Introduction
הספיגה וההפצה של חומרים מזינים ורעלים משפיעים במידה רבה גידול צמחים. בהתאם לכך, חקירתם של תהליכי העברה הבסיסיים מהווה אזור מרכזי של מחקר בביולוגיה צמח ומדעי חקלאות 1,2, במיוחד בהקשרים של אופטימיזציה התזונתית ולחצים סביבתיים (למשל, מתח מלח, רעילות אמוניום). ראשי בין שיטות למדידה והנתיבים בצמחים הוא השימוש בקליעים נותבים radioisotopic, אשר פותחו באופן משמעותי ב1950s (ראה, למשל, 3) וממשיך להיות בשימוש נרחב כיום. שיטות אחרות, כגון מדידה של דלדול מזין ממדיום השורש ו / או ההצטברות ברקמות, שימוש בmicroelectrodes רוטט יון סלקטיבי כגון MIFE (microelectrode יון הערכת שטף) וSIET (טכניקת אלקטרודה יון סלקטיבי סריקה), ושימוש של צבעי ניאון יון סלקטיבי, גם מיושמים באופן נרחב, אך הם מוגבלים ביכולתם לזהות שפעת נקיXES (כלומר, ההבדל בין הזרם וזרימה). השימוש ברדיואיזוטופים, לעומת זאת, מאפשר לחוקר את היכולת הייחודית לבודד ולכמת והנתיבים חד כיווני, אשר יכול לשמש לפתרון פרמטרים הקינטית (למשל, K M ומקסימום V), ולספק תובנות הקיבולת, האנרגטיקה, מנגנונים, ורגולציה, מערכות תחבורה. מדידות שטף חד כיווני שנעשו עם radiotracers הן שימושיות במיוחד בתנאים בהם השטף בכיוון ההפוך הוא גבוה, והמחזור של בריכות תאיות הוא 4 מהירים. יתר על כן, שיטות radiotracer לאפשר מדידות להתנהל תחת ריכוזי מצע גבוהים למדי, בניגוד לרבי טכניקות אחרות (ראה 'דיון', להלן), כי איזוטופ לייחס הוא ציין על רקע איזוטופ אחר של אותו היסוד.
כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים למדידת radioisotopic של חד כיווני וnנתיבי et של חומרים מזינים מינרלים ורעלים בצמחים שלמים. דגש יינתן על מדידת שטף של אשלגן (K +), הוא חומר מזין מפעל 5, ואמוניה / אמוניום (NH 3/4 NH +), חומר מזין אחר שהיא, לעומת זאת, רעילה כאשר קיימת בריכוזים גבוהים (למשל, 1 10 מ"מ) 2. אנו נשתמש ברדיואיזוטופים 42 K + (t 1/2 = 12.36 hr) ו13 NH 3/13 4 + (t 1/2 = 9.98 דקות), בהתאמה, בשתילים שלמים של השעורה מערכת מודל (L vulgare Hordeum NH .), בתיאור של שני פרוטוקולים עיקריים: זרם ישיר (DI) וניתוח compartmental על ידי זרימה נותב (קייט). אנחנו צריכים לשים לב מלכתחילה שמאמר זה פשוט מתאר את הצעדים דרושים כדי לבצע כל פרוטוקול. תערוכות שבו מתאים, הסברים קצרים על חישובים והתאוריה מסופקים, אבל מפורטת של כל טכניקהניתן למצוא רקע והתאוריה של 'בכמה מאמרי מפתח בנושא 4,6-9. חשוב לציין, פרוטוקולים אלה באופן רחב להעברה לשטף ניתוח של חומרים מזינים / רעלים אחרים (למשל, 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) ולמיני צמחים אחרים, אם כי עם כמה אזהרות (ראה להלן) . גם אנו מדגישים את החשיבות שכל חוקרי עובדים עם חומרים רדיואקטיביים חייבים לעבוד תחת רישיון מסודר דרך רגולטור בטיחות קרינה מייננת של המוסד שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 צמח תרבות והכנה
- לגדול hydroponically שתילי שעורה למשך 7 ימים בתא צמיחת אקלים מבוקר (לפרטים, ראה 10).
הערה: חשוב לשקול בחינת צמחים במגוון שלבי התפתחות, כמו דרישות תזונתי תשתנה עם גיל. - יום אחד לפני הניסוי, צרור כמה שתילים יחד כדי להפוך לשכפל בודד (3 צמחים לחבילה עבור DI, 6 מפעלים לחבילה לחברות בהסעדה). שתילי Bundle על ידי לפפה חתיכת צינור Tygon 2 סנטימטרים סביב החלק של בסיס יורה, ואבטחת צינורות עם קלטת כדי ליצור "צווארון".
הערה: מספר הצמחים לחבילה עשוי להשתנות בהתאם ל10,13,14 תנאי ניסוי. Bundling נעשה כדי לשפר את הסטטיסטיקה ואת דיוק מדידה, במיוחד כאשר מסת שורש ו / או בפעילות ספציפית היא נמוכה.
2 הכנת פתרונות / חומרי ניסיוני
תוכן "> הערה: הבא מבוצע בדרך כלל ביום 1 לפני ניסויים.- עבור DI, לאסוף את הדברים הבאים: טרום התיוג, תיוג, ופתרונות desorption (לפרטים, ראה 11), צינורות צנטריפוגה (לספין ייבוש של דגימות צמח), ובקבוקוני מדגם (לחומר צמחי ופעילות ספציפית [o S; ראה בהמשך]). לאוורר ולערבב את כל הפתרונות.
- לחברות בהסעדה, לאסוף את הדברים הבאים: פתרונות התיוג ובכן מעורב, סודה וelution (לפרטים, ראה 10), משפכים בזרימת, צינורות צנטריפוגה (לספין ייבוש של דגימות צמח), ובקבוקוני מדגם (לeluates, דגימות צמח, ו נחישות של o S וגורם לדילול [f D; ראה להלן]).
.3 הכן radiotracer
זהירות: יש לנקוט לפני העבודה עם רדיואקטיביות צעדי הבטיחות הבאה.
- ודא שהדרישות של radioacרישיון חומרים מופרז הם הבינו ואחריו. ללבוש ציוד בטיחות מתאים (כלומר, משקפי מגן, כפפות, מעבדה מעיל, אפוד / צווארון עופרת) ומד מינון (לדוגמא, טבעת TLD ותג). הגדר את ההגנה (כלומר, פרספקס ולבני עופרת) ולבצע את העבודה רדיואקטיביים מאחוריה. ודא שמונה גייגר-Müller קיים על מנת לפקח באופן שגרתי לזיהום.
- הכנת 42 K +
- מניחים כוס נקייה, יבשה על היתרה. אפס האיזון.
- הסר בקבוקון של נותב (20 MCI של 42 K 2 CO 3, בצורת אבקה) מהאריזה ויוצקים נותב לתוך הכוס. שימו לב למסה.
- 19.93 מ"ל פיפטה של DH 2 O, ואחריו 0.07 מ"ל של H 2 SO 4, לתוך הכוס. זה יניע את התגובה הכימית הבאה:
42 K 2 CO 3 + H (s) 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 2 SO 4 (יב) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - חשב את הריכוז של פתרון מניות רדיואקטיבי, בהתחשב במסה והמשקל מולקולרי של K 2 CO 3, והנפח (20 מ"ל).
הערה: אם עובד עם 13 NH 3/13 NH 4 + נותב מיוצר במאיץ חלקיקים באמצעות הפגזת הפרוטון של אטום החמצן במים (בדרך כלל וכתוצאה מכך 100-200 פעילות mCi, לפרטים ייצור, לראות 12). בגלל כמות 14 NH 3/14 NH 4 + היא נמוכה ביותר בפתרונות אלה, ריכוז N של פתרון המניות הוא זניח.
.4 זרם ישיר מדידה (DI)
- ל42 K +, פיפטה הסכום של פתרון מניות רדיואקטיבי נדרש כדי להתחבר לריכוז הסופי הרצוי של K + לתוך פתרון התיוג.
- ל13 NH 3/13 NH 4 +, פיפטה כמות קטנה (<0.5 מ"ל) לתוך פתרון התיוג. אפשר פתרון התיוג ולמערבב היטב (באמצעות אוורור).
- פיפטה תת מדגם 1 מ"ל של תמיסת תיוג לתוך בקבוקון מדגם ולחזור שלוש פעמים (4 דגימות בסך הכל).
- למדוד רדיואקטיביות בבקבוקונים (ב" ספירות לדקה ", עותקים לדקה), תוך שימוש בדלפק גמא. ודא שהדלפק מתוכנת כך שקריאות לדקה מתוקנות לריקבון איזוטופי (זה חשוב במיוחד עבור קליעים נותבים קצרים מועד כאמור).
- לחשב o S (מבוטאת -1 μmol עותקים לדקה) על ידי חישוב ממוצע הסעיפים של ארבע הדגימות (CPM מ"ל -1) וחלוקתו על ידי הריכוז של מצע בפתרון (μmol מ"ל -1).
- לטבול את שורשים בטרום תיוג פתרון (לא רדיואקטיבי) במשך 5 דקות, מראש לאזן צמחים בתנאי בדיקה (ראהלמשל, 10,13,14 לשינויים בזמן מראש תווית).
- לטבול את השורשים בתיוג פתרון (רדיואקטיבי) במשך 5 דקות.
הערה: פעמים תיוג יכולות להשתנות בהתאם לניסוי 3,4,7-10. - העבר את השורשים לפתרון desorption במשך 5 שניות כדי להסיר את חלק הארי של רדיואקטיביות דבקות-משטח. העבר את השורשים לתוך מבחנה שנייה של פתרון desorption למשך 5 דקות לשורשים ברורים נוסף של נותב תאי.
- לנתח ויורה נפרד, יורה בסיסי, ושורשים.
- מניחים שורשים בצינורות צנטריפוגה ודגימות ספין ל30 שניות במהירות נמוכה, צנטריפוגות בדרגה קלינית (~ XG 5,000) כדי להסיר לפני שטח ומים ביניים.
- לשקול שורשים (משקל טרי, FW).
- רוזן רדיואקטיביות בדגימות צמח (לירות, תירה בסיסי, ושורש; ראה שלב 4.2.1).
- לחשב את השטף. לחשב זרם לתוך הצמח באמצעות הנוסחא
Φ = Q L wt o * / S
שבו Φ הוא השטף(Μmol -1 שעות -1 ז), ש * היא כמות נותב הצטברו ברקמות (CPM, בדרך כלל בשורש, לירות, ולירות בסיסיים, משולב), o S היא הפעילות הספציפית של פתרון התיוג (μmol עותקים לדקה - 1), w הוא משקל השורש הטרי (ז), וL t הוא זמן התיוג (שעה).
הערה: חישוב מתוחכם יותר יכולה להתבצע לחשבון לזרימה נותב בו זמנית מהשורשים במהלך התיוג וdesorption, המבוססת על פרמטרים המתקבלים מקייט (ראה בהמשך, לפרטים, ראה 4).
.5 Compartmental ניתוח על ידי זרימת מדידת Tracer (קייט)
- הכן פתרון תיוג וo S המידה (ראה צעדים 4.1-4.2, לעיל).
- למדוד גורם לדילול (ו ד).
הערה: לעתים קרובות, את עמדתו של המדגם ביחס לגלאי בדלפק גמא יכולה להשפיע על הכמותקרינה שנמדד. ראה דיון לפרטים.- לאחר מדידת o S, להוסיף 19 מ"ל של H 2 O לכל דגימה (כגון שנפח סופי = נפח eluate = 20 מ"ל). רוזן רדיואקטיביות בכל דגימת 20 מ"ל (ראה שלב 4.2.1).
- לחשב f D על ידי חלוקת עותקים לדקה הממוצעת של דגימות 1 מ"ל על ידי העתקים הממוצע של דגימות 20 מ"ל.
- לטבול את השורשים בפתרון תיוג עבור שעה 1.
- הסר צמחים מצמחי פתרון תיוג והעברה לזרימת משפך, הבטחה שכל חומר השורש הוא בתוך המשפך. בעדינות צמחים מאובטחים לצד השני של משפך בזרימת על ידי יישום פס קטן של קלטת מעל צווארון הפלסטיק.
- בעדינות יוצק את eluate הראשון לתוך המשפך. הפעלת טיימר (ספירה קדימה).
- פתח את הברז ולאסוף את eluate בבקבוקון המדגם לאחר 15 שניות (הערה: זמן elution ישתנה, ראה להלן). סגור את הברז. בעדינות יוצק את eluate הבא לתוך המשפך.
- Repeaצעד לא 5.6 לשארית סדרת elution, העוקבת, מהראשון לeluate הסופי: 15 שניות (ארבע פעמים), 20 שניות (שלוש פעמים), 30 שניות (פעמיים), 40 שניות (פעם אחת), 50 שניות (פעם אחת), 1 דקות (25 פעמים), לתקופה elution כוללת של 29.5 דקות
הערה: סדרת Desorption יכול להשתנות בהתאם לתנאי ניסוי 7-10,13,14. - ברגע שפרוטוקול elution הושלם, צמחי קציר (שלבים 4.6-4.8, לעיל).
- רוזן רדיואקטיביות בeluates ודגימות צמח בדלפק גמא (הכפלת הקריאה עבור כל eluate ידי f D, לראות 5.2).
- שחרור עלילה נותב (ז עותקים לדקה (FW שורש) -1 דקות -1) כפונקציה של זמן elution. לתנאי מצב יציב, לבצע רגרסיות ליניארי וחישובים של נתיבים, זמן מחצית חיים של חליפין, וגדלים בריכה (לפרטים, ראה 6-9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג איזותרמות מצאו שימוש בטכניקת DI (עם 13 N), לזרם של NH 3 לשורשים של שתילי שעורה שלמים גדלו בגבוה (10 מ"מ) NH 4 +, וגם נמוך (0.02 מ"מ) או גבוה (5 מ"מ ) K +. איזותרמות להציג קינטיקה מיכאליס-מנטן כאשר NH 3 נתיבים הם זממו כפונקציה של NH 3 ריכוז חיצוני ([NH 3] שלוחה; מותאם על פי שינויים ברמת חומציות פתרון 13). NH 3 נתיבים היו גבוהים יותר משמעותי ב+ K נמוך יותר מאשר ב+ K גבוה. ניתוח של פרמטרים הקינטית מיכאליס-מנטן הראה כי K M נותר יציב יחסית בין הרמות + K (150 לעומת 90 μ M בנמוך וגבוה K +, בהתאמה), ואילו מקסימום V מצטמצם מאוד בגבוהה K + (לעומת 205 80 μmol -1 שעות -1 ז). לפיכך, הנתונים מצביעים על כך שregulat רמת K +es תחבורת חנקן (אפקט מקסימום V), אך לא על ידי תחרות ישירה בין K + וNH 3 לאתרי קישור של מובילים (השפעת K M). במקום זאת, K + יכול לווסת NH 3 נתיבים באמצעים אחרים, כגון באמצעות אפנון של פעילות aquaporin (לפרטים, ראה 13).
DI הוא גם שימושי עבור הלכידה של שינויים מהירים יחסית בזרם בשל משמרות תזונתיות, או ליישום של סוכנים תרופתיים. לדוגמא, איור 2 מדגיש פלסטיות המהירה של + -uptake מערכת K בשורשים של שתילי שעורה שלמים גדלו במתון (0.1 מ"מ) -K + וגבוה (10 מ"מ) -NH 4 + תנאים. כאן, אנו נצפו עליית% ~ 350 בK + זרם בתוך 5 דקות של נסיגת 4 + NH מהפתרון החיצוני. זה "אפקט אמוניום נסיגה" ("AWE") נמצא להיות רגיש לK + (+ TEA), בריום (Ba 2 +), וצזיום (CS +). באמצעות DI ומדידות אלקטרו בכמה גנוטיפים ארבידופסיס, היינו יכול בודאות לייחס את הרוב המכריע של AWE לשינויים בפעילותם של ערוץ ארבידופסיס K +, AtAKT1, וגבוהה הזיקה טרנספורטר K +, 14 AtHAK5.
איור 3 חלקות בזרימת יציבה של 42 K +, לאורך זמן, מהשורשים של שתילי שעורה שכותרתו מראש גדלו בנמוך (0.1 מ"מ) K + ומתון (1 מ"מ) NO 3 -. עקבות אלו מראות כיצד שיטת קייט יכולה לחשוף שינויים מהירים ומשמעותיים בזרימה על פי בקשתם של סוכנים תזונתיים / תרופתיים שונים. עיכוב משמעותי, מיידי של K + בזרימת נצפה על שני יישומים של 10 מ"מ Cs +, K + -channel חוסם, או עלייה חדהבK + הוראה (0.1-10 מ"מ). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים מולקולריים המתארים את המאפיינים הייחודיים של gating החוצה-תיקון K ערוצים + 15. לעומת זאת, יישום של 10 מ"מ NH 4 + במהירות ובעצמת גירוי K + בזרימת. השפעה זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההפעלה של + ערוצי K החוצה-תיקון באמצעות שלילת קוטביות של שיפוע הפוטנציאל החשמלי על פני קרום הפלזמה של תאי שורש 16, אשר ידוע להתרחש על כניסתה של NH 4 + 17. לפיכך, השימוש בשיטה זו, יש לנו כבר הצליח להדגים, בPlanta, שK + ערוצים לתווך בזרימת K + בשורשים של שעורה 10.
לבסוף, טבלת 1 מציגה פרמטרים קייט שחולצו ממדידות של מצב יציב 42 K + בזרימת ([K +] שלוחה = 0.1 מ"מ) בזרע שעורהlings גדל גם עם 1 מ"מ NO 3 - או 10 מ"מ NH 4 +, האחרון המייצג את תרחיש רעיל. NH 4 + המצב הגבוה מביא לדיכוי של כל K + והנתיבים, וירידה משמעותית בK + ריכוז cytosolic ([K +] CYT), אשר בדרך כלל נשמר homeostatically ב ~ 100 מ"מ בתנאי צמיחה בריאים 18 (כפי שנצפה , למשל, בטבלה 1, מתחת 3 NO - אספקה).
איור 1 13 NH 3 איזותרמות זרם חושפות כיצד K + אספקה מסדירה תחבורת חנקן. NH זרם 3 כפונקציה של ריכוזים שונים חיצוניים של NH
איור 2 4 NH מגרה + נסיגה משמעותית K בתיווך ערוץ + זרם. K + זרם במצב יציב, ועם נסיגה של NH 4 +, בשורשים של שתילי שעורה שלמים גדלו בנמוך (0.1 מ"מ) K + וגבוה (10 מ"מ) NH 4 +. ההשפעה של K + -channel חוסמי (+ 10 מ"מ TEA, 5 מ"מ Ba 2 +, ו10 מ"מ Cs +) על זרם K + מגורה מבוטאת. כוכביות מציינות רמות של משמעות שונות בין -NH 4 + וטיפול זוגות (* 0.01 <P <0.05, *** P <0.001; בכיוון אחד ANOVA עם ההשוואה מרובה של Dunnett פוסט הוקמבחן). כוכביות בסוגריים מציינות רמת המובהקות בין השליטה ו-NH 4 + זוג (-test t של סטודנט). ברים שגיאה מצביעים SEM של> 4 חזרות. (לשכפל מCoskun et al. קיבולת וגמישות של ערוצי אשלגן ומובילים גבוה זיקה בשורשים של שעורה וארבידופסיס. צמח Physiol. 162, 496-511 (2013).)
איור 3 K + בזרימת נמצאת תחת + תנאים-K נמוכים בתיווך ערוץ מצב יציב 42 K זרימה + בשורשים של שתילי שעורה שלמים גדלו בנמוך (0.1 מ"מ) K + ומתון (1 מ"מ) NO 3 -., ו ההשפעות המיידיות (בזמן t = 15.5 דקות, ראה חץ) של 10 מ"מ CsCl, 5 מ"מ K 2 SO4, ו -5 מ"מ (NH 4) 2 SO 4 בזרימה. כל חלקה מייצגת את הממוצע של 3-13 חזרות (SEM <15% מהממוצע). (לשכפל מCoskun et al רגולציה והמנגנון של שחרור אשלגן משורשי שעורה:.. בPlanta 42 K + ניתוח חדש Phytol 188, 1028-1,038 (2010)..)
| [K +] שלוחה | מקור N | זרם | בזרימת | שטף נקי | E: אני יחס | גודל בריכה | זמן מחצית חיים |
| (מ"מ) | (ז μmol -1 -1 hr) | (מ"מ) | (דקות) | ||||
| 0.1 | 1 מס '3 - | 7.22 ± 0.23 | 1.86 ± 0.18 | 5.36 ± 0.18 | 0.25 ± 0.02 | 98.84 ± 14.08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1.89 ± 0.13 | 0.57 ± 0.05 | 1.32 ± 0.10 | 0.30 ± 0.01 | 28.39 ± 3.40 | 32.50 ± 4.69 | |
.1 K מצב יציב השולחן + והנתיבים וגompartmentation תחת הוראות N שונות שטף מצב יציב וניתוח compartmental של שתילי שעורה גדל ב0.1 מ"מ K +, וגם אין מתון 3 -. (1 מ"מ, כמו מלח Ca 2 +) או גבוה NH 4 + (10 מ"מ, כSO 4 2 מלח). שגיאות מצביעות ± SEM של> 8 חזרות. (לשכפל מCoskun et al רגולציה והמנגנון של שחרור אשלגן משורשי שעורה:.. בPlanta 42 K + ניתוח חדש Phytol 188, 1028-1,038 (2010) וCoskun et al קיבולת וגמישות של ערוצים ואשלגן גבוה.. מובילי זיקה בשורשים של שעורה וארבידופסיס. צמח Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שמודגם בדוגמאות לעיל, שיטת radiotracer היא אמצעי רב עוצמה למדידה והנתיבים חד כיווני של חומרים מזינים ורעלים בPlanta. איור 1 מראה כי NH 3 זרם יכול להגיע מעבר לשעתי 225 μmol -1 גרם -1, שהוא אולי השטף הטרנסממברני תום הלב הגבוה ביותר שדווח אי פעם במערכת מפעל 13, אבל סדר הגודל של שטף זה לא יהיה גלוי לעין ולו רק נתיבים נקי נמדדו. סיבה לכך הוא בזרימת גדולה של NH 3 מתרחשת באותו הזמן כזרם, בתרחיש רכיבה על אופניים עקרים שיכול לגרום להערכה חסרה מובהקת של זרם שהולכת וגדלה עם תיוג זמן 13. ידי להשלים את הטכניקה נותב עם ניתוח אלקטרו, הצלחנו להוכיח כי בתנאים של איור 1, שני הזרם והזרימה של 13 N הוא בעיקר של הגז הניטרלי NH 3, ולא של conjugאכל NH חומצת 4 + (לפרטים, ראה 13). זה הוא ראשון בהפגנת Planta של נתיבי NH 3 גז מהירים בשורשים, ובתור שכזה, מספק ראיות ראשוניות חשובות לקראת התרת מנגנון ההעברה שנמצאת בלבו של NH 3 / NH 4 + רעילות בצמחים גבוהים יותר 2,13. עבודה מולקולרית במערכות ביטוי Heterologous הוכיחה כי NH 3 יכול לזרום דרך aquaporins בצמחים 19, והנתונים באיור 1, יחד עם ראיות תרופתיים האחרונות, החל לאשש ממצאים כאלה ברמה של האורגניזם שלם 13.
איורים 2 ו -3 גם מספקים דוגמאות מצוינות לשימושיות של מדידה והנתיבים חד כיווני עם radiotracers. באמצעות DI עם 42 K +, היינו יכול להוכיח שיון ערוצים אינם אחראים למצב יציב K + + וגבוה NH 4 +, בניגוד למערכת המודל 14 ארבידופסיס. רק כאשר NH 4 + בוטל עשה אנו רואים ראיות למעורבות של K + ערוצים (איור 2). למרות השטף הנקי של K + גם מגורה על ידי NH 4 + נסיגה (כפי שמוצג על ידי K רקמות מוגברים + תוכן 14), רק על ידי מדידת זרם חד כיווני היו אנו מסוגלים לחשוף את העוצמה והתפרצות מהירה של תופעה זו. יתר על כן, על ידי ביצוע מדידות DI עם מוטציות וסוכנים תרופתיים, היינו יכול לזהות איזה תחבורת חלבונים היו מעורבים. באופן דומה, על ידי יישום סוכנים תזונתיים ותרופתיים תוך מעקב זרימה נותב (איור 3), שהצלחנו לאפיין ולזהות מנגנונים של K + בזרימת מתאי שורש שעורה 10. לפיכך, בטכניקות כגון DIוקייט ביכול להיות אינסטרומנטלי להבנה של מאפייני תחבורה לחומר מזין קריטי.
כפי שצוין בפרוטוקול, לעתים קרובות את עמדתו של המדגם ביחס לגלאי בדלפק גמא יכולה להשפיע על כמות הקרינה שנמדדה. לכן, אם מדגם 1-ml הוא "עקף את" עם 19 מ"ל של H 2 O, הספירה נמדדה (CPM) במדגם 20 מ"ל יכולה להיות נמוכה יותר באופן משמעותי מאשר במדגם 1-מ"ל, למרות שיש את אותה כמות של radiotracer. לכן, f D יכולה להיות מיושמת על מנת לתקן עבור 'דילול' זה, לכאורה, של רדיואקטיביות. בעיה זו היא לעתים קרובות לא נאמר במפורש על ידי יצרנים של מכשור איתור וצריכה לעבוד על ידי החוקר הבודד. באופן דומה, את האפקטיביות של מיגון בתוך גלאים מפני קרינה סביבתית (כלומר, מדגימות סמוכות בדלפק) יכולות להיות מוגזמות על ידי יצרנים, וצריכה להיות עבדו סוגיות כגוןיצא למערכות מדידה בודדות.
יתרון עיקרי של הטכניקה נותב הוא לא הפולשנות שלה, המספקת אמצעים למדידה והנתיבים, גדלי בריכה תאיים, ובשערי חליפין, בתנאי מצב יציב. לדוגמא, עם קייט, אנחנו יכולים הלא פולשני לכמת ריכוזי cytosolic של K + (טבלה 1). זה יכול להיות עדיף על שיטות חלופיות כגון impalement של תאים עם microelectrodes יון סלקטיבי 18, אשר מקנה הפרעות פיזיות ואולי כימיות לתא. בנוסף, הטכניקה נותב היא ייחודית בכך שהוא מספק תצוגה מקיפה של נתיבים ומידור לאיברים שלמים וצמחים שלמים. זה חשוב אם הוא מעוניין בהבנת דינמיקת מזין צמח כולו, רעילות, וסופו של דבר, ביצועים בשטח. לבסוף, שיטות radiotracer מאפשרת למדידות רגישות מאוד ללהתנהל תחת ריכוזי מצע גבוהים למדי. Tradiניסויי דלדול tional וטכניקות microelectrode יכולים להיתקל בבעיות של הפרעות רקע ובכך, עשויים לדרוש שהריכוז החיצוני של המצע של עניין הוא הוריד הרבה מתחת שסיפק במהלך צמיחה. זה יכול להיות בעייתי אם אחד הוא מעוניין ללמוד תנאי "מצב יציב" של ריכוזי מצע גבוהים (כגון עם NH 3 / NH 4 + רעילות או תנאים "גבוהים-K +", ראה לעיל).
יש לציין כי, כמו כל הטכניקות, מדידה והנתיבים עם radiotracers היא לא בלי המגבלות שלה. לדוגמא, את הזמינות של radiotracers יכולה להיות בעייתית, במיוחד לאיזוטופים קצרים חיים מאוד כמו 13 N שדורשים קרבת מתקן ייצור כגון מאיץ חלקיקים. מגבלה העיקרית נוספת היא שלפעמים, זה יכול להיות קשה להבחין בין נתיבים המתרחשים על פני ממברנות וextracel מתרחש אלהlularly. הבחנות אלו דורשות שלב קפדני בדיקת 7,10,20. במקרה של K + בזרימת, רק לאחר בחינה מדוקדקת היו אנו יכולים לאשר שמצב יציב 42 K + שחרור מהשורשים היה מתרחש לא על פני קרום תא בגבוה [K +] שלוחה (> 1 מ"מ) 10, אבל מתאי רווחים (cf, איור 3). ניתן לפתור בעיות מסוג זה על ידי בחינת ההשפעה של מגוון רחב של סוכנים תרופתיים, או באמצעות ניתוחים תרמודינמיים, אשר הראו, למשל, כי נתיבי Na + גבוהים מאוד דיווחו בתנאים מלוחים יהיו במרץ בלתי אפשריים היו שהם להמשיך על פני קרום תא 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
