Introduction
Die Aufnahme und Verteilung von Nährstoffen und Schadstoffen stark beeinflussen das Pflanzenwachstum. Dementsprechend ist die Untersuchung der zugrunde liegenden Transportprozesse stellt einen wichtigen Bereich der Forschung in der Pflanzenbiologie und Agrarwissenschaften 1,2, vor allem in den Kontexten der Ernährungsoptimierung und Umweltbelastungen (zB Salzstress, Ammoniumtoxizität). Das wichtigste Verfahren zur Messung von Flussmitteln in Pflanzen ist die Verwendung von Radioisotopen-Tracer, die sich in den 1950er Jahren entwickelt wurde (siehe Beispiel 3) und ist bis heute weit verbreitet. Andere Verfahren, wie die Messung von Nährstoffverarmung aus dem Wurzelmedium und / oder Akkumulation in Geweben, die Verwendung von Ionen-selektiven Mikroschwing wie Mife (Mikro Ionenfluß Schätzung) und SIET (Rasterionenselektive Elektrode Technik), und die Verwendung von Ionen-selektiven Fluoreszenzfarbstoffe, werden ebenfalls häufig verwendet, sind aber in ihrer Fähigkeit, Netz Grippe erkennen begrenztxes (dh die Differenz zwischen Zufluss und Abfluss). Die Verwendung von Radioisotopen, auf der anderen Seite ermöglicht es dem Forscher die einzigartige Fähigkeit, zu isolieren und zu quantifizieren unidirektionalen Flüsse, die verwendet werden können, um die kinetischen Parameter zu lösen (zB K M und V max) und geben einen Einblick in die Fähigkeit, Energetik, Mechanismen und die Regulation von Transportsystemen. Gleichfluss-Messungen mit Radiotracer sind besonders unter Bedingungen, wo der Fluss in die entgegengesetzte Richtung ist hoch nützlich, und der Umsatz von intrazellulären Pools ist schnell 4. Außerdem ermöglichen Radiotracer Methoden Messungen unter relativ hohen Substratkonzentrationen im Gegensatz zu vielen anderen Verfahren durchgeführt werden (siehe "Discussion", unten), weil die zurück Isotop vor dem Hintergrund der anderen Isotop des gleichen Elements beobachtet.
Hier bieten wir detaillierte Schritte für die Radioisotopenmessung von unidirektionalen und net Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffen in intakten Pflanzen. Der Schwerpunkt wird auf die Flussmessung von Kalium (K +), einer Pflanze macronutrient 5 und Ammonium / Ammoniak hergestellt werden (NH 3 / NH 4 +), ein anderes Makronährstoffe, die, wenn sie bei hohen Konzentrationen (beispielsweise vorhanden ist, jedoch giftig, 1- 10 mM) 2. Wir werden die Radioisotope 42 K + (t 1/2 = 12,36 h) und 13 NH 13.03 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), jeweils in intakten Keimlingen der Modellsystem Gerste (Hordeum vulgare L verwenden .), in der Beschreibung der beiden wichtigsten Protokolle: direkte Zustrom (DI) und Kompartment-Analyse durch Tracer-Efflux (CATE). Wir sollten von Anfang an, die in diesem Artikel beschrieben einfach die erforderlich sind, um jedes Protokoll führen Sie die Schritte beachten. Gegebenenfalls werden kurze Erklärungen zu den Berechnungen und Theorie zur Verfügung gestellt, aber detaillierte Darstellungen der einzelnen Verfahren'S Hintergrund und Theorie kann in mehreren wichtigen Artikel über das Thema 4,6-9 gefunden werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle allgemein übertragbar Analyse anderer Nährstoffe / Giftstoffe Strom (zB 24 Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) und anderen Pflanzenspezies, wenn auch mit einigen Einschränkungen (siehe unten) . Wir betonen auch die Bedeutung, dass alle Forscher, die mit radioaktiven Stoffen muss unter einer Lizenz durch ionisierende Strahlung Sicherheitsregler ihrer Institution angeordnet zu arbeiten.
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Protocol
1. Pflanzen Kultur und Vorbereitung
- Wachsen Gerstenkeimlingen hydroponically für 7 Tage in einem klimatisierten Wachstumskammer (Details siehe 10).
HINWEIS: Es ist wichtig zu prüfen, in Pflanzen bei einer Vielzahl von Entwicklungsstufen, wie Nährstoffbedarf wird mit dem Alter ändern. - Ein Tag vor dem Experiment, bündeln mehrere Sämlinge zusammen, um ein einzelnes Replikat (3 Pflanzen pro Bündel für DI, 6 Pflanzen pro Bündel für CATE) zu machen. Bundle Sämlinge, indem ein 2-cm-Stück Tygon-Schlauch um den basalen Teil der Triebe, und die Sicherung der Schlauch mit Klebeband, um einen "Kragen" zu schaffen.
HINWEIS: Die Anzahl der Pflanzen pro Bündel kann von den experimentellen Bedingungen 10,13,14 variieren. Bündelung wird getan, um Statistiken und Messgenauigkeit zu verbessern, vor allem, wenn Wurzelmasse und / oder spezifische Aktivität sind gering.
2. Vorbereitung für Experimentelle Lösungen / Materialien
Inhalt "> Hinweis: der folgende wird in der Regel vor dem Experiment 1 durchgeführt Tag.- Für DI, sammeln die folgenden: Pre-Kennzeichnung, Etikettierung, und Desorption Lösungen (für Details siehe 11), Zentrifugenröhrchen (zum Trockenschleudern von Pflanzenproben) und Probenfläschchen (für Pflanzenmaterial und die spezifische Aktivität [S o; siehe unten]). Belüften und mischen alle Lösungen.
- Cate, sammeln die folgenden: gut gemischten, Porenbeton Kennzeichnung und Elution Lösungen (für Details siehe 10), Auslauftrichter, Zentrifugenröhrchen (zum Trockenschleudern von Pflanzenproben) und Probenfläschchen (für Eluate, Pflanzenproben und Bestimmung von S o und Verdünnungsfaktor [D f, siehe unten]).
3. Bereiten Radiotracer
ACHTUNG: Die folgenden Sicherheits Schritte sollten vor der Arbeit mit Radioaktivität eingenommen werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Anforderungen der radiotive Materialien Lizenz verstanden und befolgt werden. Richtige Sicherheitsausrüstung (dh, Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, Blei Weste / Kragen) und Dosimeter (zB TLD-Ring und Abzeichen) zu tragen. Bis Abschirmung gesetzt (dh, Plexiglas und Bleiziegel) und führen radioaktiven Arbeit dahinter. Stellen Sie sicher, dass ein Geiger-Müller-Zähler, um routinemäßig für die Kontaminationsmonitor vorhanden ist.
- Herstellung von 42 K +
- Legen Sie ein sauberes, trockenes Becherglas auf die Waage. Null das Gleichgewicht.
- Entfernen Fläschchen Tracer (20 mCi 42 K 2 CO 3, in Pulverform) aus der Verpackung und gießen Tracer in den Becher. Beachten Sie die Masse.
- Pipette 19.93 ml dH 2 O, gefolgt von 0,07 ml H 2 SO 4, in das Becherglas. Dies wird die folgende chemische Reaktion zu fahren:
42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - Berechnen der Konzentration des radioaktiven Stammlösung angesichts der Masse und einem Molekulargewicht von K 2 CO 3, und das Volumen (20 ml).
HINWEIS: Wenn Sie mit 13 NH 13.03 NH 4 + Der Tracer wird in einem Zyklotron über die Protonenbeschuss von dem Sauerstoffatom des Wassers erzeugt (was in der Regel 100-200 mCi Aktivität; Produktions Details siehe 12). Da die Menge der 14 NH 14.03 NH 4 + ist extrem niedrig in diesen Lösungen ist die N-Konzentration der Stammlösung zu vernachlässigen.
4. Direkte Influx (DI) Mess
- Für 42 K +, Pipette die Menge der radioaktiven Stammlösung erforderlich, um die gewünschte endgültige Konzentration von K + in die Etikettierungslösung zu erreichen.
- 13 NH 13.03 NH 4 +, Pipette eine kleine Menge (<0,5 ml) in die Markierungslösung. Lassen Sie die Markierungslösung gründlich mischen (über Belüftung).
- Pipettieren 1 ml Teilstichprobe von Kennzeichnungslösung in ein Probengefäß und wiederholen dreimal (4 Proben insgesamt).
- Messen Radioaktivität in Fläschchen (in "counts per minute", cpm), mit einem Gamma-Zähler. Sicherzustellen, daß der Zähler derart programmiert ist, dass cpm Ablesungen für die Isotopen Zerfall korrigiert (dies ist besonders wichtig für solche kurzlebige Tracer).
- Berechnen S o (als cpm ausgedrückt mmol -1) durch Mitteln der Zählungen der vier Proben (cpm ml -1) und dividiert durch die Konzentration des Substrats in Lösung (mmol ml -1).
- Tauchen Wurzeln in vor-Kennzeichnung (nicht-radioaktive)-Lösung für 5 min vor, ins Gleichgewicht Pflanzen unter Testbedingungen (siehezB 10,13,14 für Variationen in der Vor-Label-Zeit).
- Tauchen Wurzeln in der Kennzeichnung (radioaktiv)-Lösung für 5 min.
HINWEIS: Labeling Zeiten können auf Experiment 3,4,7-10 variieren. - Übertragen Wurzeln Desorptionslösung 5 Sekunden, um den Großteil der Oberfläche haftende Radioaktivität zu entfernen. Übertragen Wurzeln in einem zweiten Becherglas der Desorption Lösung für 5 min auf weitere deutliche Wurzeln der extrazellulären Tracer.
- Sezieren und separater Sprossen, basale Triebe und Wurzeln.
- Zeigen Wurzeln in Zentrifugenröhrchen und Spin Proben für 30 Sekunden in einem Low-Speed-, klinische-Grade-Zentrifuge (~ 5.000 xg), um Oberfläche und Porenwasser zu entfernen.
- Wiegen Wurzeln (Frischgewicht, FW).
- Graf Radioaktivität in Pflanzenproben (shoot, basal-Shooting, und die Wurzel, siehe Schritt 4.2.1).
- Berechnen Sie den Fluss. Berechnen Zustrom in die Anlage mit Hilfe der Formel
Φ = Q * / S o Gew L
wobei Φ die Fluss(Mmol g -1 h -1), Q * die Menge des Tracers im Gewebe angesammelt (cpm, in der Regel in Wurzel, schießen, schießen und basalen, kombiniert), die spezifische Aktivität des Markierungslösung (cpm mmol S o - 1) ist, W die Wurzel-Frischgewicht (g) und t L die Kennzeichnung Zeit (hr).
HINWEIS: Weitere anspruchsvolle Berechnung kann gemacht werden, um für die gleichzeitige Tracer Efflux aus Wurzeln beim Etikettieren und Desorption ausmachen, basierend auf von CATE erhaltenen Parameter (siehe unten; Details siehe 4).
5. Compartmental Analyse von Tracer Efflux (CATE) Mess
- Bereiten Etikettierungslösung und Maßnahme S o (siehe Schritte 4,1-4,2, oben).
- Messen Verdünnungsfaktor (D f).
HINWEIS: Häufig kann die Position der Probe relativ zu dem Detektor im Gamma-Zähler die Menge beeinflussender Strahlung gemessen. Siehe Diskussion für Details.- Nach Messung S o, fügen 19 ml H 2 O zu jeder Probe (wie das Endvolumen = Eluat Volumen = 20 ml). Graf Radioaktivität in jeder 20-ml-Probe (siehe Schritt 4.2.1).
- Berechnen D f durch Division der durchschnittlichen cpm der 1-ml-Proben durch den Mittelwert cpm der 20-ml-Proben.
- Tauchen Wurzeln in Etikettierungslösung für 1 Stunde.
- Entfernen Sie Pflanzen aus Etikettierungslösung und Übertragungsanlagen zu Trichter Auslauf, muss, im Trichter alle Wurzelmaterial ist. Sanft sicheren Pflanzen seitlich Auslauftrichter durch Anlegen einer kleinen Bandstreifen über die Kunststoffkragen.
- Gießen Sie vorsichtig das erste Eluat in den Trichter. Timer starten (Hochzählen).
- Öffnen Sie die Zapfen zu sammeln und das Eluat in das Probengefäß nach 15 sec (Hinweis: Elutionszeit variieren, siehe unten). Schließen Sie den Hahn. Gießen Sie vorsichtig die nächste Eluat in den Trichter.
- Repeat Schritt 5.6 für den Rest der Elution Serie, die folgt von der ersten zu der letzten Eluat: 15 sec (vier Mal), 20 s (dreimal), 30 s (zweimal), 40 s (einmal), 50 sec (einmal), 1 min (25-mal), für eine Gesamtdauer von 29,5 Elution min
HINWEIS: Desorption Serie kann von den experimentellen Bedingungen 7-10,13,14 variieren. - Sobald Elutionsprotokoll abgeschlossen ist, Ernte Pflanzen (Schritte von 4,6 bis 4,8, oben).
- Graf Radioaktivität in Eluaten und Pflanzenproben in der Gamma-Zähler (Multiplikation der Lektüre für jeden Eluat durch D f, siehe 5.2).
- Grundstück Tracer Release (cpm g (root FW) -1 min -1) als Funktion der Elutionszeit. Für stationären Bedingungen, führen lineare Regressionen und Berechnungen von Flussmitteln, Halbwertszeiten von Austausch und Poolgrößen (Details siehe 6-9).
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Representative Results
Figur 1 zeigt Isothermen gefunden unter Verwendung der DI-Technik (13 N) für den Zustrom von NH 3 in die Wurzeln von intakten Gerstenkeimlingen bei hohen gezüchtet (10 mM), NH 4 +, und entweder niedrig (0,02 mm) oder hoch (5 mM ) K +. Die Isothermen angezeigt Michaelis-Menten-Kinetik bei der NH 3 Flüsse in Abhängigkeit von der externen NH 3-Konzentration ([NH 3] ext, durch Änderungen in der Lösung auf pH 13 eingestellt) aufgetragen. NH 3 Flüsse waren bei niedrigen K + deutlich höher als bei hohen K +. Analyse der Michaelis-Menten-Parameter zeigte, daß das K M blieb zwischen K + Ebenen (150 vs 90 μ M bei niedrigen und hohen K +, jeweils) relativ stabil ist, während V max ist stark bei hohen K + (205 vs reduzierten 80 mmol g -1 h -1). So zeigen die Daten, dass K + Ebene RegulatES Stickstofftransport (V max-Effekt), aber nicht durch direkte Wettbewerb zwischen K + und NH 3 um Bindungsstellen von Transportern (K M-Effekt). Vielmehr kann K + NH 3 Flüsse regulieren durch andere Mittel, wie beispielsweise durch Modulation der Aquaporin-Aktivität (für Details siehe 13).
DI ist auch nützlich für die Erfassung der relativ schnellen Änderungen Zustrom durch Ernährungs Verschiebungen oder auf die Anwendung von pharmakologischen Mitteln. Zum Beispiel, Abbildung 2 Highlights der schnelle Plastizität des K + -Aufnahme System in den Wurzeln von intakten Gerstenkeimlingen zu moderaten (0,1 mm)-K + und hoch (10 mM) gewachsen NH 4 + Bedingungen. Hier ein ~ 350% ige Erhöhung der K + Zustrom beobachteten wir innerhalb von 5 min von NH 4 + Rückzug aus der externen Lösung. Diese "Ammoniumentzugseffekt" ("AWE") wurde festgestellt, empfindlich auf die K + sein +), Barium (Ba 2 +) und Cäsium (Cs +). Mit DI und elektrophysiologischen Messungen in mehreren Arabidopsis-Genotypen, waren wir in der Lage, abschließend schreiben die überwiegende Mehrheit der AWE, um Änderungen an den Aktivitäten der Arabidopsis K +-Kanal, AtAKT1 und mit hoher Affinität K +-Transporter, AtHAK5 14.
Figur 3 Diagramme der stationäre Efflux von 42 K + im Laufe der Zeit aus den Wurzeln von voretikettierten Gerstenkeimlingen bei niedriger (0,1 mm) K + und Mittel (1 mM) gezüchtet NO 3 -. Diese Spuren zeigen, wie die CATE Methode kann schnelle und wesentliche Änderungen in Efflux bei Anwendung von verschiedenen pharmakologischen / Nahrungsmittel enthüllen. Erhebliche, sofortige Hemmung der K +-Efflux wurde entweder auf einer Anwendung von 10 mM Cs +, K +-Kanal-Blocker oder einem starken Anstieg zu beobachtenin K + Versorgung (0,1 bis 10 mm). Diese Ergebnisse sind konsistent mit molekularen Studien beschreiben die einzigartigen Eigenschaften von außen Gating-Gleichrichter K +-Kanäle 15. Dagegen Anwendung von 10 mM NH 4 + schnell und stark angeregt K +-Efflux. Dieser Effekt kann durch die Aktivierung des passiven Gleichrichter K +-Kanäle über Depolarisation des elektrischen Potentialgefälles über die Plasmamembran von Wurzelzellen 16, die bekannt ist, um bei Einführung von NH 4 + 17 auftreten erläutert. So mit dieser Methode haben wir in der Lage, zu zeigen, in der Pflanze, dass K + Kanäle vermitteln K +-Efflux in den Wurzeln von Gerste 10.
Schließlich Tabelle 1 zeigt CATE Parameter aus Messungen der Steady-State-42 K +-Efflux ([K +] ext = 0,1 mm) in der Gerste Samen extrahiertlings gewachsen entweder mit 1 mM NO 3 - oder 10 mM NH 4 +, wobei letzteres eine toxische Szenario. Die hohe NH 4 + Zustand führt zu einer Unterdrückung aller K + Flussmittel, und einem deutlichen Rückgang der zytosolischen K +-Konzentration ([K +] cyt), die in der Regel homöostatisch bei ~ 100 mm unter gesunden Wachstumsbedingungen 18 gehalten (wie beobachtet , zB in Tabelle 1 unter NO 3 - Versorgung).
Abbildung 1. 13 NH 3 Zustrom Isothermen zeigen, wie K + Versorgung regelt Stickstofftransport. NH 3 Zustrom als Funktion der unterschiedlichen äußeren Konzentrationen von NH
Abbildung 2. NH 4 + Rückzug signifikant stimuliert Kanal-vermittelten K + Zustrom. K + Einstrom in einem stabilen Zustand, und beim Zurückziehen des NH 4 +, in den Wurzeln von intakten Gerstenkeimlingen bei niedrigen (0,1 mm) und K + Hoch gewachsen (10 mM) NH 4 + ist. Die Wirkung von K +-Kanal-Blocker (10 mM TEA +, 5 mM Ba 2 + und 10 mM Cs +) auf der stimulierten K + Einstrom ausgeprägt. Sterne weisen verschiedene Bedeutungsebenen zwischen NH 4 + und Behandlung Paare (* 0,01 <P <0,05, *** p <0,001; one-way ANOVA mit Dunnett-Mehrfachvergleichs Post-hoc-Test). Sternchen in Klammern bezeichnen das Signifikanzniveau zwischen Kontrolle und NH 4 +-Paar (Student-t-test). Fehlerbalken zeigen SEM von> 4 Wiederholungen. (Von Coskun et al. Kapazität und Plastizität von Kaliumkanälen und hochaffinen Transporter in den Wurzeln von Gerste und Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013) wiedergegeben.)
Abbildung 3. K + Auslaufkanal ist vermittelte unter niedrigem K + Bedingungen Steady-State-42 K +-Efflux in den Wurzeln von intakten Gerstenkeimlingen bei niedrigen (0,1 mm) und K + moderat (1 mM) gewachsen NO 3 -., Und die unmittelbaren Auswirkungen (bei t = 15,5 min, siehe Pfeil) von 10 mM CsCl, 5 mM K 2 SO4, und 5 mM (NH 4) 2 SO 4 auf Efflux. Jedes Diagramm stellt den Mittelwert von 3-13 Wiederholungen (SEM <15% des Mittelwerts). (Wiedergabe von Coskun et al Verordnung und der Mechanismus der Kalium-Freisetzung aus Gerstenwurzeln.:. Eine in planta 42 K + Analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010).).
| [K +] ext | N-Quelle | Zustrom | Auslauf | Nettofluss | E: i-Verhältnis | Pool-Größe | Halbwertszeit |
| (MM) | (Mmol g -1 h -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0,1 | 1 NO 3 - | 7,22 ± 0,23 | 1,86 ± 0,18 | 5,36 ± 0,18 | 0,25 ± 0,02 | 98,84 ± 14,08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1,89 ± 0,13 | 0,57 ± 0,05 | 1,32 ± 0,10 | 0,30 ± 0,01 | 28.39 ± 3.40 | 32,50 ± 4,69 | |
Tabelle 1. Steady-State-K + Flussmittel und compartmentation unter verschiedenen N Bestimmungen Steady-State-Flussmittel und Kompartment-Analyse von Gerstenkeimlingen bei 0,1 mM K + gewachsen und entweder moderate NO 3 -. (1 mM, wie Ca 2 +-Salz) oder hohe NH 4 + (10 mM, als SO 4 2 Salz). Fehler zeigen ± SEM von> 8 Wiederholungen. (Wiedergabe von Coskun et al Verordnung und der Mechanismus der Kalium-Freisetzung aus Gerstenwurzeln.:. Eine in planta 42 K + Analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010) und Coskun et al Kapazität und Plastizität von Kaliumkanälen und Hoch.. Affinität Transporter in den Wurzeln von Gerste und Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
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Discussion
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, ist der Radiotracer-Methode ein mächtiges Mittel zur Messung der unidirektionalen Flüsse der Nährstoffe und Giftstoffe in der Pflanze. Abbildung 1 zeigt, dass NH 3 Zustrom in über 225 mmol g -1 h -1, das ist vielleicht das ist zu erreichen höchste bona fide Transmembranfluss je in einem Anlagensystem 13 berichtet, aber das Ausmaß dieser Fluss nicht sichtbar sein, wenn nur die Nettoflüsse gemessen wurden. Dies ist, weil eine große Efflux von NH 3 erfolgt gleichzeitig als Zustrom in einem vergeblichen Radfahren Szenario, das in einer ausgeprägten Unterschätzung der Einstrom, die mit Markierungszeit 13 erhöht führen kann. Hinzutracertechnik mit elektrophysiologischen Analyse waren wir in der Lage, daß unter den Bedingungen von Figur 1 zeigen, ist sowohl Einstrom und Ausstrom von 13 N in erster Linie aus dem Neutralgas NH 3, und nicht der conjugaß Säure NH 4 + (Details siehe 13). Dies ist die erste in der Pflanze Demonstration der schnellen NH 3 Gasflüsse in den Wurzeln, und als solche, liefert wichtige erste Hinweise in Richtung der Entschlüsselung der Transportmechanismus, die im Herzen von NH 3 / NH 4 +-Toxizität in höheren Pflanzen 2,13 liegt. Molekulararbeit in heterologen Expressionssystemen wurde gezeigt, dass die NH 3 über aquaporins in Anlagen 19 und die Daten von Figur 1 fließt, zusammen mit den letzten pharmakologische Beweise hat begonnen, diese Feststellungen auf der Ebene des intakten Organismus 13 bestätigen.
Figuren 2 und 3 stellen auch hervorragende Beispiele für die Nützlichkeit der Messung der unidirektionalen Flüsse mit Radiotracer. Mit DI mit 42 K +, waren wir in der Lage, diese Ionenkanäle sind nicht für Steady-State-K verantwortlich zeigen + + NH 4 + angebaut, im Gegensatz zu dem Modellsystem Arabidopsis 14. Nur wenn NH 4 + zurückgezogen sahen wir Beweise für den Eingriff der K +-Kanäle (2). Obwohl der Nettofluss von K + wird durch NH 4 + Entzugs stimuliert (wie durch erhöhte Gewebe K +-Gehalt 14 gezeigt), nur durch die Messung unidirektionalen Zustrom konnten wir zeigen, die Größe und schnelles Einsetzen dieses Phänomens. Darüber hinaus kann durch die Durchführung DI Messungen mit Mutanten und pharmakologischen Mitteln waren wir in der Lage zu erkennen, welche Transportproteine beteiligt waren. Ebenso durch die Anwendung Ernährungs-und pharmakologische Wirkstoffe während der Überwachung Tracer Auslauf (Abbildung 3), waren wir in der Lage, zu charakterisieren und zu identifizieren Mechanismen der K +-Efflux aus Gerste Wurzelzellen 10. Somit Techniken wie Diund Cate kann instrumental für das Verständnis der Transporteigenschaften für eine kritische Makronährstoff sein.
Wie in dem Protokoll angegeben, oft die Position der Probe relativ zu dem Detektor im Gamma-Zähler die Menge der Strahlung gemessen beeinflussen. Wenn also ein 1-ml-Probe wird mit 19 ml H 2 O "aufgefüllt" werden die Zählungen in der 20-ml-Probe gemessen (cpm) deutlich niedriger als in der 1-ml-Probe sein, obwohl sie die gleiche Menge der Radiotracer. Daher kann ein D F aufgebracht werden, um für diese scheinbare "Verdünnung" der Radioaktivität zu korrigieren. Dieses Problem wird oft nicht explizit von den Herstellern der Erkennung Instrumentierung angegeben und müssen vom einzelnen Forscher gearbeitet werden. Ebenso kann die Wirksamkeit der Abschirmung innerhalb Detektoren gegen Umgebungsstrahlung (dh von der Nähe Proben im Zähler) von den Herstellern übertrieben werden, und diese Fragen bearbeitet werdenaus einzelnen Messsystemen.
Ein großer Vorteil des Tracertechnik ist seine Nicht-Invasivität, das ein Mittel, um Flüsse, intrazelluläre Pool Größen und Wechselkurse zu messen bietet, unter stationären Bedingungen. Beispielsweise mit Cate wir nicht-invasiv zu quantifizieren zytosolischen Konzentrationen von K + (Tabelle 1). Dies kann vorzuziehen, alternative Methoden wie impalement von Zellen mit ionenselektive Mikroelektroden 18, die physikalischen und ggf. chemischen Störungen der Zelle vermittelt werden. Darüber hinaus ist der Tracer-Technik, dass es bietet einen umfassenden Überblick über Flüsse und Kompartimentierung für ganze Organe und ganze Pflanzen einzigartig. Dies ist wichtig, wenn man sich für das Verständnis Ganzpflanzennährstoffdynamik, Toxizität ist, und schließlich, Leistung auf dem Feld. Schließlich ermöglicht Radiotracer Methoden für sehr empfindliche Messungen unter ziemlich hohen Substratkonzentrationen durchgeführt werden. Traditionale Erschöpfung Experimente und Mikroelektroden-Techniken können Fragen von Hintergrundstörungen zu erleben und somit kann verlangen, dass die externe Konzentration des Substrats von Interesse ist deutlich unter dem während des Wachstums vorgesehen gesenkt. Dies könnte problematisch, wenn man sich für ein Studium "steady-state" Bedingungen der hohen Substratkonzentrationen ist (wie mit NH 3 / NH 4 + Toxizität oder "High-K +" Bedingungen, siehe oben).
Es sei darauf hingewiesen, dass, wie bei allen Techniken, Messflüsse mit Radiotracer ist nicht ohne Einschränkungen. Zum Beispiel kann die Verfügbarkeit von Radiotracern problematisch sein, besonders bei sehr kurzlebigen Isotopen, wie 13 N, die Nähe zu einer Produktionsanlage erforderlich, wie einem Zyklotron. Eine weitere große Einschränkung ist, dass zu Zeiten, kann es schwierig sein, zwischen Flüsse, die durch Membranen auftreten, und jenen zu unterscheiden auftretenden extracellularly. Solche Unterscheidungen fordern strenge Phase testen 7,10,20. Im Fall von K +-Efflux, nur nach sorgfältiger Prüfung konnten wir diese stationären bestätigen 42 K +-Freisetzung aus Wurzeln auftrat nicht durch die Zellmembranen bei hohen [K +] ext (> 1 mM) 10, sondern aus extrazellulären Räume (CF 3). Solche Probleme können durch die Untersuchung der Wirkung einer Vielzahl von pharmakologischen Mitteln gelöst werden, oder durch thermodynamische Untersuchungen, die gezeigt haben, dass beispielsweise eine sehr hohe Na + Flüsse unter Salzbedingungen angegeben wäre energetisch undurchführbar wurden sie über Zellmembranen fortzufahren 21,22.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
