的效果），而不是由结合转运站点的K +和NH 3之间的直接竞争（K M效应）。相反， 钾可以调节NH 3通量通过其他方式，如通过水通道蛋白活性的调节（有关详细信息，请参阅第13）。
直接投资也是在涌入变化比较快的捕捉有用由于营养的变化，或对药物制剂中的应用。例如， 图2突出了K + -uptake系统的完好大麦幼苗的根在中等（0.1毫摩尔）K +和高（10毫米）长的快速可塑性- NH 4 +的条件。在这里，我们从外部观察到溶液中5分钟内的NH 4 +退为K +内流了〜350％的增幅。这个“铵戒断效应”（“AWE”）被认为是在K敏感+ +），钡（Ba 2 +），和铯（Cs +）。在一些基因型的拟南芥使用DI和电生理测量，我们可以得出结论归因于绝大多数的亚洲国际博览馆的变化拟南芥 K +通道，AtAKT1和高亲和力K +转运，AtHAK5 14的活动。
图3地块42 K +稳态流出，随着时间的推移，从预先标记的大麦幼苗根系在低温（0.1毫米） 的 K +和中度（1毫米）长NO 3 - 。这些痕迹显示CATE方法可以揭示如何在应用各种药物/营养剂快速显著变化外排。在10毫铯 ，A K +通道阻滞剂，或急剧增加或者应用程序的K +外流的庞大，直接抑制观察在K +拨款（从0.1至10毫摩尔）。这些结果与分子研究描述的外向整流K +通道15中的独特的门控性质相一致。相比之下，应用10mM的NH 4 +的快速和强烈刺激的K +流出。这种效果可以通过外向整流K +通道的活化通过跨根细胞16，其已知会发生引入NH 4 +的17时的质膜的电势梯度的消偏振进行说明。因此，使用这种方法，我们已经能够证明， 在植物中 ，是K +通道介导的 K +外流大麦10根。
最后， 表1示出从稳态42的K +流出（[K +] 分机号码 = 0.1毫摩尔）的大麦种子的测量萃取CATE参数lings成长无论是与1毫米NO 3 - ，或10毫米的NH 4 +，后者代表一种有毒的情景。高NH 4 +的状态带来抑制所有的钾离子通量，并在细胞内钾离子浓度显著下降（K +] CYT），这通常是homeostatically下健康成长的条件18保持在〜100毫米（为观察， 例如 ，在表1中 ，编号3下-供给）。
图1：13的NH 3涌入等温线显示了如何的K +电源调节氮交通：NH 3涌入的各种外部浓度的NH的功能
图2：NH 4 +退显著刺激通道介导的 K +内流。 的 K +内流在稳定状态，并且在戒断的NH 4 +的，在低（0.1毫摩尔） 的 K +和高生长完好大麦幼苗的根部（10 mM计）的NH 4 +。的K + -channel阻滞剂（10mM的TEA +，5mM的钡离子 ，和10mM 铯 ）的刺激K +内流的影响是显着的。星号表示- NH 4 +和治疗对（* 0.01 <P <0.05，*** P <0.001之间不同程度的显着性;单向ANOVA和Dunnett的多重比较事后试验）。括号中的星号表示控制和-NH 4 +对（学生t检验 ）之间的显着性水平。误差线表示的> 4个重复扫描电镜。 （转载自Coskun 等 。能力和钾通道和高亲和力转运可塑性大麦和拟南芥植物生理学，162，496-511（2013）的根。）
图3的K +流出的通道介导的低K +条件下稳定状态中，在低（0.1毫摩尔）及K +，中度（1毫米）生长完好大麦幼苗的根部42的K +流出NO 3 - ，和的直接影响（在t = 15.5分钟，见箭头）的10毫米CSCL，5毫米的K 2 SO4，和5mM（NH 4）2 SO 4上流出。每个图表示的3-13个重复（SEM <平均值的15％）的平均值。 （转载自Coskun 等法规，钾释放大麦根系机制：。一个在植物中 42 K +分析新植醇 188，1028至1038年（2010年）。）
| [K +] 转 | 氮源 | 潮 | 流出 | 净通量 | E：I比 | 池大小 | 半衰期 |
| （MM） | （微摩尔克-1小时-1） | （MM） | （分钟） | ||||
| 0.1 | 1 NO 3 - | 7.22±0.23 | 1.86±0.18 | 5.36±0.18 | 0.25±0.02 | 98.84±14.08 | 28.18±3.40 |
| 10 NH 4 + | 1.89±0.13 | 0.57±0.05 | 1.32±0.10 | 0.30±0.01 | 28.39±3.40 | 32.50±4.69 | |
表1稳态K +通量和c在各种Ñ规定ompartmentation稳态通量和大麦幼苗室分析在0.1mM的K +生长，并且温和NO 3 - （1毫米，如钙离子的盐）或高的NH 4 +（10毫米，以SO 4 2 -的盐）。错误指示> 8次重复±标准差。 （转载自Coskun 等法规，钾释放大麦根系机制：。一个在植物中 42 K +分析新植醇 188，1028至1038年（2010年）和Coskun 等能力及钾离子通道及可塑性高。亲和力转运大麦和拟南芥植物生理学，162，496-511（2013）的根。）
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Discussion
这表现在上面的例子中，放射性示踪方法是一个功能强大的测量营养素和有毒物质在植物中的单向磁通的装置， 图1示出的NH 3流入可超过225微摩尔克-1小时-1，这也许是达到最高善意的跨膜通量曾报道在植物中的系统13，但是，如果测定仅净通量这个磁通量的大小将是不可见的。这是因为，NH 3的大流出发生在同一时间涌入，在徒劳的自行车的场景，可能导致流入的明显低估，随着时间的标签13增加。通过补充与电生理分析的示踪技术，我们能够证明， 图1中的条件下，对13 N都流入和流出是主要的中性气体的NH 3，而不是其conjug的吃酸NH + 4（详见13）。这是第一次在快速的NH 3气体通量根植物中的示范，正因为如此，提供了重要的初步证据对解开是世界上最大的NH 3 / NH 4 +的毒性高等植物2,13心脏的传输机制。在异源表达系统中分子的工作已经表明，NH 3可通过水通道蛋白在植物中19，并且将数据从图1中流动，伴随着最近的药理学证据，已经开始在完整生物体13的水平，以证实上述发现。
图2和图3还提供测量单向通量与放射性示踪剂的效用的很好的例子。使用DI 42的K +，我们能够证明，离子通道是不负责的稳态K + +和高的NH 4 +，与此相反的模型系统拟南芥 14。只有当NH4 +被撤销，我们才看到证据，K +通道的参与（ 图2）。尽管K +的净通量也刺激由NH 4 +的戒断（如由增加的组织中的 K +含量14）中，仅通过测量单向流入是我们能够发现这种现象的大小和快速起效。此外，通过进行DI测量与突变体和药理学试剂，我们能够确定参与其中转运蛋白。同样，通过将营养和药物制剂，同时监测示踪剂流出（ 图3），我们能够鉴定和识别来自大麦根细胞10 K +流出的机制。因此，技术，诸如离子和CATE可有助于对传输特性的一个重要的宏量营养素的认识。
在协议中所指出的，通常相对于所述检测器中的γ射线计数样品的位置可以影响辐射的测量的数量。因此，如果一个1毫升的样品被“加满”的19毫升的H 2 O，20毫升样品中测量（CPM）的计数可以是小于1毫升样品中显著下，尽管具有相同的量的放射性示踪剂。因此，D F可以应用于校正放射性的这种明显的“稀释”。这个问题往往没有明确的检测仪器制造商规定，必须由个人研究制定。同样，对环境辐射（ 即从柜台内附近的样本）探测器内屏蔽的效果可以通过制造商被夸大，而这种问题应该工作出了单独的测量系统。
示踪技术的一个主要优点是其非侵入性，它提供了测量通量，细胞内池大小和汇率的手段，稳态条件下。例如，用CATE，我们可以非侵入性地量化胞质浓度K +（ 表1）。这可以是优选的替代方法，如细 胞的穿刺用离子选择性微电极18，其赋予物理和可能的化学干扰的小区。此外，示踪技术，它提供了流量和条块分割的整体器官和完整植株的综合视图独一无二的。这一点很重要，如果一个有兴趣了解全株养分动态，毒性，最终，在场上的表现。最后，示踪剂的方法允许在相当高的底物浓度下的情况下进行非常敏感的测量。俗周志武消耗试验和微电极技术可以体验的背景干扰的问题，因此，可能需要所关注的基板的外部浓度降低远低于生长过程中提供的。这可能是有问题的，如果一个是兴趣研究高底物浓度的“稳态”的条件下（如用NH 3 / NH 4 +的毒性或“高-K +”的条件下，见上文）。
但是应当指出的是，像所有的技术中，测量光束与放射性示踪剂并非没有其局限性。例如，放射性示踪剂的可用性可能会产生问题，特别是对于非常短寿命同位素像13 N，需要接近的制造设备，如回旋加速器。另一个主要问题是，有时，也可以是难以被横跨细胞膜发生通量和那些发生extracel区分lularly。这样的区分要求严格的相位检测7,10,20。以K +外流的情况下，只有经过仔细的检查是我们能够确认稳态42的K +释放的根源在高跨细胞膜发生不K + 分机 （> 1毫米）10，但是从外位（CF， 图3）。这些问题可以通过检查的范围广泛的药理学试剂的效果来解决，或者通过热力学分析，这表明，例如，盐水的条件下报告非常高的Na +通量将是积极不可行了他们继续穿过细胞膜21,22。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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