Introduction
栄養素や毒物の取り込みと分布が強く、植物の成長に影響を与える。したがって、基本的な輸送プロセスの研究は、特に栄養の最適化と環境ストレス（ 例えば 、塩ストレス、アンモニウム毒性）の文脈で、植物生物学や農学1,2の研究の主要な領域を構成している。植物中のフラックスを測定するための方法の中で最高経営責任者は、1950年代に大幅に開発された放射性同位体トレーサーを使用することである（ 例えば 、3を参照）、今日広く使用され続けています。そのような根培地および/または組織への蓄積から栄養枯渇の測定などMIFE（微小電極イオン磁束推定）とSIET（イオン選択性電極法をスキャン）のようなイオン選択性振動マイクロ電極の使用、の使用などの他の方法は、イオン選択性蛍光色素は、広く適用されるが、正味のインフルエンザを検出する能力が制限されているXES（ すなわち 、流入と流出の差）。放射性同位体の使用は、一方で、研究者は動力学的パラメーターを解決するために使用することができる一方向性フラックスを分離し、定量化するユニークな能力を可能にする（ 例えば 、K MおよびV max）は 、容量への洞察を提供し、エネルギー論、交通システムのメカニズム、および規制、。放射性トレーサーで作られた単方向フラックス測定は反対方向に磁束が高く、細胞内プールの代謝回転が急速4である条件の下で特に有用である。トレースされた同位体は、同じ要素の別の同位体を背景に観察されているため、また、放射性トレーサーの方法は、（以下に、「ディスカッション」を参照）の測定は、多くの他の技術とは異なり、かなり高い基質濃度下で行うことを可能にする。
ここでは、単方向であり、nの放射性同位体を測定するための詳細な手順を提供完全な植物ミネラル栄養素や毒物のらフラックス。重点が存在する場合、高濃度（ 例えば 、1〜において、カリウム（K +）のフラックス測定に有毒植物主要栄養素5、アンモニア/アンモニア（NH 3 / NH 4 +）、しかし、別の主要栄養素を説明する10ミリモル）2。私たちは、モデル系の大麦（ オオムギ L の無傷の苗に、それぞれ、NH 4 +（T 1/2 = 9.98分）の放射性同位元素42 K +（T 1/2 = 12.36時間）と13 NH 3月 13日を使用します。）、2主要プロトコルの説明において：トレーサー流出（CATE）による直接流入（DI）とコンパートメント解析。私たちは、この記事は、単純に各プロトコルを実行するために必要な手順を説明し、最初から注意してください。計算と理論の適切な、簡潔な説明が提供される場合、各技術の詳細な博覧会の背景と理論は対象4,6-9上のいくつかの重要な論文に記載されています。重要なことは、これらのプロトコルは他の栄養素/毒物の分析をフラックスに広く譲渡する（ 例えば 、24のNa +、22 Na +の、86のRb +、13 NO 3 - ）および他の植物種に、いくつかの注意事項ではあるが（下記参照） 。また、放射性物質を扱うすべての研究者が機関の電離放射線安全·レギュレータを介して配置されたライセンスの下で働かなければならない重要性を強調。
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Protocol
1工場の文化と準備
- （詳細は、10を参照）、気候制御された成長チャンバー内で7日間の大麦苗の水耕を育てる。
注：それは栄養の要件は年齢とともに変化するように、発達段階の多様で植物を調べて検討することが重要です。 - 実験前のある日、一つの複製（DI用のバンドルにつき3工場、CATE用のバンドルにつき6工場）を作るために一緒にいくつかの苗をバンドル。シュートの基部の周りにタイゴンチューブの2cmのピースをラップし、「カラー」を作成するテープでチューブを固定することによって苗をバンドルします。
注：バンドルあたりの植物の数は、実験条件の10,13,14に基づいて異なる場合があります。バンドリングは、根量および/または比活性が低い場合は特に、統計、測定精度を向上させるために行われる。
実験的ソリューション/材料の作製
コンテンツ ">注：以下は、一般的に実験前に1日に実行されます。- DIは、次の収集：プレ標識、標識、及び脱着溶液（詳細については、11を参照のこと）、（植物試料の脱水のための）遠心分離管、及び植物材料および特異的活性のためのサンプルバイアル（[S o を ;下記参照]）。曝気し、すべての溶液を混合。
- CATEは、以下収集し、溶出液を、植物試料について（よく混合、曝気ラベリングおよび溶出ソリューション（詳細については、10を参照）（植物試料の脱水のために）、排出漏斗、遠心分離管、及びサンプルバイアルとS oと希釈係数の決定[D fは 、下記参照]）。
3放射性トレーサーを準備
注意：以下の安全のステップが放射能で作業する前に注意する必要があります。
- radioacの要件を確認してください電性材料のライセンスが理解され、続いている。適切な安全装置（ すなわち 、ゴーグル、手袋、白衣、鉛ベスト/襟）と線量計（ 例えば 、TLDリングとバッジ）を着用してください。シールドを設定し（ すなわち 、プレキシグラス、鉛レンガ）と、その背後にある放射性作業を行う。ガイガーミュラー計数が日常的汚染を監視するために存在していることを確認してください。
- 42 K +の調製
- バランスに清潔で乾燥したビーカーを置きます。バランスをゼロ。
- パッケージからトレーサーのバイアル（粉末状の42 の K 2 CO 3の20 mCiの）を外し、ビーカーにトレーサーを注ぐ。塊をメモしておいてください。
- ビーカーにH 2 SO 4の0.07ミリリットルに続くのdH 2 Oをピペットは19.93ミリリットル、、。これは、次の化学反応を駆動する。
42 K 2 CO 3 （複数の）+ H 2 SO 4（リットル）+ H 2 O（l）の42→ 2>アップSO 4 （リットル）+ CO 2（v）の+ 2H 2 O（l）の - 放射原液の濃度を計算し、質量およびK 2 CO 3の分子量および体積（20ml）に与えられた。
NOTE：13 NH 3/13と作業NH 4 +トレーサー水の酸素原子の陽子衝撃を介して、サイクロトロンで生成される場合（典型的には100〜200 mCiの活性が得られる;製造の詳細については、12を参照のこと）。 14 NH 14分の 3 NH 4 +の量は、これらの溶液中の非常に低いため、原液のN濃度は無視できる。
4。直接流入（DI）の測定
- 42 K +のため、ピペット標識溶液にK +の所望の最終濃度に達するのに必要な放射性ストック溶液の量。
- NH 3/13 13のためにNH 4 +、ピペット標識溶液に少量（<0.5）を加えた。標識溶液は、（エアレーションを介して）完全に混合できるようにします。
- サンプルバイアルに1ミリリットルの標識溶液のサブサンプルをピペットで3回（計4サンプル）を繰り返します。
- ガンマカウンターを使用して、（「分あたりのカウント」、CPMでの）バイアル中の放射能を測定します。 （これは、そのような短命なトレーサーは特に重要です）カウンタがcpmの測定値は、同位体の崩壊について補正されるようにプログラムされていることを確認してください。
- 四つのサンプルのカウント（CPMを加え-1）を平均し、（マイクロモル溶液-1）溶液中の基質の濃度で割ることにより（CPMのマイクロモル-1として表される）、S o を計算します。
- 参照（試験条件下で植物を事前に平衡化し、5分間プレ標識（非放射性）溶液中に根を浸す例えば 、前のラベル時間のばらつきのため10,13,14）。
- 5分間の標識（放射性）溶液中に根を浸し。
注：ラベリング時間は実験3,4,7-10に基づいて変更することができる。 - 表面付着放射能の大部分を除去するために5秒間脱離液に根を転送します。外トレーサーの更なる明確なルーツに5分間脱離液の第二のビーカーに根を移す。
- シュート、基底シュート、および根を解剖し、独立した。
- 表面と間隙水を除去するために、低速、臨床グレードの遠心分離機（〜5000×g）で30秒間遠心管とスピンサンプル中の根を置きます。
- 根（生重量、FW）を秤量する。
- 植物試料中の放射能カウント（シュート、基底シュート、および根を、ステップ4.2.1を参照のこと）。
- フラックスを計算します。の式を用いて植物に流入を計算
Φ= Q * / S O重量L
Φはフラックスです（マイクロモルgの-1時間-1）、Q *は、組織（通常はrootでのcpmで、シュート、および基底シュート、組み合わせ）に蓄積されたトレーサの量である、S oは標識溶液（CPMのマイクロモルの比活性である- 1）、w は根の新鮮重量（g）であり、t Lは、標識化時間（hr）である。
注：より高度な計算がCATEから得られたパラメータに基づいて、ラベル付け、脱着時の根からの同時トレーサー流出を考慮して行うことができる（;詳細については、4を参照して以下を参照）。
トレーサー流出（CATE）測定による5。コンパートメント解析
- （ -上記、4.2の手順4.1を参照）標識溶液を準備し、S o を測定する。
- 希釈倍率（D fで ）を測定します。
注：多くの場合、ガンマカウンターで検出器に対する試料の位置量に影響を与えることができる放射線を測定。詳細については、説明を参照してください。- S o を測定した後、各試料にH 2 Oの19ミリリットルを追加（ように最終容量=溶出液量= 20ミリリットル）。各20mlの試料中の放射能をカウントする（ステップ4.2.1を参照）。
- 20ミリリットルの試料の平均CPMによって1mlのサンプルの平均cpmで割ることによってD Fを計算します。
- 1時間標識溶液中で根を浸し。
- すべてのルート材料が漏斗内にある保証し、流出漏斗に標識溶液と転送植物から植物を取り出します。プラスチックカラーの上にテープの小片を適用することにより、排出漏斗の側に静かに安全な植物。
- 静かに漏斗に最初の溶出液を注ぐ。 （カウントアップ）タイマを起動します。
- スピゴットを開き、15秒後にサンプルバイアル内の溶出液を収集する（注：溶出時間が異なります。下記参照）。スピゴットを閉じます。静かに漏斗に次の溶出液を注ぐ。
- Repea最初から最後の溶出液に、以下の溶出シリーズの残りのtステップ5.6：15秒（4回）、20秒（3回）、30秒（2回）、40秒（1回）、50秒（1回）、1分（25回）、29.5分の総溶出期間
注：脱着シリーズは実験条件7-10,13,14に基づいて変化することができる。 - 溶出プロトコルが完了すると、収穫植物は、（ - 上記4.8、4.6ステップ）。
- （5.2参照、D fで各溶出物の読み取りを乗じ）ガンマカウンターで溶出液および植物試料中の放射能をカウントします。
- 溶出時間の関数としてプロットトレーサーリリース（CPM gを（ルートFW）-1分-1）。定常状態では、（詳細は6-9を参照）フラックス、交換の半減期は、プールサイズの線形回帰や計算を実行します。
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Representative Results
図1は 、高で成長した無傷の大麦の苗の根に、NH 3の流入のために（13をN）DI技術を使用して見つかった等温線を示している（10 mM）を、NH 4 +、およびいずれか（0.02 mM）の低または高（5 mMの）K +。 （;溶液のpH 13の変化によって調整する[NH 3] EXT）NH 3のフラックスは、外部のNH 3濃度の関数としてプロットされた場合の等温線は、ミカエリス·メンテン速度論を表示します。 NH 3フラックスは高K +よりも低K +で有意に高かった。ミカエリス·メンテン動力学的パラメータを分析すると、V maxは強く高K +（205対で減少している間、K Mは 、K +レベル（それぞれ低及び高K +、150対90μM）との間で比較的安定していたことを示した80マイクロモルのG -1時間-1）。したがって、データは、K +レベル regulatエス窒素輸送（V maxは効果 ）ではなく、トランスポーターの結合部位についてのK +とNH 3との間に直接的な競争（K M効果 ）による。むしろ、K +は、アクアポリンの活性の調節を介してのような他の手段（詳細については、13を参照）によってNH 3フラックスを調節し得る。
DIはまた、栄養に移行する、または薬理学的薬剤の適用に流入における比較的速い変化を捕捉するのに便利です。たとえば、 図2は中程度（0.1 mM）を-K +と高い（10 mM）を-NH 4 +条件で成長させ、完全な大麦の苗の根にある+ -uptake系Kの急速な可塑性を強調しています。ここでは、外部溶液からNH 4 +離脱の 5分以内のK +流入における〜350％の増加を観察した。この「アンモニウム離脱効果」（「AWE」）はK +に感受性であることが見出された+）を、バリウム（Ba 2 +）、およびセシウム（Cs +）。いくつかのシロイヌナズナ遺伝子型におけるDIと電気生理学的測定を用いて、、AtAKT1決定的シロイヌナズナ K +チャネルの活性の変化にAWEの大半を帰することができましたし、高親和性K +トランスポーター、AtHAK5 14。
図3のプロットが低い（0.1 mM）のK +と（1 mM）の中程度で成長した予め標識大麦の苗の根から時間をかけて42のK +の定常状態流出、NO 3 - 。これらのトレースはCATE法は、さまざまな栄養/薬理学的物質を加えると流出の急速かつ大幅な変更を明らかにすることができる方法を示しています。 K +流出の実質的、即時の阻害は、10mMのCs +、K + -チャネルブロッカー、または急激な増加のアプリケーションのいずれかの際に観察された（0.1から10mmまで）のK +引当金の。これらの結果は、外向き整流性K +チャネル15の固有のゲーティング特性を記述する分子の研究と一致しているのに対し 、迅速かつ強力に10mMのNH 4 +のアプリケーションはK +流出を刺激した。この効果は、NH 4 + 17の導入の際に起こることが知られているルートセル16の原形質膜を横切る電位勾配の脱分極を介して外向き整流性K +チャネルの活性化によって説明することができる。したがって、この方法を用いて、私たちは、K +チャネルは大麦10の根のK +流出を媒介すること、 植物体中で 、示すことができた。
最後に、 表1は、42 K +流出（[K +] EXT = 0.1 mM）をオオムギ種子における定常状態の測定から抽出されたCATEパラメータを示していまたは10mM NH 4 +、後者は有毒なシナリオを表す- lingsのいずれか1 mMのNO 3を用いて成長させた。高いNH 4 +の状態は、すべてのK +フラックスの抑制、および細胞質K +濃度の大幅な減少をもたらす（[K +] CYT）観察されたように、通常は恒常的に（健康な成長条件の下で18〜100 mMのに維持され、 例えば 、 表1において、NO 3の下-電源）。
図1。13 NH 3流入等温線は、K +電源が窒素輸送を調節する方法を明らかにした。NH 3の流入をNHの外部濃度を変化させる機能として、
図2：NH 4 +撤退が大幅に低い（0.1 mM）のK +および高で成長させ、完全な大麦の苗の根に、定常状態でのチャネル媒介K +流入、K +流入を刺激し、NH 4 +の撤退時に（10 mM）のNH 4 +。刺激されたK +流入に対するK + -チャネル遮断薬（10mMのTEA +の、5mMののBa 2 +、および10mMのCs +）の効果が顕著である。一方向ANOVAダネットの多重比較ポストホック付き;アスタリスクは-NH 4 +と治療のペア（* P <0.01 <0.05、*** P <0.001間の有意性の異なるレベルを表す試験）。括弧内のアスタリスクは、コントロールと-NH 4 +ペア（スチューデントのt -test）との間の有意水準を示す。エラーバーは、> 4の複製のSEMを示している。 （大麦及びシロイヌナズナ。 植物Physiol。162、496から511（2013）の根のCoskun ら容量およびカリウムチャネルと高親和性トランスポーターの可塑性から再生。）
。図3のK +流出は、低K +条件下での低い（0.1 mM）のK +と適度な（1 mM）のNO 3で成長した無傷の大麦の苗の根の定常状態42 K +流出チャネル媒介 - であり 、 （tで= 15.5分;矢印参照）即効性の10mMのCsCl、5mMのK 2 SO4、5mMの（NH 4）2 SO 4上で流出。各プロットは3-13回の反復（SEM <平均値の15％）の平均を表す。 （。Coskun ら規制と大麦の根からのカリウム放出のメカニズムから再生： インプランタ 42のK +分析の新しいフィトール 188、1028年から1038年（2010）。）
| [K +] 内線 | N源 | 流入 | 流出 | 正味フラックス | E：私レシオ | プールサイズ | 半減期 |
| （MM） | （マイクロモルgの-1時間-1） | （MM） | （分） | ||||
| 0.1 | 1 NO 3 - | 7.22±0.23 | 1.86±0.18 | 5.36±0.18 | 0.25±0.02 | 98.84±14.08 | 28.18±3.40 |
| 10 NH 4 + | 1.89±0.13 | 0.57±0.05 | 1.32±0.10 | 0.30±0.01 | 28.39±3.40 | 32.50±4.69 | |
表1に定常状態K +フラックスおよびcさまざまなN個の規定に基づくompartmentation定常状態のフラックスと0.1 mMのK +で成長させた大麦苗のコンパートメント解析、およびいずれかの適度なNO 3 - （1 mMの、のCa 2 +塩として）または高NH 4 +（10mMの、などのSO 4 2-塩）。エラーが> 8回の反復の平均±SEMを示している。 （Coskun らから再生規制と大麦根からのカリウム放出のメカニズム：。カリウムチャンネルのインプランタ 42のK +分析の新しいフィトール 188、1028年から1038年（2010）とCoskun ら能力と可塑性と高大麦とシロイヌナズナの根における親和性トランスポーター。 植物Physiol。162、496から511（2013）。）
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Discussion
上記の例で示したように、放射性トレーサー法が植物体に栄養素や毒性物質の単方向のフラックスを測定する強力な手段である。 図1は 、NH 3流入は225マイクロモルgの-1時間-1、おそらくあるの過剰に達することができることを示していますこれまでプラントシステム13に報告された最高善意の膜貫通フラックスが、唯一のネットフラックスを測定した場合は、この磁束の大きさは見えない。 NH 3の大流出ラベリング時間13とともに増加流入の顕著な過小評価をもたらすことができる無駄なサイクリングのシナリオでは、流入と同時に発生するためである。電気生理学的解析をトレーサー法を補完することで、 図1の条件で、13 Nの両方の流入と流出は、主に中性ガス、NH 3のではなく、そのconjugであることを実証することができた酸NH 4 +が （詳細については、13を参照）食べた。これは根が急速にNH 3ガスフラックスのインプランタデモンストレーションの最初に 、そのようなものとして、高等植物2,13中のNH 3 / NH 4 +の毒性のコアとなるトランスポート·メカニズムの解明に向けて、重要な予備的な証拠を提供しています。異種発現系における分子作業はNH 3が最近の薬理学的証拠と一緒に、植物19、及び図1からのデータにアクアポリンを介して流れることができることを実証した、無傷の生物13のレベルでこのような知見を確証し始めている。
図2および図3はまた、放射性トレーサーで一方向の磁束を測定する有用性の優れた例を提供する。 42 K +とDIを用いて、そのイオンチャネルは、定常状態のK +については責任を負いません実証することができたシロイヌナズナ 14とは対照的に、低K +と高いNH 4 +で成長した大麦の苗の根における取り込み。 NH 4 +が撤回された場合にのみ、私たちはK +チャネルの関与の証拠（ 図2）を参照してくださいました。 （増加した組織のK +含量14によって示されるように）K +の正味のフラックスはまた、NH 4 +の撤退によって刺激されていますが、単方向の流入を測定することによってのみ、私たちができるこの現象の大きさと迅速な開始を明らかにした。さらに、変異体および薬理学的薬剤とDI測定を行うことによって、私たちはタンパク質が関与している輸送同定することができた。同様に、トレーサーの流出を監視しながら（ 図3）栄養および薬理学的薬剤を適用することによって、私たちは特徴付け、オオムギ根細胞10からのK +流出のメカニズムを同定することができた。そのようなDIとしてこのように、技術とCATEは、重要な主要栄養素のための輸送特性の理解に尽力することができます。
プロトコルで述べたように、多くの場合、ガンマカウンターで検出器に対する試料の位置が測定された放射線の量に影響を与えることができる。 1-mlのサンプルは、H 2 Oを19ミリリットルに「補充」されている場合このように、20mlの試料において（cpm）を測定した数が同じ量を持つにもかかわらず、1ミリリットルのサンプルに比べて有意に低くすることができる放射性トレーサーの。したがって、D fは、放射能のこの明らかな「希釈」を補正するために適用することができる。この問題は、多くの場合、明示的に検出器具の製造業者によって記載されておらず、個人の研究者によって働いている必要があります。同様に、（カウンターの中、近くのサンプルからすなわち 、）周囲の放射線に対する検出器内のシールドの有効性は、製造業者によって誇張することができ、このような問題は働いたことがなければならない個別の測定システムのためのアウト。
トレーサー技術の主な利点は、定常状態の条件下で、フラックス、細胞内プールのサイズ、及び為替レートを測定する手段を提供し、その非侵襲性である。たとえば、CATEで、私たちは非侵襲的にK +（ 表1）の細胞質ゾルの濃度を定量化することができます。これは、細胞への物理的および化学的な可能性外乱を付与するイオン選択的微小電極18、を有する細胞の突き刺しなどの代替の方法に好ましいことがある。また、トレーサー技術は、全体の臓器や完全な植物用フラックスと区画化を包括的に提供するという点でユニークです。一つは全体の植物栄養素動態、毒性、およびフィールドで、最終的には、パフォーマンスを理解する上で興味を持っている場合に重要です。最後に、放射性トレーサーの方法は、かなり高い基質濃度下で実施することが非常に敏感な測定が可能になります。 Traditional枯渇実験と微小電極技術は、バックグラウンド干渉の問題が発生することができ、したがって、目的の基質の外部濃度が十分に成長の間に提供されるものよりも低下していることが必要な場合があります。一つは（;上記参照、例えばNH 3 / NH 4 +毒性または「高K +」の条件のように）高い基質濃度の「定常状態」の条件を研究することに関心がある場合、これは問題になる可能性があります。
これは、すべての技術のように、放射性トレーサーでフラックスを測定することには限界がないわけではないことに留意すべきである。例えば、放射性トレーサーの利用可能性は、特に、サイクロトロンなどの生産施設のすぐ近くを必要とする13 Nのような非常に短命の同位体のために、問題となる可能性がある。もう一つの主要な制限は、時にはそれが膜を横切って発生している磁束とそれらの天然extracelを区別することは困難であることであるlularly。このような区別は厳密な相試験の7,10,20を求める。 K +流出の場合には、慎重に検討が定常状態42 K +の根からの放出は、高[K +] 内線 （> 1 mM）を10で細胞膜を横切っていないに発生するが、細胞外からされたことを確認することが私たちができた後にのみスペース（参照、 図3）。それらが細胞膜を横切って進行したような問題は、薬理学的物質の広い範囲の効果を調べることによって解決することができ、または示されている熱力学的分析を介して、例えば、生理条件下で報告された非常に高いのNa +フラックスは、エネルギー的に不可能であろう21,22。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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