Introduction
Den opptak og fordeling av næringsstoffer og toksikanter sterkt påvirker plantevekst. Følgelig etterforskningen av underliggende transportprosesser utgjør et stort område av forskning i plantebiologi og landbruksvitenskap 1,2, spesielt i sammenhenger av ernæringsoptimalisering og miljømessige påkjenninger (f.eks salt stress, ammonium toksisitet). Den fremste blant metoder for måling av fluksene i planter er bruk av radioisotopiske sporstoff, som ble utviklet i 1950-årene betraktelig (se eksempel 3) og fortsetter å være mye brukt i dag. Andre metoder, slik som måling av næringsutarming fra roten medium og / eller akkumulering i vev, bruk av ione-selektive vibrerende mikroelektroder som mife (microelectrode ion fluks estimering) og siet (skanning ion-selektiv elektrode teknikk), og bruk av ion-selektive fluorescerende fargestoffer, er også mye brukt, men er begrenset i sin evne til å oppdage nettet influensaxes (dvs. forskjellen mellom tilstrømningen og effluks). Bruken av radioisotoper, på den annen side, gjør det mulig for forskeren den unike evne til å isolere og kvantifisere ensrettede fluks, som kan brukes til å løse kinetiske parametere (for eksempel K M og V maks), og gi innsikt i kapasiteten, energetics, mekanismer, og regulering, av transportsystemene. Ensrettede fluks målinger gjort med radiotracers er spesielt nyttig under forhold hvor forandring i den motsatte retning er høy, og omsetningen av intracellulære bassenger er rask 4. Videre radio-metoder tillater målinger å bli utført under relativt høye konsentrasjoner substrat, i motsetning til mange andre teknikker (se Diskusjon ', nedenfor), fordi spores isotopen er observert mot en bakgrunn av en annen isotop av det samme element.
Her gir vi en detaljert fremgangsmåte for radioisotopisk måling av enveis og nET fluks av mineralske næringsstoffer og miljøgifter i intakte planter. Det vil bli gjort på fluks måling av kalium (K +), et anlegg som makronæringsstoff 5, og ammoniakk / ammonium (NH 3 / NH4 +), en annen som makronæringsstoff er imidlertid toksisk når den er tilstede i høye konsentrasjoner (f.eks, 1- 10 mM) 2. Vi vil bruke de radioisotoper 42 K + (t 1/2 = 12.36 timer) og 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), henholdsvis i intakte frøplanter av modellsystemet bygg (Hordeum vulgare L .), i beskrivelsen av to nøkkel protokoller: direkte tilstrømning (DI) og kompartment analyse ved tracer effluks (Cate). Vi bør merke fra begynnelsen at denne artikkelen beskriver bare de nødvendige skritt for å utføre hver protokoll. Der det er hensiktsmessig, er korte forklaringer på beregninger og teori forutsatt, men detaljerte utstillinger av hver teknikk'S bakgrunn og teori kan finnes i flere viktige artikler om emnet 4,6-9. Viktigere, disse protokollene er bredt overførbar til flux analyse av andre næringsstoffer / giftstoffer (for eksempel 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) og til andre plantearter, om enn med noen advarsler (se nedenfor) . Vi understreker også viktigheten av at alle forskere som arbeider med radioaktive materialer må arbeide under en lisens ordnet gjennom deres institusjonens ioniserende stråling sikkerhetsmyndighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant Kultur og klargjøring
- Grow bygg frøplanter hydroponically for 7 dager på klima-kontrollerte vekstkammer (for detaljer, se 10).
MERK: Det er viktig å vurdere å undersøke planter på en rekke utviklingsstadier, som næringsbehov vil endre seg med alderen. - En dag før eksperimentering, pakke flere frøplanter sammen for å lage en enkelt replikere (tre planter per bunt for DI, 6 planter per bunt Cate). Bundle frøplanter ved å pakke en 2 cm stykke av Tygon rør rundt den basale parti av skuddene, og feste røret med tape for å lage en "krage".
MERK: Antall planter per bunt kan variere basert på eksperimentelle forhold 10,13,14. Bunting er gjort for å bedre statistikk og målenøyaktigheten, særlig ved roten masse og / eller spesifikke aktivitet er lav.
2. Utarbeidelse av Eksperimentelle Solutions / Materialer
innhold "> MERK: Følgende er vanligvis utføres 1 dag før eksperimentering.- For DI, trenger du følgende: Pre-merking, merking, og desorpsjon løsninger (for detaljer, se 11), sentrifuge rør (for spin-tørking av planteprøver), og prøvehetteglass (for plantemateriale og spesifikk aktivitet [S o; se nedenfor]). Luft og bland alle løsninger.
- Cate, trenger du følgende: Godt blandet, lett merking og elueringsoppløsninger (for detaljer, se 10), efflux trakter, sentrifuge rør (for spin-tørking av planteprøver) og eksempelhetteglass (for eluatene, planteprøver, og bestemmelse av S o og fortynningsfaktoren [D f, se nedenfor]).
3. Forbered radiomerkings
FORSIKTIG: Følgende sikkerhets skritt som bør tas før arbeider med radioaktivitet.
- Sikre at kravene i radioactive materialer lisens blir forstått og fulgt. Bruk riktig sikkerhetsutstyr (dvs. beskyttelsesbriller, hansker, laboratoriefrakk, bly vest / krage) og dosimetre (f.eks TLD ring og merke). Sett opp skjerming (dvs. pleksiglass og bly murstein) og utføre radioaktivt arbeid bak det. Sikre at en Geiger-Müller-telleren er tilstede for å rutinemessig overvåke for forurensning.
- Utarbeidelse av 42 K +
- Plasser en ren, tørr beger på balansen. Null balanse.
- Fjern hetteglass med tracer (20 mCi av 42 K 2 CO 3, i pulverform) fra emballasje og hell tracer i begerglasset. Ta note av massen.
- Pipettes 19.93 ml dH 2 O, etterfulgt av 0,07 ml H 2 SO 4, inn begeret. Dette vil drive den følgende kjemiske reaksjon:
42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2 H 2 O (l) - Beregn konsentrasjonen av den radioaktive stamløsning, gitt masse og molekylvekten av K 2 CO 3, og volumet (20 ml).
MERK: Ved å arbeide med 13 NH 3/13 NH4 + Sporeren fremstilles i en syklotron via proton bombardement av oksygenatomet med vann (vanligvis resulterer i 100 til 200 mCi-aktivitet, for produksjon detaljer, se 12). På grunn av at mengden av 14 NH 3/14 NH4 + er ekstremt lav i disse løsningene, er den N konsentrasjon av stamløsningen ubetydelig.
4. Direkte Tilstrømningen (DI) Måling
- For 42 K +, pipette mengden av radioaktivt stamløsning som kreves for å oppnå den ønskede sluttkonsentrasjon av K + i merkningsoppløsningen.
- For 13 NH 3/13 NH4 +, pipette en liten mengde (<0,5 ml) i merkningsoppløsningen. Tillat merking oppløsningen for å blande grundig (via lufting).
- Pipette en 1 ml underutvalg av merking løsning i en prøvehetteglass og gjenta tre ganger (fire prøver totalt).
- Måle radioaktiviteten i ampuller (i "tellinger per minutt, cpm"), ved bruk av en gammateller. Pass på at disken er programmert slik at CPM-målinger er korrigert for isotop forfallet (dette er spesielt viktig for slike kortvarige sporstoffer).
- Beregn S o (uttrykt som cpm pmol -1) ved å ta gjennomsnittet av tellinger av de fire prøvene (cpm ml -1) og dividere med konsentrasjonen av substratet i oppløsningen (pmol ml -1).
- Fordyp røtter i pre-merking (ikke-radioaktiv) løsningen i 5 min, å pre-ekvilibreres planter under testbetingelsene (sef.eks 10,13,14 for variasjoner i pre-label tid).
- Fordyp røtter i merking (radioaktivt) løsning for 5 min.
MERK: Merke ganger kan variere basert på eksperiment 3,4,7-10. - Overføring desorpsjon røttene til oppløsningen i 5 sekunder for å fjerne mesteparten av overflaten heftende radioaktivitet. Overfør røttene inn i et andre beger av desorpsjon oppløsningen i 5 minutter for ytterligere å klare røttene av ekstracellulær tracer.
- Dissekere og separate skudd, basal skudd og røtter.
- Plasser røtter i sentrifugerør og sentrifuger prøvene i 30 sek i en lav hastighet, til klinisk-grade sentrifuge (~ 5000 xg) fjerne overflate og interstitiell vann.
- Vei røtter (ferskvekt, FW).
- Count radioaktivitet i planteprøver (shoot, basal shoot, og rot, se trinn 4.2.1).
- Beregn flux. Beregn tilstrømningen inn i anlegget ved hjelp av formelen
Φ = Q * / S o wt L
hvor Φ er fluksen(Pmol g -1 t -1), er Q * mengden av tracer akkumuleres i vev (cpm, vanligvis i roten, skyt, og basal shoot, kombinert), er S o den spesifikke aktivitet av merkingen løsning (cpm pmol - 1), er w roten ferskvekt (g) og t L er merking tid (t).
MERK: Mer sofistikert beregning kan gjøres for å ta hensyn til samtidig tracer utstrømming fra røtter under merking og desorpsjon, basert på parametere hentet fra CATE (se nedenfor, for detaljer, se 4).
5. compartment Analyse av Tracer Efflux (Cate) Måling
- Forbered merking løsning og måle S o (se trinn 4.1 til 4.2 ovenfor).
- Mål fortynningsfaktoren (D f).
MERK: Ofte kan posisjonen av prøven i forhold til detektoren i gammateller påvirke mengdenstråling måles. Se diskusjonen for detaljer.- Etter måling av S o, tilsett 19 ml av H2O til hver prøve (slik at sluttvolum = eluatet volum = 20 ml). Count radioaktivitet i hver 20-ml prøve (se trinn 4.2.1).
- Beregn D f ved å dividere gjennomsnittlig cpm av 1 ml prøver med gjennomsnittlig cpm av 20-ml prøver.
- Fordyp røtter i merkningsoppløsningen i 1 time.
- Fjern planter fra merking løsning og overføringsanlegg til dyseutstrømningen trakten, noe som sikrer hele roten materialet er i trakten. Forsiktig sikre planter til side av effluks trakt ved å bruke en liten stripe av tape over plastringen.
- Forsiktig helle den første eluat inn i trakten. Start tidtaker (teller opp).
- Åpne kran og samle eluatet i prøven hetteglasset etter 15 sek (merk: elueringstid vil variere, se nedenfor). Lukk stuss. Forsiktig helle den neste eluat inn i trakten.
- Repeat trinn 5.6 for den resterende eluerings-serien, som følger, fra det første til det siste eluat: 15 sek (fire ganger), 20 sek (tre ganger), 30 sek (to ganger), 40 sek (en gang), 50 sek (en gang), 1 min (25 ganger), for en total eluering periode på 29,5 min
MERK: Desorpsjon serien kan variere basert på eksperimentelle forhold 7-10,13,14. - Etter eluering protokoll er fullført, (trinn 4.6 til 4.8, ovenfor) slakteanlegg.
- Count radioaktivitet i eluater og planteprøver i gammateller (multiplisere avlesning for hver eluat av D f, se 5.2).
- Plot tracer frigivelse (cpm g (root FW) -1 min-1) som funksjon av elueringstid. For steady-state, utføre lineære regresjoner og beregninger av flukser, halveringstider på utveksling, og basseng størrelser (for detaljer, se 6-9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser isotermer funnet ved hjelp av DI teknikk (med 13 N), for tilstrømningen av NH 3 til røttene av intakte bygg frøplanter dyrket ved høy (10 mm) NH 4 +, og enten lav (0,02 mm) eller høy (5 mm ) K +. De viser isotermer Michaelis-Menten-kinetikk ved NH 3 flukser er plottet som en funksjon av ytre NH3 konsentrasjon ([NH3] ekst; justert med forandringer i pH 13). NH 3 flukser var signifikant høyere ved lave K + enn ved høy K +. Analyse av Michaelis-Menten-kinetiske parametere viste at K M var relativt stabil mellom K + nivåer (150 g 90 μ M ved lav og høy K +, henholdsvis), mens V max er sterkt redusert ved høy K + (205 g 80 mikromol g -1 t -1). Således dataene indikerer at K +-nivå regulates nitrogen transport (V max virkning), men ikke ved direkte konkurranse mellom K + og NH 3 for bindingsseter av transportører (K M-effekt). Snarere kan K + regulere NH 3 flukser på andre måter, for eksempel gjennom modulering av aquaporin aktivitet (for detaljer, se 13).
DI er også nyttige for å fange av forholdsvis raske endringer i innstrømning på grunn av nærings-skift, eller til anvendelsen av farmakologiske midler. For eksempel, Figur 2 høydepunkter den raske plastisitet av K + -uptake system i røttene av intakte bygg frøplanter dyrket ved moderat (0.1 mm) -K + og høy (10 mm) -NH 4 + forhold. Her observerte vi en ~ 350% økning i K + tilstrømningen innen 5 min av NH 4 + tilbaketrekning fra den eksterne løsningen. Denne "ammonium uttakseffekten" ("skremme") ble funnet å være følsomme for K + +), barium (Ba 2 +) og cesium (Cs +). Bruke DI og elektrofysiologiske målinger i flere Arabidopsis genotyper, kunne vi endelig tillegge det store flertallet av AWE til endringer i aktiviteter av Arabidopsis K + kanal, AtAKT1, og høy affinitet K + transporter, AtHAK5 14.
Figur 3 tomter steady-state effluks av 42 K +, over tid, fra røttene av pre-merket bygg frøplanter dyrket ved lav (0.1 mm) K + og moderat (1 mm) NO 3 -. Disse sporene viser hvordan CATE metoden kan avsløre raske og betydelige endringer i utstrømming ved anvendelse av ulike farmakologiske / ernæringsmessige midler. Betydelige, umiddelbare inhibering av K + effluks ble observert ved anvendelse av enten en 10 mM Cs +, K + -kanal blokkering, eller en skarp økningin K + bestemmelse (0,1 til 10 mM). Disse resultatene er i overensstemmelse med molekyl studier beskriver de unike egenskapene til gating utad he-K +-kanaler 15. Derimot, anvendelse av 10 mM NH4 + hurtig og sterkt stimulert K + effluks. Denne effekten kan forklares ved aktivering av utad rette opp K +-kanaler via depolarisering av det elektriske potensial gradient over plasmamembranen av celler rot 16, som er kjent for å oppstå ved innføring av NH4 + 17. Dermed bruker denne metoden, har vi vært i stand til å demonstrere, i planta, at K + kanaler megle K + effluks i røttene av bygg 10.
Til slutt, Tabell 1 viser CATE parametere hentet fra målinger av steady-state 42 K + effluks ([K +] ext = 0,1 mM) i bygg frølings vokst enten med 1 mM NO 3 - eller 10 mM NH 4 +, sistnevnte representerer en giftig scenario. Den høye NH4 + tilstand bevirker en undertrykkelse av alle K + flukser, og en signifikant nedgang i cytosolisk K + konsentrasjon ([K +] cyt), som normalt homeostatisk holdes ved ~ 100 mM henhold friske vekstbetingelser 18 (som observert , for eksempel i tabell 1 under NO 3 - forsyning).
Figur 1. 13 NH 3 tilstrømningen isotermer viser hvordan K + regulerer nitrogentilførselen transport. NH 3 tilstrømningen som en funksjon av varierende konsentrasjoner av ytre NH
Figur 2. NH 4 + tilbaketrekking betydelig stimulerer kanal-mediert K + tilstrømningen. K + tilstrømningen ved steady state, og ved uttak av NH 4 +, i røttene av intakte bygg frøplanter dyrket ved lav (0.1 mm) K + og høy (10 mM) NH 4 +. Effekten av K + kanals blokkere (10 mM TEA +, 5 mM Ba 2 +, og 10 mM Cs +) på stimulert K + tilstrømningen uttales. Stjernene betegner forskjellige nivåer av betydning mellom -NH 4 + og behandlings par (* 0,01 <P <0,05, *** P <0,001; enveis ANOVA med Dunnetts multiple sammenlignings post-hoctest). Stjernene i parentes betegne signifikansnivå mellom kontroll og -NH 4 + par (Student t-test). Feilfelt angir SEM av> 4 gjentak. (Gjengitt fra Coskun et al. Kapasitet og plastisitet av kaliumkanaler og høy affinitet transportører i røttene av bygg og Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Figur 3. K + effluks er kanal-mediert ved dårlige K + forhold Steady-state 42 K + effluks i røttene av intakte bygg frøplanter dyrket ved lav (0.1 mm) K + og moderat (1 mm) NO 3 -., Og de umiddelbare effekter (ved t = 15.5 min, se pilen) på 10 mM CsCl, 5 mM K 2 SO4, og 5 mm (NH 4) 2 SO 4 på avgivelse. Hver tomt representerer gjennomsnittet av 3-13 replikater (SEM <15% av gjennomsnittet). (Gjengitt fra Coskun et al Regulering og mekanisme av kalium utgivelse fra bygg røtter:.. En i planta 42 K + analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010)..)
| [K +] ext | N kilde | Tilstrømningen | Effluks | Netto Flux | E: Jeg Ratio | Pool størrelse | Half-life |
| (MM) | (Mikromol g -1 t -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0.1 | 1 NO 3 - | 7.22 ± 0.23 | 1.86 ± 0.18 | 5.36 ± 0.18 | 0.25 ± 0.02 | 98.84 ± 14.08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1.89 ± 0.13 | 0.57 ± 0.05 | 1.32 ± 0.10 | 0,30 ± 0,01 | 28.39 ± 3.40 | 32.50 ± 4.69 | |
Tabell 1. Steady-state K + flukser og compartmentation under ulike N bestemmelser Steady-state flux og compartment analyse av bygg frøplanter vokst med 0,1 mM K +, og enten moderat NO 3 -. (1 mm, som Ca 2 + salt) eller høy NH 4 + (10 mm, som SO 4 2- salt). Feilene indikerer ± SEM av> 8 replikater. (Gjengitt fra Coskun et al Regulering og mekanisme av kalium utgivelse fra bygg røtter:.. En i planta 42 K + analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010) og Coskun et al Kapasitet og plastisitet av kaliumkanaler og høy.. affinitet transportører i røttene av bygg og Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vist i eksemplene ovenfor, er den radiomerkingsmetode et kraftig middel til å måle ensrettede fluks av næringsstoffer og miljøgifter i planta. Figur 1 viser at NH 3 tilstrømningen kan nå i overkant av 225 mikromol g -1 t -1, som er kanskje den høyeste bona fide transmembrane flux noen gang er rapportert i et anlegg system 13, men omfanget av dette flux ville ikke være synlig hvis bare netto fluks ble målt. Dette skyldes at en stor utstrømning av NH 3 skjer på samme tid som tilstrømning, i en nytteløs sykkelbanen som kan resultere i en markert undervurdering av tilstrømningen som øker med tiden for 13 merking. Ved å supplere den tracer teknikk med elektrofysiologisk analyse, var vi i stand til å vise at under betingelsene av Figur 1, både tilstrømningen og effluks av 13 N er først og fremst for den nøytrale gassen NH 3, og ikke av sin conjugspiste syre NH 4 + (for detaljer, se 13). Dette er den første i planta demonstrasjon av raske NH 3 karbonflux i røttene, og som sådan, gir viktig foreløpige bevis mot rakne transportmekanismen som ligger i hjertet av NH 3 / NH 4 + toksisitet i høyere planter 2,13 masse. Molekyl arbeid i heterologe ekspresjonssystemer har vist at NH 3 kan strømme via aquaporins i planter 19, og dataene fra figur 1, sammen med farmakologisk bevis nylig, har begynt å underbygge slike funn på nivået av den intakte organisme 13.
Figurene 2 og 3 gir også utmerkede eksempler på verktøyet for å måle ensrettede fluks med radiotracers. Bruke DI med 42 K +, var vi i stand til å vise at ion kanaler er ikke ansvarlig for steady-state K + + NH4 +, i motsetning til modellsystemet Arabidopsis 14. Bare når NH 4 + ble trukket tilbake gjorde vi se bevis for engasjement av K +-kanaler (figur 2). Selv om den netto forandring av K + blir også stimulert av NH4 + uttak (som vist ved økt vev K + innhold 14), kun ved å måle ensrettet strøm var vi i stand avdekke størrelsen og hurtig innsettende dette fenomenet. Videre, ved å gjennomføre DI målinger med mutanter og farmakologiske midler, kunne vi identifisere hvilke transportproteiner var involvert. Tilsvarende, ved å anvende ernæringsmessige og farmakologiske midler, mens overvåking tracer effluks (figur 3), var vi i stand til å karakterisere og identifisere mekanismer for K + effluks fra bygg liggende celler 10. Således er teknikker som DIog Cate kan være medvirkende til forståelsen av transportegenskaper for en kritisk makronæringsstoff.
Som nevnt i protokollen, ofte posisjonen av prøven i forhold til detektoren i gammateller kan påvirke mengden av stråling måles. Således, hvis en 1 ml-prøven "toppet" med 19 ml H2O, kan de målte tellinger (cpm) i 20-ml prøve være betydelig lavere enn i 1-ml prøve, til tross for at den samme mengde av radiomerkings. Derfor kan en D f bli anvendt for å korrigere for denne tilsynelatende "fortynning" av radioaktivitet. Dette problemet er ofte ikke uttrykkelig fastsatt av produsenter av gjenkjenning instrumentering og må utarbeides av den enkelte forsker. På samme måte kan effekten av skjerming innenfor detektorer mot ambient stråling (dvs. fra nærliggende prøver innenfor disken) være overdrevet av produsenter, og slike spørsmål bør arbeidetut for individuelle målesystemer.
En stor fordel med tracer teknikken er sin ikke-spredningsmåte, noe som gir et middel til å måle flukser, intracellulære basseng størrelser, og valutakurser under steady-state. For eksempel med CATE, vi kunne ikke-invasiv kvantifisere cytosoliske konsentrasjoner av K + (tabell 1). Dette kan være å foretrekke fremfor alternative metoder som impalement av celler med ion-selektive mikroelektroder 18, som bibringer fysiske og eventuelt kjemiske forstyrrelser til cellen. I tillegg er tracer teknikken unik ved at den gir et helhetlig syn på flukser og compartmentalization for hele organer og intakte planter. Dette er viktig hvis man er interessert i å forstå hel-anlegget næringsdynamikk, giftighet, og til slutt, ytelse i felten. Endelig, gjør det mulig for radio-metoder for svært sensitive målinger som skal gjennomføres under forholdsvis høye konsentrasjoner substrat. Tradielle uttømming eksperimenter og microelectrode teknikker kan oppleve problemer av bakgrunnsinterferens og dermed, kan kreve at den ytre konsentrasjonen av substratet av interesse er senket godt under det forutsatt under vekst. Dette kan være problematisk hvis man er interessert i å studere "steady-state" forhold med høy substratkonsentrasjonene (for eksempel med NH 3 / NH 4 + toksisitet eller "High-K +" vilkår, se ovenfor).
Det bør bemerkes at, i likhet med alle teknikker, måling flukser med radiotracers er ikke uten begrensninger. For eksempel kan tilgjengeligheten av radiotracers være problematisk, særlig for svært kortvarig isotoper som 13 N som krever umiddelbar nærhet til et produksjonsanlegg, for eksempel en syklotron. En annen viktig begrensning er at til tider kan det være vanskelig å diskriminere mellom flukser som foregår på tvers av membraner og de forekommende extracellularly. Slike utmerkelser kaller for streng fase testing 7,10,20. I tilfelle av K + effluks, bare etter nøye undersøkelse var vi i stand til å bekrefte at steady-state 42 K + utgivelse fra røttene var forekommende ikke over cellemembraner ved høy [K +] ext (> 1 mm) 10, men fra ekstracellulært mellomrom (jf, figur 3). Slike problemer kan løses ved å undersøke effekten av en lang rekke farmakologiske midler, eller ved termodynamiske analyser, som er vist, for eksempel, at svært høye Na + flukser rapportert som saltbetingelser vil være energimessig drivverdige ble de til å gå videre over cellemembraner 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
