Introduction
Upptaget och distribution av näringsämnen och gifter påverkar starkt växtligheten. Följaktligen utredning av underliggande transportprocesser utgör ett stort forskningsområde inom växtbiologi och jordbruksvetenskap 1,2, särskilt i sammanhang av näringsoptimering och miljöstress (t.ex. salt stress, ammonium toxicitet). Främst bland metoder för mätning av flöden i växter är användningen av radioisotopspårämnen, som utvecklats kraftigt under 1950-talet (se t ex 3) och fortsätter att vara i stor utsträckning idag. Andra metoder, såsom mätning av näringsutarmning från roten medellång och / eller ackumulering i vävnader, användningen av jonselektiva vibrerande mikroelektroder såsom MIFE (mikroelektrod jonflödet uppskattning) och Siet (scanning jonselektiv elektrod teknik), och användning av jonselektiva fluorescerande färgämnen, är också i stor utsträckning, men är begränsade i sin förmåga att detektera netto influensaxes (dvs skillnaden mellan inflöde och utflöde). Användningen av radioisotoper, å andra sidan, gör forskaren en unik förmåga att isolera och kvantifiera enkelriktade flöden, som kan användas för att lösa kinetiska parametrar (t.ex. K M och V max), och ge insikt i kapaciteten, energetik, mekanismer och reglering, för transportsystem. Enkelriktade flödesmätningar gjorda med radiospårämnen är särskilt användbara under förhållanden där flödet i motsatt riktning är hög, och omsättningen av intracellulära pooler är snabb 4. Dessutom radiospårmetoder tillåter mätningar som ska genomföras under relativt höga substratkoncentrationer, till skillnad från många andra tekniker (se "Diskussion", nedan), eftersom den spårade isotopen observeras mot en bakgrund av en annan isotop av samma element.
Här ger vi detaljerade steg för radioisotop mätning av enkelriktad och net flöden av mineralnäringsämnen och gifter i intakta växter. Tonvikten kommer att göras på flödesmätning av kalium (K +), en växt macronutrient 5, och ammoniak / ammonium (NH3 / NH4 +), en annan macronutrient som dock giftiga om närvarande vid höga koncentrationer (t.ex., 1 10 mM) 2. Vi kommer att använda radioisotoper 42 K + (t 1/2 = 12,36 tim) och 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respektive, i intakta plantor av modellsystemet korn (Hordeum vulgare L .), i beskrivningen av två viktiga protokoll: direkta inflödet (DI) och kompartmentanalys med spår utflöde (CATE). Vi bör notera från början att den här artikeln beskrivs bara de åtgärder som krävs för att utföra varje protokoll. Vid behov är korta beskrivningar av beräkningar och teori som, men detaljerade utläggningar om varje teknikS bakgrund och teori kan hittas i flera viktiga artiklar i ämnet 4,6-9. Viktigt är dessa protokoll är i stort sett överföras till flussmedel analys av andra näringsämnen / toxiska ämnen (t.ex. 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) och andra växtarter, om än med några varningar (se nedan) . Vi betonar också vikten av att alla forskare som arbetar med radioaktivt material måste arbeta under en licens ordnas genom deras institutions joniserande strålning säkerhetsmyndigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Plantera kultur och beredning
- Väx kornfröplantor hydroponically 7 dagar i ett klimat-kontrollerad tillväxt kammare (för detaljer, se 10).
OBS: Det är viktigt att överväga att växter på en mängd olika utvecklingsstadier, eftersom näringsbehov kommer att förändras med åldern. - En dag före experiment, bunta flera plantor tillsammans för att göra en enda kopia (3 plantor per bunt för DI, 6 plantor per bunt för CATE). Bundle plantor genom att linda en 2-cm bit Tygon slang runt den basala delen av skotten, och säkra slangen med tejp för att skapa en "krage".
OBS: Antalet plantor per bunt kan variera beroende på experimentella förhållanden 10,13,14. Buntning görs för att förbättra statistiken och mätnoggrannhet, särskilt när root massa och / eller specifika aktiviteten är låg.
2 Beredning av experimentella lösningar / Material
innehåll "> OBS: Följande typiskt 1 dag före experiment.- För DI behöver du följande: Pre-märkning, märkning och desorption lösningar (för detaljer, se 11), centrifuge rör (för centrifugering av växtprover) och provflaskor (för växtmaterial och specifik aktivitet [S o; se nedan]). Lufta och blanda alla lösningar.
- För CATE, samla följande: Väl blandad, kolsyrat märkning och elueringslösningar (för detaljer, se 10), utflödes trattar, centrifugerören (för centrifugering av växtprover) och provflaskor (för eluat, växtprover, och bestämning av S o och utspädningsfaktorn [D f; se nedan]).
3 Förbered radioaktiva spår
VARNING: Följande säkerhets åtgärder bör vidtas innan arbete med radioaktivitet.
- Se till att kraven i radioactiva material licens förstås och följas. Använd lämplig skyddsutrustning (dvs, skyddsglasögon, handskar, labbrock, bly väst / krage) och dosimetrar (t.ex. TLD ring och bricka). Ställ in skärm (dvs, plexiglas och bly tegel) och utför radioaktivt arbete bakom det. Se till att en Geiger-Müller-räknare finns för att rutinmässigt övervaka förorening.
- Framställning av 42 K +
- Placera en ren, torr bägare på balansen. Noll balans.
- Ta flaska med spårämne (20 mCi 42 K 2 CO 3, i pulverform) från förpackningen och häll spårämne i bägaren. Ta del av massan.
- Pipette 19,93 ml dH 2 O, följt av 0,07 ml H 2 SO 4, in i bägaren. Detta kommer att driva följande kemiska reaktion:
42 K 2 CO 3 (N) + H 2 SO 4 (l) + H2O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - Beräkna koncentrationen av den radioaktiva stamlösning, med tanke på massa och molekylvikten för K 2 CO 3, och volymen (20 ml).
OBS: Om du arbetar med 13 NH 3/13 NH 4 + Spårämnet tillverkas i en cyklotron via protonbombardemang av syreatomen av vatten (vanligen resulterar i 100-200 mCi verksamhet, för produktionsinformation, se 12). Eftersom kvantiteten av 14 NH 3/14 NH 4 + är extremt låg i dessa lösningar, är det N koncentration av stamlösningen försumbar.
4 direkt tillströmning (DI) Mätning
- För 42 K +, pipet mängden radioaktivt stamlösning som krävs för att nå den önskade slutliga koncentrationen av K + i märkningslösningen.
- För 13 NH 3/13 NH 4 +, pipett av en liten mängd (<0,5 ml) i märkningslösningen. Låt märkningslösningen för att blanda väl (via luftning).
- Pipettera en 1 ml delurval av märkningslösning till ett provglas och upprepa tre gånger (4 prov totalt).
- Mät radioaktiviteten i injektionsflaskor (i "counts per minut", cpm), med användning av en gammaräknare. Se till att disken är programmerad så att cpm avläsningar korrigeras för isotop sönderfall (detta är särskilt viktigt för sådana kortlivade spårämnen).
- Beräkna S o (uttryckt som cpm imol -1) som genomsnittet av grevarna av de fyra prover (cpm ml -1) och dividera med koncentrationen av substrat i lösning (imol ml -1).
- Doppa rötter i pre-märkning (icke radioaktivt) lösning för 5 min, till pre-jämvikt växter under provningsförhållanden (set.ex. 10,13,14 för variationer i pre-label tid).
- Doppa rötter i märkning (radioaktiv) lösning för 5 min.
OBS: Märkningstider kan variera beroende på experiment 3,4,7-10. - Överför rötter till desorption lösning i 5 sekunder för att ta bort huvuddelen av ytan vidhäftande radioaktivitet. Överför rötter in i en andra bägare desorptionen lösningen under 5 min för att ytterligare tydliga rötter av extracellulär tracer.
- Dissekera och separata skott, basala skott och rötter.
- Placera rötter i centrifugrör och spin prover för 30 sek i en låg hastighet, till klinisk kvalitet centrifug (~ 5.000 xg) ta bort ytan och porvatten.
- Väg rötter (färsk vikt, FW).
- Räkna radioaktivitet i växtprover (shoot, basala skott och rot, se steg 4.2.1).
- Beräkna flödet. Beräkna tillströmning i växten med hjälp av formeln
Φ = Q * / S o wt L
där Φ är flödet(Imol g -1 tim -1), Q * mängden spårämne samlats i vävnad (cpm, vanligtvis i rot, skjuta, och basal shoot, kombinerad), är S o den specifika aktiviteten av lösningen märkning (cpm mikromol - 1), är w roten färsk vikt (g), och t L är tidsmärkning (h).
OBS: Mer sofistikerad beräkning kan göras på grund av samtidig spår utflöde från rötterna under märkning och desorption, baserad på parametrar erhållna från CATE (se nedan, för detaljer se 4).
5. kompartmentanalys från Tracer Efflux (CATE) Mätning
- Förbered märkningslösning och mått S o (se steg från 4,1 till 4,2, ovan).
- Mät utspädningsfaktor (Df).
OBSERVERA: Ofta kan placeringen av provet i förhållande till detektorn i gammaräknaren påverka kvantitetenav strålning mättes. Se diskussionen för detaljer.- Efter mätning av S o, tillsätt 19 ml av H2O till varje prov (t.ex. att slutvolym = eluat volym = 20 ml). Räkna radioaktiviteten i varje 20-ml prov (se steg 4.2.1).
- Beräkna D f genom att dividera den genomsnittliga cpm för 1-ml prov av den genomsnittliga cpm av de 20-ml prov.
- Doppa rötter i märkningslösningen i 1 timme.
- Ta bort växter från märkningslösning och överföra växter att utflödes tratt, garanterar allt rot materialet är inom tratten. Försiktigt säkra växter till sidan av utflödes tratt genom att tillämpa en liten remsa av tejp över plastkrage.
- Häll försiktigt det första lakvattnet i tratten. Starta timer (räknar upp).
- Öppna tappen och samla upp eluatet i provflaskan efter 15 sek (notera: elueringstid varierar; se nedan). Stäng tappen. Häll försiktigt nästa eluatet i tratten.
- Repeat steg 5.6 för återstoden av eluering serien, som följer, från den första till den sista eluatet: 15 sek (fyra gånger), 20 sek (tre gånger), 30 sek (två gånger), 40 sek (en gång), 50 sek (en gång), 1 min (25 gånger), för en total eluering period av 29,5 minuter
OBS: Desorption serien kan variera beroende på experimentella förhållanden 7-10,13,14. - När elueringsprotokollet är klar skörd växter (steg från 4,6 till 4,8, ovan).
- Räkna radioaktivitet i lakvatten och växtprover i gammaräknare (multiplicera läsning för varje eluat av D f, se 5.2).
- Plot tracer release (cpm g (root FW) -1 min -1) som en funktion av elueringstid. För stationära förhållanden, utför linjära regressioner och beräkningar av flöden, halveringstider för utbyte och pool storlekar (för detaljer, se 6-9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar isotermer hittats med hjälp av DI-teknik (med 13 N), för tillströmningen av NH3 till rötterna intakta korn plantor som odlas på hög (10 mM) NH 4 +, och antingen låg (0,02 mM) eller hög (5 mM ) K +. Isotermerna visar Michaelis-Menten kinetik när NH 3 flussmedel plottas som en funktion av yttre NH3 koncentration ([NH3] ext; justeras genom ändringar i lösningens pH 13). NH 3 flöden var signifikant högre vid låga K + än vid hög K +. Analys av Michaelis-Menten kinetiska parametrar visade att K M förblev relativt stabil mellan K + nivåer (150 vs 90 μ M vid låg och hög K +, respektive), medan Vmax är starkt reducerad vid hög K + (205 vs 80 pmol g -1 tim -1). Således indikerar data att K + nivå regulates transport kväve (V max effekt), men inte av den direkta konkurrensen mellan K + och NH 3 för bindningsplatser transportörer (K M-effekt). Snarare kan K + reglera NH 3 flussmedel på annat sätt, till exempel genom modulering av aquaporin aktivitet (för detaljer, se punkt 13).
DI är också användbart för infångandet av relativt snabba förändringar i inflödet på grund av näringsmässiga förskjutningar, eller tillämpningen av farmakologiska medel. Till exempel, Figur 2 belyser den snabba plasticitet av K + -upptag system rötter intakta korn plantor som odlas vid måttlig (0,1 mM) -K + och hög (10 mM) -NH 4 + förhållanden. Här observerade vi en ~ 350% ökning av K + inflöde inom 5 min av NH 4 + tillbakadragande från extern lösning. Denna "ammonium tillbakadragande effekt" ("AWE") visade sig vara känslig för K + +), barium (Ba 2 +) och cesium (Cs +). Använda DI och elektrofysiologiska mätningar i flera Arabidopsis genotyper, kunde vi slutgiltigt skriver den stora majoriteten av AWE till förändringar i verksamheten i Arabidopsis K +-kanal, AtAKT1 och hög affinitet K + transportör, AtHAK5 14.
Figur 3 tomter steady-state utflöde av 42 K +, med tiden, från rötter av pre-märkta kornfröplantor odlas vid låg (0,1 mM) K + och måttlig (1 mM) NO 3 -. Dessa spår visar hur CATE metod kan avslöja snabba och betydande förändringar i utflödet vid tillämpning av olika farmakologiska / näringsmedel. Betydande, omedelbar hämning av K + utflöde sågs vid antingen en tillämpning av 10 mM Cs +, K + -kanals blockerare, eller en kraftig ökningi K + bestämmelse (från 0,1 till 10 mM). Dessa resultat överensstämmer med molekylära studier som beskriver de unika grind egenskaper utåt rektifiering K +-kanaler 15. Däremot applicering av 10 mM NH4 + snabbt och kraftigt stimulerade K + efflux. Denna effekt kan förklaras av aktiveringen av utåt likriktande K +-kanaler via depolarisering av den elektriska potentialgradienten över plasmamembranet av rotceller 16, som är känd för att inträffa vid införande av NH4 + 17. Således, med hjälp av denna metod har vi kunnat visa i planta, att K +-kanaler förmedlar K + utflöde i rötter korn 10.
Slutligen visar tabell 1 CATE parametrar extraherade från mätningar av steady-state 42 K + utflöde ([K +] ext = 0,1 mM) i korn utsädelingar odlas antingen med 1 mM NO 3 - eller 10 mM NH 4 +, varvid den senare representerar en toxisk scenario. Den höga NH4 + kondition medför en dämpning av alla K + flussmedel, och en betydande nedgång i cytosolic K + koncentration ([K +] cyt), som normalt är homeostatically hålls vid ~ 100 mm under goda tillväxtbetingelser 18 (som observerats , till exempel, i tabell 1, enligt NR 3 - försörjning).
Figur 1 13 NH 3 tillströmning isotermer avslöjar hur K + leverans reglerar transporter kväve. NH3 tillströmning som funktion av varierande yttre koncentrationer av NH
Figur 2 NH 4 stimulerar + uttag signifikant kanalmedierad K + tillströmning. K + inflöde vid steady state och vid indragning av NH 4 +, i rötterna intakta korn plantor som odlas vid låg (0,1 mM) K + och hög (10 mM) NH 4 +. Effekten av K + -kanals blockerare (10 mM TEA +, 5 mM Ba2 +, och 10 mM Cs +) på stimulerade K + tillströmning uttalas. Asterisker betecknar olika nivåer av signifikans mellan -NH 4 + och behandlingspar (* 0,01 <P <0,05, *** P <0,001; envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse post-hoctest). Asterisker inom parentes anger signifikansnivå mellan kontroll och -NH 4 + par (Students t-test). Felstaplar visar SEM av> 4 replikat. (Återgivet från Coskun et al. Kapacitet och plasticitet av kaliumkanaler och hög affinitet transportörer i rötterna av korn och Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Figur 3 K + utflöde är kanal-medierad under låga-K + förhållanden Steady-state 42 K + utflöde i rötterna intakta korn plantor som odlas vid låg (0,1 mM) K + och måttlig (1 mM) NO 3 -., Och de omedelbara effekterna (vid t = 15,5 min, se pilen) 10 mM CsCl, 5 mM K 2 SO4, och 5 mM (NH4) 2 SO 4 på efflux. Varje tomt representerar medelvärdet av 3-13 replikat (SEM <15% av medelvärdet). (Återgivet från Coskun et al förordningen och mekanismen kaliumfrisättning från korn rötter:.. Ett in planta 42 K + analys New Phytol 188, 1028-1038 (2010)..)
| [K +] ext | N källa | Influx | Utflöde | Nettoflöde | E: Jag Ratio | Pool storlek | Halveringstiden |
| (MM) | (Imol g -1 tim -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0,1 | 1 NO 3 - | 7,22 ± 0,23 | 1,86 ± 0,18 | 5,36 ± 0,18 | 0,25 ± 0,02 | 98,84 ± 14,08 | 28,18 ± 3,40 |
| 10 NH 4 + | 1,89 ± 0,13 | 0,57 ± 0,05 | 1,32 ± 0,10 | 0,30 ± 0,01 | 28,39 ± 3,40 | 32,50 ± 4,69 | |
Tabell 1 Steady-state K + flussmedel och compartmentation under olika N bestämmelser Steady-state flux och kompartmentanalys av korn plantor vuxit med 0,1 mM K +, och antingen måttlig NO 3 -. (1 mM, som Ca 2 + salt) eller hög NH4 + (10 mM, som SO 4 2-salt). Fel indikerar ± SEM av> 8 replikat. (Återgivet från Coskun et al förordningen och mekanismen kaliumfrisättning från korn rötter:.. Ett in planta 42 K + analys New Phytol 188, 1028-1038 (2010) och Coskun et al Kapacitet och plasticitet av kaliumkanaler och hög.. affinitets transportörer i rötterna av korn och Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som visas i exemplen ovan, är den radioaktiva spårmetod ett kraftfullt medel för att mäta enkelriktade flöden av näringsämnen och gifter i planta. Figur 1 visar att NH3 tillströmning kan nå högre än 225 mikromol g -1 tim -1, som kanske är det högsta bona fide trans flux någonsin rapporterats i en växtsystemet 13, men omfattningen av detta flöde skulle inte vara synlig om endast nettoflöden mättes. Detta beror på att ett stort utflöde av NH3 inträffar samtidigt som inflödet, i ett fruktlöst cykling scenario som kan resultera i en uttalad underskattning av tillströmning som ökar med märkning tid 13. Genom att komplettera spårteknik med elektrofysiologisk analys, kunde vi visa att enligt villkoren i figur 1, är både inflöde och utflöde av 13 N främst av den neutrala gasen NH3, och inte dess conjugåt acid NH 4 + (för detaljer, se punkt 13). Detta är den första i planta demonstration av snabba NH3 gasflöden i rötter, och som sådan, ger viktig preliminära bevis mot reda ut transportmekanism som ligger i hjärtat av NH3 / NH4 + toxicitet hos högre växter 2,13. Molekylär arbete i heterologa expressionssystem har visat att NH3 kan strömma via aquaporiner i växter 19, och data från figur 1, tillsammans med nyligen farmakologisk bevis har börjat bekräfta dessa fynd på samma nivå som den intakta organismen 13.
Figur 2 och 3 ger också utmärkta exempel på nyttan av att mäta enkelriktade flöden med radiospårämnen. Använda DI med 42 K +, kunde vi visa att jon-kanaler är inte ansvariga för steady-state K + + och hög NH 4 +, i motsats till modellsystemet Arabidopsis 14. Först när NH 4 + drogs tillbaka såg vi bevis för rekrytering av K + kanaler (figur 2). Även om nettoflödet av K + är också stimuleras av NH 4 + uttag (vilket framgår av ökad vävnads K + innehåll 14), endast genom att mäta enkelriktad tillströmning kunde vi avslöja omfattningen och snabbt insättande av detta fenomen. Dessutom, genom att bedriva DI mätningar med mutanter och farmakologiska medel, kunde vi identifiera vilka transportproteiner var inblandade. På samma sätt genom att tillämpa näringsmässiga och farmakologiska medel under övervakning spår utflöde (Figur 3), kunde vi karaktärisera och identifiera mekanismer för K + utflöde från korn rotceller 10. Sålunda tekniker såsom DIoch CATE kan bidra till förståelsen av transportegenskaper för kritisk macronutrient.
Som påpekas i protokollet, ofta positionen av provet i förhållande till detektorn i gammaräknare kan påverka mängden strålning mäts. Således, om en 1-ml prov "laddat" med 19 ml H2O, kan det räknas som uppmätts (cpm) i 20-ml prov vara betydligt lägre än i 1-ml prov, trots att de har lika mycket av radiotracer. Därför kan appliceras en D f för att korrigera för denna uppenbara "utspädning" av radioaktivitet. Denna fråga är ofta inte uttryckligen anges av tillverkarna av detektionsinstrument och måste utarbetas av den enskilde forskaren. På samma sätt kan effektiviteten av avskärmning inom detektorer mot omgivande strålning (dvs från närliggande prover inom disk) överdrivas av tillverkare, och sådana frågor bör utarbetasut för enskilda mätsystem.
En stor fördel av spårtekniken är dess icke-invasiv, vilket ger en möjlighet att mäta flöden, intracellulära pool storlekar och valutakurser under stationära förhållanden. Till exempel, med CATE, kunde vi icke-invasivt kvantifiera cytosoliska koncentrationer av K + (Tabell 1). Detta kan vara att föredra att alternativa metoder, såsom impalement av celler med jonselektiva mikroelektroder 18, som ger fysikaliska och möjligen kemiska störningar till cellen. Dessutom är spårtekniken unik genom att den ger en övergripande bild av flussmedel och uppdelning för hela organ och intakta växter. Detta är viktigt om man är intresserad av att förstå hela-växtnäringsdynamik, toxicitet, och i slutändan, prestanda i fält. Slutligen möjliggör radiospårmetoder för mycket känsliga mätningar som ska genomföras under relativt höga substratkoncentrationer. Tradinella utarmning experiment och mikroelektrodtekniker kan uppleva problem med bakgrundsstörningar och därmed kan kräva att den externa koncentrationen av substratet intressanta sänks långt under vad som föreskrivs under tillväxt. Detta kan vara problematiskt om en är intresserad av att studera "steady-state" betingelser av höga substratkoncentrationer (såsom med NH3 / NH 4 + toxicitet eller "högt-K +" betingelser, se ovan).
Det bör noteras att, som alla tekniker, mäta flöden med radiospårämnen är inte utan sina begränsningar. Exempelvis kan tillgängligheten av radiospårämnen vara problematiskt, särskilt för mycket kortlivade isotoper såsom 13 N, som kräver närhet till en produktionsanläggning, såsom en cyklotron. En annan stor begränsning är att ibland kan det vara svårt att skilja mellan flöden som sker över membran och de förekommande extracellularly. Sådana distinktioner kräver rigorös fas testar 7,10,20. När det gäller K + utflöde, först efter noggrann undersökning kunde vi bekräfta att steady-state 42 K +-frisättning från rötterna var inträffar inte över cellmembran med hög [K +] ext (> 1 mM) 10, men från extracellulära utrymmen (jfr figur 3). Sådana frågor kan lösas genom att undersöka effekten av ett brett spektrum av farmakologiska medel, eller genom termodynamiska analyser som har visat, till exempel att mycket höga Na + flöden redovisas under saltförhållanden skulle vara energimässigt omöjligt var de att gå vidare över cellmembranen 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
