Introduction
La absorción y distribución de los nutrientes y las sustancias tóxicas influyen fuertemente en el crecimiento vegetal. En consecuencia, la investigación de los procesos de transporte subyacentes constituye un área importante de la investigación en biología de las plantas y de las ciencias agrícolas 1,2, especialmente en el contexto de la optimización nutricional y el estrés ambiental (por ejemplo, estrés por salinidad, toxicidad de amonio). El principal de los métodos para la medición de los flujos en las plantas es el uso de trazadores radioisotópicos, que fue desarrollado significativamente en los años 1950 (véase, por ejemplo, 3) y sigue siendo ampliamente utilizado hoy. Otros métodos, como la medición de agotamiento de los nutrientes del medio de la raíz y / o la acumulación en los tejidos, el uso de microelectrodos vibrantes ion-selectivos tales como MIFE (microelectrodos ión estimación de flujo) y SIET (escanear técnica electrodo selectivo de iones), y el uso de colorantes fluorescentes selectivos de iones, también se aplican ampliamente, pero están limitados en su capacidad para detectar la gripe netaxes (es decir, la diferencia entre la afluencia y de flujo de salida). El uso de radioisótopos, por otro lado, permite al investigador la capacidad única de aislar y cuantificar los flujos unidireccionales, que se puede utilizar para resolver los parámetros cinéticos (por ejemplo, K M y V max), y proporcionar una idea de la capacidad, energética, mecanismos y regulación, de los sistemas de transporte. Las mediciones de flujo unidireccionales hechas con radiotrazadores son particularmente útiles en condiciones donde el flujo en la dirección opuesta es alta, y el volumen de piscinas intracelular es rápida 4. Por otra parte, los métodos de radiotrazadores permiten mediciones que se llevan a cabo bajo concentraciones bastante altas de sustrato, a diferencia de muchas otras técnicas (ver "Discusión", más abajo), ya que el isótopo trazado se observa contra un fondo de otro isótopo del mismo elemento.
Aquí, ofrecemos los pasos detallados para la medición radioisotópica de unidireccional y net flujos de nutrientes minerales y las sustancias tóxicas en plantas intactas. Se hará énfasis en la medición de flujo de potasio (K +), un macronutriente planta 5, y amoniaco / amonio (NH 3 / NH 4 +), otro de macronutrientes que es, sin embargo, tóxico cuando está presente en altas concentraciones (por ejemplo, de 1 10 mM) 2. Usaremos los radioisótopos 42 K + (t 1/2 = 12.36 h) y 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivamente, en las plántulas intactas de la cebada sistema modelo (Hordeum vulgare L .), en la descripción de los dos protocolos clave: afluencia directa (DI) y el análisis compartimental por flujo de salida de trazador (CATE). Debemos tener en cuenta desde el principio que este artículo sólo se describen los pasos necesarios para llevar a cabo cada protocolo. En su caso, se proporcionan breves explicaciones de los cálculos y la teoría, pero detalladas exposiciones de cada técnica'S fondo y la teoría se pueden encontrar en varios artículos sobre el tema clave 4,6-9. Es importante destacar que estos protocolos son ampliamente transferibles al flujo análisis de otros nutrientes / sustancias tóxicas (por ejemplo, 24 Na +, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) y para otras especies de plantas, aunque con algunas salvedades (véase más adelante) . También hacemos hincapié en la importancia de que todos los investigadores que trabajan con materiales radiactivos deben trabajar bajo una licencia organizado a través ionizante regulador de la seguridad radiológica de su institución.
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Protocol
1. Planta cultura y Preparación
- Crezca las plantas de semillero de cebada hidropónico durante 7 días en una cámara de crecimiento con temperatura controlada (para más detalles, véase 10).
NOTA: Es importante tener en cuenta el examen de plantas en diversas etapas de desarrollo, como las necesidades de nutrientes van a cambiar con la edad. - Un día antes de la experimentación, agrupar varias plantas juntas para hacer una sola réplica (3 plantas por paquete para DI, 6 plantas por paquete para CATE). Plántulas Bundle por envolver un trozo de 2 cm de tubo Tygon alrededor de la parte basal de los brotes, y asegurar el tubo con cinta adhesiva para crear un "collar".
NOTA: El número de plantas por paquete puede variar según las condiciones experimentales 10,13,14. La agrupación se realiza para mejorar las estadísticas y la precisión de la medición, sobre todo cuando la masa de raíces y / o actividad específica son bajos.
2 Preparación de Soluciones Experimental / Materiales
contenido "> NOTA: La siguiente se realiza típicamente 1 día antes de la experimentación.- Por DI, reunir los siguientes: Pre-etiquetado, etiquetado y soluciones de desorción (para más detalles, véase 11), tubos de centrifugación (por centrifugado de las muestras de las plantas), y los viales de muestra (por material vegetal y la actividad específica [S o; vea abajo]). Airear y mezclar todas las soluciones.
- Para CATE, reunir los siguientes: soluciones, etiquetado aireado bien mezclado y elución (para más detalles, véase 10), embudos, tubos de centrifugación de flujo de salida (por centrifugado de las muestras de plantas), y los viales de muestra (por eluidos, muestras de plantas, y determinación de S O y factor de dilución [D f, véase más adelante]).
3. Preparar radiotrazadores
ATENCIÓN: Las siguientes medidas de seguridad se deben tomar antes de trabajar con la radiactividad.
- Asegúrese de que los requisitos de la radioactiva licencia materiales se entienden y lo siguió. Utilice el equipo de seguridad adecuado (es decir, gafas, guantes, bata de laboratorio, plomo chaleco / cuello) y dosímetros (por ejemplo, un anillo de TLD y placa). Configure blindaje (es decir, plexiglás y ladrillos de plomo) y realizar el trabajo radiactiva detrás de él. Asegúrese de que un contador Geiger-Müller está presente con el fin de monitorear rutinariamente para la contaminación.
- Preparación de 42 K +
- Coloque un vaso de precipitados limpio y seco en el equilibrio. Cero la balanza.
- Eliminar vial de trazador (20 mCi de 42 K 2 CO 3, en forma de polvo) de los envases y verter trazador en el vaso de precipitados. Tome nota de la masa.
- Pipeta 19,93 ml de dH 2 O, seguido de 0,07 ml de H 2 SO 4, en el vaso de precipitados. Esto conducirá a la siguiente reacción química:
42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H2O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - Calcular la concentración de la solución madre radiactivo, dada la masa y el peso molecular de K 2 CO 3, y el volumen (20 ml).
NOTA: Si se trabaja con 13 NH 3/13 NH 4 + El marcador se produjo en un ciclotrón mediante el bombardeo de protones del átomo de oxígeno del agua (por lo general resulta en la actividad 100-200 mCi; para los detalles de producción, ver 12). Debido a que la cantidad de NH 14 3/14 NH 4 + es extremadamente baja en estas soluciones, la concentración de N de la solución madre es insignificante.
4. afluencia directa (DI) Medición
- Para 42 K +, pipetear la cantidad de solución de stock radiactivo requerida para alcanzar la concentración final deseada de K + en la solución de etiquetado.
- Para NH 13 3/13 NH 4 +, pipeta una pequeña cantidad (<0,5 ml) en la solución de etiquetado. Deje que la solución de etiquetado para mezclar bien (a través de la aireación).
- Pipetear una sub-muestra de 1 ml de solución de etiquetado en un vial de la muestra y repetir tres veces (4 muestras en total).
- Medir la radiactividad en viales (en "cuentas por minuto, cpm)", usando un contador gamma. Asegúrese de que el contador está programado de tal modo que las lecturas de CPM se corrigieron para la desintegración isotópica (esto es particularmente importante para tales trazadores de corta duración).
- Calcular S o (expresada como cpm -1 mol) por el promedio de los recuentos de las cuatro muestras (cpm ml -1) y dividiendo por la concentración de sustrato en solución (mol ml -1).
- Sumergir raíces en solución de pre-etiquetado (no radiactivo) durante 5 min, para pre-equilibrar las plantas bajo condiciones de prueba (véasepor ejemplo, 10,13,14 para variaciones en el tiempo de pre-label).
- Sumergir las raíces en el etiquetado de solución (radiactivo) durante 5 min.
NOTA: Los tiempos de etiquetado pueden variar en función del experimento 3,4,7-10. - Transferencia raíces a la solución de desorción durante 5 segundos para eliminar la mayor parte de la radiactividad-adhesión superficie. Transferencia raíces en un segundo vaso de precipitados de la solución de desorción durante 5 min a las raíces más claras de trazador extracelular.
- Diseccionar y brotes separados, brotes basales y raíces.
- Coloque raíces en tubos de centrifugación y las muestras de centrifugado durante 30 segundos en una baja velocidad, centrífuga clínica-grado (~ 5.000 xg) para eliminar de la superficie y el agua intersticial.
- Pesar raíces (peso fresco, FW).
- Contar la radiactividad en muestras vegetales (brotes, brotes basales, y la raíz; vea el paso 4.2.1).
- Calcular el flujo. Calcular afluencia en la planta usando la fórmula
Φ = Q * / S o en peso de L
donde Φ es el flujo(Mol -1 h -1 g), Q * es la cantidad de trazador acumulada en el tejido (cpm, por lo general en la raíz, disparar y disparar basal, combinado), S o es la actividad específica de la solución de etiquetado (mol cpm - 1), w es el peso fresco de la raíz (g), y L t es el tiempo de etiquetado (hr).
NOTA: cálculo más sofisticado se puede hacer para dar cuenta de flujo de salida de trazador simultánea de las raíces durante el etiquetado y desorción, en base a los parámetros obtenidos de CATE (véase más adelante; para más detalles, ver 4).
5. compartimental Análisis Tracer Eflujo (CATE) Medición
- Prepare la solución de etiquetado y medida S o (consulte los pasos 4.1 a 4.2, más arriba).
- Mida factor de dilución (D f).
NOTA: A menudo, la posición de la muestra en relación con el detector en el contador gamma puede influir en la cantidadde radiación medida. Véase la discusión para más detalles.- Después de medir o S, añadir 19 ml de H 2 O a cada muestra (de manera que el volumen final = volumen eluido = 20 ml). Conteo de radiactividad en cada muestra de 20 ml (ver paso 4.2.1).
- Calcular D f dividiendo el cpm promedio de las muestras de 1 ml por la cpm media de las muestras de 20 ml.
- Sumerja sus raíces en la solución de etiquetado durante 1 hora.
- Retire las plantas de las plantas de soluciones de etiquetado y de transferencia efluir embudo, asegurando todo el material de la raíz está dentro del embudo. Gently plantas seguras al lado del embudo de flujo de salida mediante la aplicación de una pequeña tira de cinta adhesiva sobre el anillo de plástico.
- Vierta suavemente el primer eluato en el embudo. Iniciar temporizador (contando).
- Abra el grifo y recoger el eluido en el vial de la muestra después de 15 segundos (nota: tiempo de elución variará, véase más adelante). Cierre el grifo. Vierta suavemente la próxima eluato en el embudo.
- REPEAt paso 5.6 para el resto de la serie de elución, que sigue, desde el primero al eluato final: 15 seg (cuatro veces), 20 seg (tres veces), 30 seg (dos veces), 40 seg (una vez), 50 sec (una vez), 1 min (25 veces), durante un período de elución total de 29,5 min
NOTA: Serie de desorción puede variar según las condiciones experimentales 7-10,13,14. - Una vez que el protocolo de elución es completa, las plantas de cosecha (pasos 4.6 a 4.8, más arriba).
- Contar la radiactividad en los eluidos y muestras de plantas en el contador gamma (multiplicando la lectura para cada eluato por D f, ver 5.2).
- Parcela liberación trazador (cpm g (FW raíz) -1 min -1) como una función de tiempo de elución. Para condiciones de estado estacionario, realizar regresiones lineales y los cálculos de los flujos, la vida media de intercambio y tamaños de piscina (para más detalles, consulte 6-9).
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Representative Results
La Figura 1 muestra isotermas encontrados utilizando la técnica de DI (con 13 N), para la afluencia de NH 3 en las raíces de las plántulas de cebada cultivadas intactas a alta (10 mM) NH 4 +, y, o bien bajo (0,02 mM) o alta (5 mM ) K +. Las isotermas muestran la cinética de Michaelis-Menten cuando los flujos de NH 3 se representan gráficamente como una función de la concentración externa NH 3 ([NH 3] ext; ajustado por cambios en solución pH 13). NH 3 flujos fueron significativamente más altas a bajas K + que con una gran K +. Análisis de los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten mostró que el K M se mantuvo relativamente estable entre los niveles de K + (150 vs 90 μ M a baja y alta K +, respectivamente), mientras que V max se reduce considerablemente a alta K + (205 vs 80 mmol g -1 h -1). Por lo tanto, los datos indican que regulat nivel de K +es el transporte de nitrógeno (efecto máximo V), pero no por la competencia directa entre K + y NH 3 para los sitios de unión de transportistas (efecto K M). Más bien, K + puede regular NH 3 flujos por otros medios, como a través de la modulación de la actividad de las acuaporinas (para más detalles, véase el punto 13).
DI también es útil para la captura de cambios relativamente rápidos en afluencia debido a los cambios nutricionales, o para la aplicación de agentes farmacológicos. Por ejemplo, la Figura 2 destaca el rápido plasticidad del sistema K + -absorción en las raíces de las plántulas de cebada intactas crecido a moderada (0,1 mM) K + y alta (10 mM) -NH 4 + condiciones. Aquí, se observó un aumento de ~ 350% en K + afluencia dentro de 5 min de NH 4 + retirada de la solución externa. Este "efecto de amonio retirada" ("AWE") resultó ser sensible a la K + +), bario (Ba 2 +), y el cesio (Cs +). Uso de DI y mediciones electrofisiológicas en varios genotipos de Arabidopsis, hemos sido capaces de concluyente atribuyen la gran mayoría de la AWE a los cambios en las actividades del canal de K + Arabidopsis, AtAKT1, y de alta afinidad K + transportador, AtHAK5 14.
Figura 3 parcelas del flujo de salida de estado estacionario de 42 K +, con el tiempo, a partir de raíces de las plántulas pre-etiquetados de cebada cultivadas a baja (0,1 mM) K + y moderada (1 mM) NO 3 -. Estos rastros muestran cómo el método CATE puede revelar cambios rápidos y significativos en flujo de salida tras la aplicación de diversos agentes farmacológicos / nutricionales. Se observó una inhibición sustancial e inmediata de salida de K + en una aplicación ya sea de 10 mM Cs +, K + bloqueador canal, o un fuerte aumentoen K + disposición (de 0,1 a 10 mM). Estos resultados son consistentes con estudios moleculares que describen las propiedades únicas de compuerta hacia el exterior rectificación de canales de K + 15. Por el contrario, la aplicación de 10 mM NH 4 + rápida y fuertemente estimulada salida de K +. Este efecto se puede explicar por la activación de rectificación hacia el exterior a través de canales de K + despolarización de la gradiente de potencial eléctrico a través de la membrana plasmática de células de la raíz 16, que se sabe que ocurre después de la introducción de NH 4 + 17. Por lo tanto, utilizando este método, hemos sido capaces de demostrar, en planta, que canales de K + median salida de K + en raíces de cebada 10.
Por último, la Tabla 1 muestra los parámetros CATE extraídos de las mediciones de estado estacionario 42 salida de K + ([K +] ext = 0,1 mM) en semillas de cebadaplántulas crecidas ya sea con 1 mM NO 3 - o 10 mM NH 4 +, en representación de un escenario tóxico. La alta NH 4 + condición provoca una supresión de todos los flujos de K +, y una disminución significativa en la concentración de K + citosólico ([K +] cyt), que normalmente es homeostáticamente mantuvo a ~ 100 mM en condiciones de crecimiento saludables 18 (como se observa , por ejemplo, en la Tabla 1, en virtud de NO 3 - suministro).
Figura 1. 13 NH 3 isotermas de afluencia revelan cómo K + de alimentación regula el transporte de nitrógeno. Afluencia NH 3 como una función de concentraciones variables externas de NH
Figura 2. NH 4 + estimula significativamente la retirada K + afluencia mediada por canal. Afluencia K + en estado estacionario, y tras la retirada de NH 4 +, en raíces de las plántulas de cebada cultivadas intactas a baja (0,1 mM) K + y alta (10 mM) NH 4 +. El efecto de K + bloqueadores de los canales (10 mM TEA +, Ba 2 + 5 mM y 10 mM Cs +) en el estimulado afluencia K + se pronuncia. Los asteriscos denotan diferentes niveles de significancia entre -NH 4 + y tratamiento pares (* 0,01 <p <0,05, *** P <0,001; ANOVA de una vía con comparación múltiple de Dunnett post-hocprueba). Los asteriscos que aparecen entre paréntesis indican el nivel de significación entre el control y NH 4 + par (prueba t de Student). Las barras de error indican SEM de> 4 repeticiones. (Reproducido de Coskun et al. Capacidad y plasticidad de los canales de potasio y transportadores de alta afinidad en las raíces de cebada y Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Figura 3. salida de K + es el canal mediada bajo-K + bajo condiciones de estado estacionario 42 salida de K + en las raíces de las plántulas de cebada cultivadas intactas a baja (0,1 mM) K + y moderada (1 mM) NO 3 -., Y los efectos inmediatos (en t = 15,5 min; véase la flecha) de 10 mM CsCl, 5 mM K 2 SO4, y 5 mM (NH 4) 2 SO 4 en flujo de salida. Cada parcela representa la media de 3-13 repeticiones (SEM <15% de la media). (Reproducido de Coskun et al Reglamento y el mecanismo de liberación de potasio a partir de raíces de cebada:.. Una in planta 42 K + análisis Nueva Phytol 188, 1028-1038 (2010).).
| Ext [K +] | Fuente N | Afluencia | Eflujo | Flujo neto | E: Relación I | Tamaño de la piscina | La vida media |
| (MM) | (Mmol g -1 h -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0,1 | 1 NO 3 - | 7,22 ± 0,23 | 1,86 ± 0,18 | 5,36 ± 0,18 | 0,25 ± 0,02 | 98,84 ± 14,08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1,89 ± 0,13 | 0,57 ± 0,05 | 1,32 ± 0,10 | 0,30 ± 0,01 | 28.39 ± 3.40 | 32.50 ± 4.69 | |
Tabla 1.-El estado de equilibrio de K + flujos y compartmentation virtud de diversas disposiciones N en estado de flujo y análisis compartimental de plántulas de cebada crecido a 0,1 mM K +, y ya sea moderada NO 3 -. (1 mM, como sal de Ca 2 +) o alta NH 4 + (10 mM, como SO 4 2- sal). Errores indican ± SEM de> 8 repeticiones. (Reproducido de Coskun et al Reglamento y el mecanismo de liberación de potasio a partir de raíces de cebada:.. Una in planta 42 K + análisis Nueva Phytol 188, 1028-1038 (2010) y Coskun et al de la capacidad y la plasticidad de los canales de potasio y alto.. transportadores de afinidad en raíces de cebada y Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
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Discussion
Como se demuestra en los ejemplos anteriores, el método radiotrazador es un poderoso medio de la medición de los flujos unidireccionales de nutrientes y sustancias tóxicas en planta. Figura 1 muestra que NH 3 afluencia puede llegar a más de 225 mmol g -1 h -1, que es tal vez el más alto bona fide transmembrana flujo siempre informó en un sistema planta 13, pero la magnitud de este flujo no sería visible si sólo se midieron los flujos netos. Esto se debe a un gran flujo de salida de NH 3 se produce al mismo tiempo que afluencia, en un escenario de ciclos fútiles que puede resultar en una subestimación pronunciada de afluencia que aumenta con el tiempo etiquetado 13. Al complementar la técnica del marcador con el análisis electrofisiológico, hemos sido capaces de demostrar que en las condiciones de la Figura 1, tanto en afluencia y flujo de salida de 13 N es principalmente del gas neutro NH 3, y no de su Conjugcomió NH ácido 4 + (para más detalles, véase el punto 13). Esta es la primera demostración en planta de los rápidos flujos de gas NH 3 en las raíces, y como tal, proporciona evidencia preliminar importante para desentrañar el mecanismo de transporte que se encuentra en el corazón de NH 3 / NH 4 + toxicidad en las plantas superiores 2,13. Trabajo molecular en sistemas de expresión heterólogos ha demostrado que NH 3 puede fluir a través de las acuaporinas en las plantas 19, y los datos de la Figura 1, junto con la evidencia farmacológica reciente, ha comenzado a corroborar estos hallazgos a nivel del organismo intacto 13.
Figuras 2 y 3 también proporcionan excelentes ejemplos de la utilidad de la medición de los flujos unidireccionales con radiotrazadores. El uso de DI con 42 K +, hemos sido capaces de demostrar que los canales de iones no son responsables por el estado estable K + + NH 4 +, en contraste con el sistema modelo Arabidopsis 14. Sólo cuando se retiró NH 4 + te vimos evidencia de la participación de los canales de K + (Figura 2). Aunque el flujo neto de K + también es estimulada por NH 4 + retirada (como se muestra por el aumento de K + contenido de tejido 14), sólo mediante la medición de afluencia unidireccional fuimos capaces revelamos la magnitud y la rápida aparición de este fenómeno. Por otra parte, mediante la realización de mediciones de DI con mutantes y agentes farmacológicos, hemos sido capaces de identificar qué proteínas de transporte estuvieron involucrados. Del mismo modo, mediante la aplicación de agentes nutricionales y farmacológicas mientras controla flujo de salida de trazador (Figura 3), hemos sido capaces de caracterizar e identificar mecanismos de salida de K + a partir de células de raíces de cebada 10. Así, las técnicas tales como diy CATE puede ser instrumental para la comprensión de las características de transporte para un macronutriente crítico.
Como se ha indicado en el protocolo, a menudo la posición de la muestra en relación con el detector en el contador gamma puede influir en la cantidad de radiación medida. Por lo tanto, si una muestra de 1 ml se "reponía" con 19 ml de H 2 O, los recuentos medidos (cpm) en la muestra de 20 ml puede ser significativamente menor que en la muestra de 1 ml, a pesar de tener la misma cantidad del radiotrazador. Por lo tanto, un D f se puede aplicar para corregir esta aparente "dilución" de la radiactividad. Este problema a menudo no se indica explícitamente por los fabricantes de instrumentos de detección y debe ser elaborado por el investigador individual. Del mismo modo, la eficacia de blindaje contra la radiación dentro de los detectores de ambiente (es decir, a partir de muestras cercanos dentro del contador) puede ser exagerada por los fabricantes, y tales problemas se debe trabajarpor sistemas de medición individuales.
Una ventaja importante de la técnica de trazador es su no invasividad, que proporciona un medio para medir flujos, tamaños piscina intracelulares, y tipos de cambio, bajo condiciones de estado estacionario. Por ejemplo, con CATE, podríamos no invasiva cuantificar las concentraciones citosólicas de K + (Tabla 1). Esto puede ser preferible a los métodos alternativos, tales como el empalamiento de células con microelectrodos selectivos de iones 18, que imparte perturbaciones físicas y químicas posiblemente a la célula. Además, la técnica del marcador es única, ya que ofrece una visión global de los flujos y la compartimentación de órganos completos y plantas intactas. Esto es importante si uno está interesado en la comprensión de la dinámica de nutrientes de la planta entera, toxicidad, y en última instancia, el rendimiento en el campo. Por último, los métodos de radiotrazadores permiten mediciones muy sensibles que se llevan a cabo bajo concentraciones bastante altas de sustrato. Tradiexperimentos de reducción cionales y técnicas de microelectrodos pueden experimentar problemas de interferencia de fondo y, por tanto, pueden requerir que la concentración externa del sustrato de interés se reduce muy por debajo de la proporcionada durante el crecimiento. Esto podría ser problemático si uno está interesado en el estudio de las condiciones de "estado estacionario" de altas concentraciones de sustrato (por ejemplo, con el NH 3 / NH 4 + toxicidad o condiciones "high-k +"; véase más arriba).
Cabe señalar que, como todas las técnicas, la medición de flujos con radiotrazadores no es sin sus limitaciones. Por ejemplo, la disponibilidad de radiotrazadores puede ser problemático, sobre todo para los isótopos de muy corta vida como el 13 N que requieren las proximidades de una planta de producción como un ciclotrón. Otra limitación importante es que, a veces, puede ser difícil discriminar entre los flujos que se están produciendo a través de membranas y aquellos que ocurren extracellularly. Tales distinciones llaman para probar fase rigurosa 7,10,20. En el caso de salida de K +, sólo después de un examen cuidadoso fuimos capaces de confirmar que el estado de equilibrio de 42 K + liberación de raíces no fue ocurriendo a través de las membranas celulares en alto [K +] ext (> 1 mM) 10, pero a partir extracelular espacios (cf, Figura 3). Tales problemas se pueden resolver mediante el examen de los efectos de una amplia gama de agentes farmacológicos, o por medio de los análisis termodinámicos, que han mostrado, por ejemplo, que los flujos muy altos de Na + reportados bajo condiciones salinas serían energéticamente inviables iban a proceder a través de las membranas celulares 21,22.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
