Introduction
大多数新感染艾滋病毒引起全世界通过异性性接触传染，女性占新发感染的47％，2011年（联合国艾滋病规划署1）。了解女性生殖道（FGT），主入口门户为HIV和其他性传染病原体之一，是的路径，寻找有效的策略，以防止感染的高度重视。在生殖器粘膜免疫应答是独特的清楚和从那些在外周血2测得不同。然而，在FGT免疫动力学的当前的知识是在最好的限定。迄今为止，黏膜免疫环境的研究主要集中在肠道相关淋巴组织（GALT），它已经很清楚，感染后粘膜组织中的早期事件，对后续的疾病进展3,4的强烈冲击。从生殖器粘膜采集样本代表一个巨大的挑战，并至少部分负责LACk的FGT的免疫学的理解。解决在不同的环境，是FGT就必须有效的方法从该地区采集和分析样品的情况下主机和病原体之间的免疫动态的难题。
在FGT被分成两部分：上部生殖道，包括输卵管，子宫内膜和宫颈管，下部尿路含有宫颈和阴道（由Kaushic评论等 5）。现在还不清楚是什么，这些不同的网站的相对贡献是艾滋病毒感染，但据信，这两个网站可能导致艾滋病毒进入6。 T细胞代表在上下生殖道的白细胞的40-50％，而巨噬细胞含有约10％（以罗德里格斯加西亚评论等 2）。 T细胞可以在阴道，子宫颈，子宫内膜和被检测到。巨噬细胞是更强烈的局部性ZED的子宫内膜和肌层结缔组织比子宫颈，虽然它们可以同时在组织中被检测到。最后，浆细胞样树突细胞（PDC）和朗格汉斯细胞也可以在FGT组织中检测到。表型和免疫人群及其易于感染艾滋病毒的比例可根据荷尔蒙周期变化重要的是，使用荷尔蒙避孕药，细菌性阴道炎，或性活动5,7-9的。
多种方法已经被开发，研究免疫人群的FGT和环境。宫颈活检，宫颈cytobrushes和宫颈阴道灌洗液（CVL）10-12是整个文献中最常用的。 CVL收集由PBS灌洗是最简单的方法，并允许免疫调节蛋白，但结果在极低的细胞产量的研究中，并因此不适合用于研究FGT 13的免疫细胞群。 CVL样品，另一方面，VERY用于通过测量用的方法，如ELISA，细胞因子微球阵列14或质谱15,16的各种细胞因子，趋化因子或抗微生物因子的表达评估FGT的免疫环境是有用的。免疫细胞频率，表型和功能特性可通过宫颈细胞刷或宫颈活检取样采集子宫颈单个核细胞（CMC）来实现。
宫颈活检取样是一种侵入性方法，其增加出血的不适和风险，需要2至11天治愈以下的步骤取决于女人12的免疫状态。另一方面，宫颈cytobrushes，尽管收集的细胞的产量较低，是一种微创的，更方便的方法来收集免疫细胞从FGT。这两种方法都可以达到的CD45 +白细胞中相同的产率，但是两个连续的子cytobrushes是必要的，得到的细胞相同数量的载一n一个活检13。然而，细胞刷取样仍然为进一步体外表型通过流式细胞仪14提供了细胞的可接受的数量（大约5,000的CD45 +细胞/细胞刷）。此外，功能特性，可以进行对这些样品，如刺激和细胞内流式细胞术定量PCR或已使用细胞刷衍生的CMC识别HIV特异性免疫应答17或Th细胞极化18执行。扩张性T细胞的人口也可方便与中医诊所19功能研究。
要注意的是活检和cytobrushes采样FGT不同的部分是很重要的。活检是从宫颈12,13的上皮和基质的优越部导出，而颈cytobrushes采样宫颈内口，收集从宫颈管和推测的转化区的上皮来源的细胞。因此，细胞刷样品品尝重新只园组成的柱状上皮单层的，而活检，包括由鳞状复层上皮衬里5的区域。其结果是，通过宫颈活检和细胞刷收集的白细胞种群的性质不同而不同。活检收集CD3 + T细胞的比例较高，而cytobrushes导致收集的CD14 +单核细胞/巨噬细胞13的比例较高。
研究FGT的免疫学一直是关注了很多年20-22，我们已经积累了大量的专业知识与细胞刷源性间中医诊所的研究。我们的研究重点主要在艾滋病病毒感染，感染和HIV阴性曝光（HESN）女性性工作者来自肯尼亚内罗毕的研究。优先病毒复制在活化的T细胞23和较低的数字活化细胞，可以由艾滋病病毒在FGT有针对性有助于防止感染HIV。根据这一假设，几个STUDI线ES形容HESN性工作者谁是高度暴露于艾滋病毒在较低的免疫激活但仍然未感染的24,25，和这个静态的表型是在FGT 14还观察到。在这里，我们描述的方法进行处理，并通过评估体外流式细胞仪来源于宫颈cytobrushes CMC样品中的T细胞活化。
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Protocol
伦理声明：曼尼托巴大学及内罗毕肯雅塔的国家医院/大学研究伦理委员会批准了这项研究，并签署知情同意从所有研究参与者获得。
媒体1。准备和CMC收集管
- 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（137.93 mM氯化钠，2.67毫米氯化钾，8.1毫米的Na 2 HPO 4，1.47 mM的KH 2 PO 4）。高压灭菌无菌。这可以被存储在4℃几个月。
- 预等分5毫升PBS入50ml Falcon管（每个样品1被收集），并在4℃储存直至样品收集时间。
- 标签每个样品2-4冻存管或1.5 ml离心管中，以收集灌洗液进行存储。
- 制备细胞培养基：RPMI 1640 +1％青霉素/链霉素/两性霉素B（终浓度为100单位/毫升，100微克/毫升和250纳克/毫升，respectiv伊利，没有FC / FB的补充。
细胞刷样品2。收藏
收集细胞刷样本是必须由一个受过训练的医师或妇科医生进行非侵入性的过程。
- 同时使用细胞刷和一个木制或塑料刮板收集宫颈单个核细胞（CMC）。通过将刮刀与周围的宫颈内口的旋转（ 图1）收集的CMC从下窥器检查参与者。将细胞刷入颈管口，旋转360°，并立即放置两个细胞刷和刮具入含有5ml的PBS 50ml的falcon管。
- 保持样品在冰/ 4℃，直到处理。为了保持细胞活力，处理样品在2小时内收集的。
- 如果可能的话，收集绿色的顶部肝素真空采血管的外周血单个核细胞（PBMC）中分离，作为一个比较器/控制CMC分析匹配的血液样本。
中医诊所3。隔离
在生物安全二级实验室进行样品处理，在无菌生物安全柜，双层手套。
- 在收集，中央军委样本可能被污染的血液。排除具有从研究可见血液污染的样品，以防止混淆列入PBMC的最终样品中。由于淋巴细胞管委会样本中分离出的低号，次血液污染可以很容易地压倒管委会淋巴细胞组成部分。
- 涡猎鹰管含有的细胞刷及刮刀45秒，从刷游离细胞。在此过程中样品可能成为泡沫状;这是正常的。
- 使用细胞刷刮任何遗留物质掉刮板，并丢弃刮成漂白剂溶液。收集剩余附着在刷/刮刀的任何单元格，使用新鲜的手套挤拇指和食指之间的刮刀。滑下刷，使细胞和PBS，并收集在同一个50ml管中。丢弃细胞刷成漂白剂溶液，并丢弃的手套。
重要提示：使用一个新的手套对每个样品。 - 适合100微米尼龙细胞过滤到新的50ml falcon管。使用移液管，收集从样品管中的PBS-细胞悬浮液，并通过过滤器到干净试管中进行过滤。
- 加入5 ml的RPMI 1640中，以原始样品管中。使用移液管，洗样品管的侧面与RPMI，并通过过滤器转移到新的收集管。洗尼龙过滤器的RPMI的底部为好。
- 离心样品10分钟，在514×g下。关键的是要在该步骤中离开离心机制动切断，以防止在CMC粒料撞出。
- 轻轻地从管取出上清液，注意不要打扰颗粒。颗粒大小会变化很大;在这样我的样品，将沉淀是由于大量上皮细胞的存在相当大的，而在其他情况下，将丸粒是勉强可见和高透明度。
- 由猎鹰管轻轻搅动悬浮颗粒。加入5毫升的PBS洗涤样品。
- 再次离心在514 XG没有离心制动器10分钟。
- 小心弃去上清液并重新悬浮沉淀如上述。这些细胞是准备或者冷冻保存（使用PBMC冷冻保存协议），刺激或流式细胞仪分型。
4，CMC表面染色和流式细胞仪
- 从在100μl封闭液的步骤3.10重悬沉淀并转移要么到96孔板或FACS管。封闭液（方框Fcγ受体）的配方如下：1.8微升小鼠IgG（最终浓度0.2微克/微升），5微升的FBS和93.2微升FACS洗涤液（PBS +2％FBS）中。染色可在96孔板中进行，如果粒料的大小是足够小的，但可能需要在FACS管中进行，如果颗粒是常规大。它相应滴定抗体是很重要的。
- 阻断样品在冰上/ 10分钟，在4℃下
- 在96孔板中加入100μlFACS洗涤液（PBS +2％FBS）中，或加入500μl在FACS管洗涤细胞。离心机在600×g下在4℃下10分钟，使用于低制动（或关闭，如果低速制动器设置是不可用的）。
- 除去上清液和重悬细胞沉淀通过搅拌。添加活力染色（现场死可以解决的可行性染料）。根据制造商的说明制备的可行性染料。它可能需要被滴定为在每个实验/流式细胞仪的设置使用。孵育在黑暗中30分钟，在4℃下
- 洗涤细胞100μl/500微升PBS（对于96孔板/ FACS管）。离心600×g离心10分钟，低/无刹车。删除supernatan吨，重悬细胞。
- 孵育细胞表面标记的抗体的混合物，在100微升的总体积。重要提示：优化和滴定样品染色前各流式细胞仪面板。孵育细胞在黑暗中30分钟，在4℃下
- 重复步骤4.5。如果染色在96 - 孔板中，细胞转移到FACS管中，并稀释至750微升FACS洗涤的含1％多聚甲醛（PFA）的最终体积（或CytoFix，稀释1中4）。进行数据采集的流式细胞仪。
5，收集和宫颈阴道灌洗的制备（CVL）
- 此前细胞刷取样，用注射器2毫升无菌PBS冲洗宫颈内口和阴道后穹窿吸出灌洗。
- 吸气式灌洗样品收集到15毫升猎鹰管并保持在冰上/ 4℃，直到处理。
- 在400×g离心7分钟，以除去细胞碎片离心样品。
- 合作llect上清液，等分试样的样品为1毫升或500微升的等分试样，并储存于-70℃。等分可以解冻ELISA或CVL蛋白微球阵列分析，但要避免多次冻结/解冻周期。
- 如果需要的话，重悬细胞碎片的沉淀物中的RNA后来由以下制造商的方案来测量RNA表达。
6，数据采集
- 准备一套补偿管的抗体面板相匹配。运行补偿管调节光谱重叠。运行样品上的任何多色流式细胞仪被配置在面板中使用的荧光标记抗体。
- 首先获取PBMC样本调整前向散射（FSC）和侧向散射光（SSC）电压，以检测淋巴细胞群。尽量让他们在100上每个轴的线性刻度。运行PBMC控制将使显著更容易找到管委会淋巴细胞群。
- 对于CMC样品FSC的门槛可能需要相对增加至因涂抹了SSC轴在低FSC值PBMC样品。
- 收购之前，每个涡管。获得整个管最大化收集淋巴细胞门事件的数目。监控机器小心，以免堵塞。
- 将数据导出到流式细胞仪分析程序，如FlowJo。
7，门控策略
- 选择正向侧向散射高（FSC-H）/正向侧向散射面积（FSC-A）来确定单人口。
- 选择时间与荧光标记（如例如FITC）来控制收购质量。变化的流量可能引入的数据失真。排除显示差异流速的任何区域。
- 标识上SSC-A/FSC-A情节淋巴细胞群。用PBMC控制，以方便识别。需要注意的是管委会淋巴细胞群可能不一样清晰的PBMC控制。</ LI>
- 门上SSC-A/viability染料排除死细胞与活细胞。死细胞可以非特异性结合的抗体，其中将介绍文物。
- 门上的SSC-A/CD3识别的T细胞群体。从这个门，确定CD4 +和CD8 +的人群。
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Representative Results
多参数流式细胞仪是一种功能强大的工具来剖析细胞亚群的表型和功能在以前未知的组织。 CMC样品的分析可以产生两个淋巴细胞和单核细胞的人口信息与相应的门控策略。
一位代表中央军委门控策略，相比匹配的PBMC轮廓， 如图2，FSC-A与FSC-H的情节使得细胞双峰，这是非常普遍的CMC样品相比，外周血单个核细胞的排斥，甚至是过滤后（ 图2A）。质量控制包括由选通时间，在那里由于样品团块改变流量或伪像可以容易地确定（ 图2B）去除的流程问题。淋巴细胞/单核细胞群体的鉴定是在两个PBMC和CMC的样品（ 图2B）相对类似。排除死细胞的活力染料防止夹杂物的凋亡细胞具有非特异性吸收的荧光标记抗体。生存能力较低的CMC样品相比，外周血单个核细胞，并且可以高度变化从样品来样（ 图2B）。
这种分析将集中在表型分型T淋巴细胞人口，但CMC样品中还含有单核细胞。门上的单核细胞群后，将细胞基础上的可行性染料和转储通道（ 图3A）进行门控。转储通道包含抗CD56，CD3和CD19，和门上的转储通道阴性细胞将消除任何污染的淋巴细胞在单核细胞群体。细胞然后可以根据标记物，如CD16和CD11c的表达鉴定。的CD3 +淋巴细胞群体通常是减少在CMC中的比例相比，PBMC（ 图3B，表1）。高比例的上皮细胞，粒细胞和非CD3 + CD45 +含有CMC样品中白细胞ðominates过的T细胞群体。 CD4 + T细胞（中位数为55.30％，IQR为：50.53％-68.18％）和CD8 + T细胞（中位数为25.60％，IQR为：21.50％-33.80％）被发现在一个较低的比例（接近到2:1之间CMC）相比于5:1的比例从肯尼亚（ 图3C，表1）商业性工作者人群健康的外周血单个核细胞样本中观察到。如血液，HIV感染影响CD4之间的CMC +和CD8 + T细胞的比例，降低了CD4 +：CD8 +比值0.7（中位数：0.7，IQR：0.31-2.45）（ 图3C中，表1）。然而，这种情况并不少见，观察来自健康个体（ 图3C）CMC的人群中有较高比例的CD8 + T细胞。有趣的是，扩大的CD4-CD8-（双重否定，DN）的T细胞群体相对于外周血单个核细胞的DN T细胞频率可以HIV阴性的个体（ 表1）许多CMC样品中观察到。这些结果是类似为包皮样品26，本书虽然获得唉这些细胞的特征较差。
典型的T细胞表型标记很容易量化的CMC之间，但可能与外周血单个核细胞; 图4展示了CD8 + CD161 +（MAIT）的人口是在外周血单个核细胞不同，但在中医诊所几乎不存在（ 图4A）的标识。的活化标志CD69和HLA DR，迁移标记的CCR5或疲惫标记的PD-1可以清楚地识别上的CD4 +或CD8 +群（ 图4B）的表达。
的细胞因子/趋化因子在CVL浓度的定量可以在与CMC染色并行进行分析。这使得债权人自动清盘细胞因子环境（促炎症与免疫调节）和中医诊所的表型之间的相关性。这些数据也可以被用来确定上的CMC趋化因子受体表达的频率是否与任一等离子体或CVL趋化因子14的相对表达。 表2 </ STRONG>表示在CVL从健康妇女收集和MILLIPLEX细胞因子磁珠阵列试剂盒检测细胞因子和趋化因子的分析物的平均浓度。
图1。解剖女性生殖道的。女性生殖道，可见阴道的关系，宫颈外口，宫颈管及子宫腔的宫颈B）前角视图，显示了外口，与前，后穹窿的）剖视图，各地区在12:00至6:00分别。转载自REUSCH 等[27]的权限。宫颈刮具绕宫颈旋转以收集CMC，而细胞刷插入子宫颈管和旋转，以收集额外的CMC。宫颈阴道灌洗液（CVL）通过洗涤宫颈部位用PBS和从后穹窿收集它被收集。
图2。门控和CMC样品的质量控制。 A）单峰通过FSC-A与FSC-H情节鉴定证明汗衫的CMC样品中的比例较低相比，PBMC样品，即使在高，质量差的样本过滤器为基础的CMC隔离B）的实例示好品质控制步骤。的时间与荧光（或SSC / FSC）的选通可以识别流率的问题和用于排除可能会导致染色的工件的事件。基于FSC与SSC甲淋巴细胞群体可能或可能不容易识别取决于样品。一个可行性染料包容是至关重要的，因为有些样品可能含有少于50％的活细胞。 Viabili性（胺反应性）染料染色的死细胞比活细胞更明亮，由于膜的完整性因细胞死亡损失允许染料进入细胞内的蛋白质的胺基团。因此，活细胞识别门上的可行性染色阴性的人群。
图3。鉴定的T细胞亚群。 A）CMC样品中的CD3 +人口通常是淋巴细胞门的一个较小的比例相比，PBMC样品。 CMC的样品也更可变的T细胞群体的大小，如图B）CD4 +，CD8 +和CD4-CD8-T细胞群很容易在两种CMC和PBMC样品识别。 CD4：CD8 + T细胞的比率可以从样品而异的CMC中取样，如图所示。显示的数据是从艾滋病病毒未感染的妇女收集。
图4。T细胞表型的CMC样品中。 A）粘膜相关不变T细胞（MAIT）的CD8 + CD161 +人口，很容易PBMC样品中确定是在中医诊所几乎完全缺席。的CD8 + CD161 + T细胞可能在两个样品中被发现的。的表型标记包括CD69，HLA DR，CCR5和PD-1 B）的CMC展览表达。基于荧光减一（FMO）控制门被吸引。显示的数据是从艾滋病病毒未感染的妇女收集。
| 中医诊所 | 外周血单个核细胞 | |||||
| 人口 | HIV +（N = 34） | HIV-（N = 44） | P值为一 | HIV +（N = 28） | HIV-（N = 35） | P值为一 |
| 中位数（IQR） | 中位数（IQR） | 中位数（IQR） | 中位数（IQR） | |||
| ％活细胞 | 85.65（60.25-92.63） | 88.70（74.85-95.38） | 0.1193 | - | - | |
| ％CD3 +活淋巴细胞门 | 5.94（0.90-16.80） | 1.44（0.39-8.46） | 0.0303 | 41.15（17.08-62.10） | 41.90（20.40-51.30） | 0.4231 |
| p 值 b | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| ％的CD8 +的CD3 +门 | 43.20（25.75-66.00） | 25.60（21.50-33.80） | 0.001 | 30.05（22.75-38.78） | 14.60（8.01-24.80） | <0.0001 |
| p 值 b | 0.0291 | <0。0001 | ||||
| ％的CD4 +的CD3 +门 | 31.10（20.45-63.10） | 55.30（50.53-68.18） | 0.0003 | 56.10（50.10-61.28） | 77.20（65.90-92.80） | <0.0001 |
| p 值 b | 0.002 | <0.0001 | ||||
| 比例的CD4：CD8 | 0.71（0.31-2.45） | 2.09（1.55-3.01） | 0.0003 | 1.92（1.44-2.39） | 5.34（2.66-10.77） | <0.0001 |
| p 值 b | 0.004 | <0.0001 | ||||
| ％DN中CD3 +门 | 10.40（6.36-14.30） | 10.70（6.76-19.10） | 0.4793 | 9.58（6.65-15.98） | 7.01（5.26-8.07） | 0.0032 |
P值| 0.8338 | 0.0006 | | ||||
表1中的CMC和外周血T细胞亚群的相对比例 。从44 HIV阴性和34 HIV阳性的女性性工作者和PBMC样品35 HIV阴性和28个艾滋病毒阳性比较了活细胞的相对比例CMCsamples，CD3 + T细胞和CD4 +，CD8 +和CD8-CD4-DN T细胞亚群。数据以中位数（25 日 -75 日四分位数间距，IQR）。组之间的差异，计算通过Mann-Whitney检验。 P值表示一个 HIV阳性和艾滋病病毒或 b CMC和PBMC中的数据进行比较的结果。
| 分析 | 意味着 （标准偏差）。 | |
| 皮克/毫升 | 皮克/毫升 | |
| MIP-3A | 35.5（90.6） | 2.9 |
| MIG | 1447（3026） | 19.4 |
| ITAC | 2.7（6.3） | 0.8 |
| fractalkine的 | 51.6（69.5） | 10.6 |
| IFN-A2 | 24.0（12.0） | 40.6 |
| IFN-G | 3.9（14.2） | 0.3 | IL-1α | 268.4（721.3） | 6.4 |
| IL-1B | 46.8（126.2） | 0.7 |
| 白细胞介素-1受体拮抗剂 | 4967.0（3597） | 5.5 |
| IL-2的 | 0.9（2.6） | 0.6 |
| IL-6的 | 14.8（30.5） | 0.7 |
| IL-7的 | 6.3（10.1） | 0.1 |
| IL-8的 | 1491（2126） | 0.3 |
| 4.5（8.6） | 0.5 | |
| IL-15的 | 1.4（2.7） | 0.7 |
| IL-17的 | 1.1（2.2） | 0.3 |
| IP-10 | 381.4（1100） | 2.2 |
| MCP-1的 | 129.4（340.4） | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9（7.1） | 3.7 |
| MDC | 84.2（94.6） | 6.9 |
| MIP-1α 20.9（28.9） | 6.4 | |
| MIP-1B | 28.5（42.6） | 8.9 |
| sCD40L的 | 10.8（19.3） | 9 |
| 中sIL-2Rα的 | 8.4（9.8） | 7.7 |
| TNF-α的 | 1.9（4.1） | 0.1 |
表2。表达细胞因子和趋化因子在CVL的。从女性性工作者人群在月经中期周期的51艾滋病毒未感染（非HESN）参与者样品测定使用MILLIPLEX MAP人细胞因子/趋化因子珠细胞因子/趋化因子浓度根据制造商阵列试剂盒的隔夜协议，测定一式两份。干扰素：干扰素; MCP：单核细胞趋化蛋白; MDC：巨噬细胞衍生的趋化因子，S：易溶;肿瘤坏死因子：肿瘤坏死因子; MIP：巨噬细胞炎性蛋白; ITAC：干扰素inductible T细胞的α趋化; MIG：单核因子诱导γ干扰素; IP-10;干扰素inductible蛋白质。 一个数值低于检测限被分配检测的一半极限值。
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Discussion
面对庞大的知识差距的相对免疫力在女性生殖道（FGT），中医诊所的表型分析可以提供见解的各种各样成多个淋巴细胞群在子宫颈。再加上蛋白质组分析及在宫颈灌洗病毒载量的测量，抗干扰性性传播感染（STI）s和其他病原体可在解剖不同人群。
技术因素-中医诊所：隔离和CMC样品成功染色是具有挑战性的。在CMC收集协议的优化强调第一收集CVL的有效性，随后宫颈刮具，然后最终的细胞刷。它相比，这些计算由于样品排斥对于各种原因的可能性增加外周血研究，讨论如下，以增加计划样本量是重要的。
欲望的测试d流板上的CMC样品是研究开始之前的关键。它来监控细胞的自体荧光的CMC样品中，特别是在单核细胞的门是重要的。 CMC的自身荧光在一些通道可以相比的PBMC可升高，这可能影响选通和信号 - 噪声比。此外，最佳的电压应为CMC样品进行确认，如果以前对PBMC样本来确定。
为了保持数据的完整性，以排除有血液污染或混淆性传播疾病样本是很重要的。在流式细胞仪面板上的流进一个细胞活力染料是至关重要的，以排除死细胞，非特异性占用荧光抗体。而大多数样品是高度可行的，这种情况并不少见通过生存能力染料排除细胞的10-20％。如果根据CD4和CD8的表达子集分析，计划，重要的是，以获得至少100 CD3 +事件进行分析。从不同的女性收集的样本，甚至来自同一个女人吨不同时间点，可以产生完全不同的手机号码13。
粘膜淋巴细胞的流式细胞仪分析往往更容易和更成功的，如果一个PBMC对照样品可以同时与CMC样品运行。在某些CMC样品，淋巴细胞群是难以识别由FSC / SSC设门，但列入PBMC样品会给一个更好的主意在哪里大门。即使在没有一个明确的淋巴细胞FSC / SSC人群样本，不同的CD3 +群体可以被识别。如果数据采集是由技术问题（流式细胞仪摄入堵塞，气泡等），门上的荧光随着时间的推移中断可以删除数据收集的文物，同时还允许样品分析。适当的控制，例如荧光减去1（FMO）管栅极的位置，可能需要对外周血单核细胞（PBMC）进行时所需的细胞数目过大量使用细胞刷样本。
ontent“>多个研究已经证明的CMC样品中抗原 - 特异性T细胞应答的检测。CMC细胞因子的产生，也可以由PMA /离子霉素，PHA，IFNγ和抗-CD3刺激。其中CMC刺激的主要限制是诱导细胞数，从而降低了的条件下，并且可以为每个样本进行控制的数量，这也是非常重要的仔细监视和采取额外的步骤，以防止细胞培养污染。的生殖道是不是无菌的网站，并在某些情况下额外的抗生素必须加入到培养基中，以防止细菌过度生长。虽然中医诊所可与活力损失小冷冻保存，恢复约50％，使得冷冻保存的样品可怜的候选人寻求刺激的研究，除非细胞扩张计划10。技术因素- CVLS：收集CVL的通常会导致有限的样品体积梅子，防止了大量的蛋白浓度通过重复ELISA分析。另一种分析方法是细胞因子微球阵列，基于Luminex公司的平台或流式细胞仪平台上。复用的试剂盒可从多个商业来源获得，允许高达30分析物在一个非常小的样品体积（通常〜25微升）进行量化处理。这些分析的优化揭示的分析物的最佳检测用过夜培养协议。一些分析物是可检测的血浆/血清样品中没有可检测的CVL。值得注意的是，使用离心柱CVL样品的浓度并未改善检测的任何分析物，这表明没有任何益处样品浓度之前运行的微珠阵列测定。
具体到生殖器粘膜的混杂因素：FGT免疫学研究必须照顾到承认并考虑尽可能多的混杂因素的可能。月经周期ħ作为现在被证明影响外周血免疫28，并有可能施加在CMC的表型和细胞的组合物更大的影响，以及从CVL样品29收集到的蛋白质。同步样品采集到月经周期是首选的方式，以减少数据的变化，雌激素/孕激素水平或天自去年月经的第一天是否计量。使用荷尔蒙避孕也极大地影响了黏膜环境及其效应应在设计或分析的研究时，必须考虑到。导致细菌性阴道病（BV）的阴道菌群的改变也会改变免疫环境和细胞表型。 BV可以通过革兰氏染色来诊断和Nugent的得分可以建立控制为BV公司的混杂影响。
性生活也有外阴免疫学产生深远的影响，因为异体反应，精液可诱导CEL急剧的变化升型和贩运。的确，拉茹瓦等所描述的性工作者和非性工作者人群之间的差异在CVL蛋白质组成，具有性工作开始后发生在最初几年的变化。
最后，文化习俗，如冲洗将推出进一步变化为粘膜采样。根据所使用的（漂白剂，洗涤剂，柠檬汁等）的试剂，冲洗可以减少细胞群中的频率/表型，或改变自发荧光相对于其他的样品。理想的情况下，以细胞刷取样前应冲洗捐助者之间进行劝阻。
未来的应用：除了在月经/荷尔蒙的变化，病毒/细菌感染和前/绝经后，黏膜样本的分析是特别相关，对性传播疾病/病原体的黏膜疫苗研究产生重要的洞察黏膜免疫的调节。在艾滋病毒的情况下，其中疫苗研究的主要目的是引起粘膜抗体或T细胞反应，中央军委为基础的检测发展将在确定保护相关因素起到了至关重要的作用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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