Summary
Overfladeplasmonresonans (SPR) er en etiket-fri fremgangsmåde til påvisning af biomolekylære vekselvirkninger i realtid. Heri en protokol for et membranprotein: er receptorinteraktion eksperiment beskrevet, mens diskutere fordele og ulemper ved teknikken.
Introduction
Protein-protein interaktioner (PPI); dannelse og dissociation af protein komplekser, er centrale begivenheder i mange biologiske processer (f.eks, replikation, transkription, translation, signalering, celle-celle kommunikation). Semi-kvantitative undersøgelser af PPI udføres ofte ved hjælp af pull-down eller immunopræcipitation eksperimenter. Imidlertid er disse (og lignende) teknikker begrænset i området affiniteter, der kan måles (lav mikromolær og højere affinitet) på grund af de vasketrin, der er uløseligt forbundet med sådanne teknikker. Sådanne "end-point" teknikker kan ikke identificere forbigående eller lav affinitet interaktioner, der ofte er store biologiske konsekvenser. Desuden er den tidsmæssige opløsning af sådanne tilgange yderst begrænset, normalt størrelsesordener langsommere end satserne for reaktionen. SPR overvinder disse mangler på grund af sin øget følsomhed og overlegen tidsopløsning 1,2. SPR er en etiket-fri metode, og som sådankan måles molekylær interaktion (så længe som det kan påvises masseændringer). Foruden PPI, er det blevet udstrakt anvendt til at karakterisere protein-ligand, protein-lægemiddel (eller lille molekyle), protein-DNA og protein-RNA interaktioner 3-5. Resultaterne registreres og afbildes i realtid, hvilket muliggør hurtig ændring af eksperimentelle betingelser og fleksibel eksperimentelle design.
Det fysiske princip bag SPR instrumenter er udnyttelsen af et optisk system, som måler en ændring i brydningsindekset på sensoroverfladen ved masseændringer 2. En af de interagerende partnere (herefter ligand) immobiliseres på en polymermatrix chip og det andet molekyle (herefter analyt) er strømmet hen over overfladen. Analytbinding til liganden ændrer masse på chip overfladen. Denne masse ændring direkte proportionalt relateret til ændringer i brydningsindeks af overfladen. Resultaterne er afbildet i realtid ogpræsenteres som responsenheder (RU) som en funktion af tid. Et sådant plot betegnes en Sensogrammet (f.eks, figur 1). Da SPR følger den fuldstændige tidsforløbet for interaktion, er præ-ligevægts kinetiske hastighedskonstanter afledt ud til ligevægt tilhørsforhold. Som beskrevet nedenfor, før ligevægt opførsel af et givet system, holder mange oplysninger, og giver en meget anderledes perspektiv end ligevægt alene. Når systemet er kalibreret, eksperimenter er meget hurtigt og kræver kun små mængder protein materiale (mikrogram til nanogram beløb). Indsamling fuldstændig kinetiske oplysninger om et givet system kan opnås i dage. Den høje følsomhed SPR giver målinger, der ikke er muligt ved hjælp af en hvilken som helst anden teknik 6. Men denne høje følsomhed er en "tveægget sværd", da det kan være en stor kilde til falske positive data. Enhver faktor, der påvirker den reflekterende indeks registreres og afbildes på Sensogrammet. Som sådan apaf en hensigtsmæssig kontrol skal anvendes til at eliminere falske-positive, og støtte fra komplementære metoder er meget anbefales.
Figur 1 illustrerer udviklingen af et SPR-eksperiment under anvendelse af en NTA-overtrukne sensor chip. Sensogrammet i panel A viser indsprøjtningen af nikkelioner over NTA matrix (usubtraheret data), og panelerne BD vise dataene efter subtraktion af signalet afledt fra den negative kontrol celle. Rød og blå pile viser injektion start og slut, hhv. Immobilisering af liganden på chippen gradvist ændrer massen indtil injektionen er afsluttet. Den stabile plateau observeret efter afslutning af ligand indsprøjtning afspejler stabil association af liganden til overfladen (figur 1B, cyklus 2). Når en stabil basislinie er opnået en buffer injiceres over liganden og henvisningen celle (figur 1B, cyklus 3) .Dette injektion tjener som en blank kontrol ", og vil væretrækkes under analyse. Ved injektion, registreres mindre ændringer, som afspejler en strøm af masse gennem chippen. Derefter i en separat cyklus (figur 1B, cyklus 4) analytten injiceres; den gradvise stigning i RU repræsenterer analyt associering til liganden. De bindingssteder bliver gradvist besat indtil der er ligevægt. Så snart injektion ender, et fald i jernbanevirksomhederne afspejler kompleksets dissociation. Fra sådanne sensogrammer pre-ligevægts og ligevægt hastighedskonstanterne kan afledes (se senere). Figur 1 viser en forbigående interaktion mellem liganden og analytten. Når samspillet er mere stabil, nedgangen i jernbanevirksomhedsplan er langsommere, hvilket afspejler en lavere k d.
Heri beskriver vi en SPR eksperiment formål at karakterisere vekselvirkningen mellem en membran transporter (detergent solubiliseret) og dens funktionelle partner, dets kognate substratbinding protein 6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassette (ABC) transporter, ModBC-A i Archeaglobus fulgidus. Dette system blev valgt for sin meget reproducerbare resultater, højt signal-støj-forholdet, og klassisk 'on / off' priser. Derudover er tilgængelige til at fungere som vigtige negative kontroller homologer ABC transportører. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved anvendelse af detergent, renset og immobiliseret på chippen. Dens opløselige interagerende partner, Moda, er analysanden. Som en negativ kontrol ligand, er en anden ABC transportør RbsBC anvendes ("ligand B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein Sample og Buffer Fremstilling
- Prøvefremstilling: oprense proteinerne af interesse, og at alle aggregater er fjernet, ved at injicere proteinet forud for forsøget på en gelfiltrering kolonne eller ved ultracentrifugering (sædvanligvis 10 minutter ved 100.000 xg er tilstrækkelig).
BEMÆRK: Selvom ønskelige yderst rent proteinpræparater er ikke et must. SPR held har været anvendt med mindre end perfekt oprensninger og selv med total ekstrakt 8,9. - Buffer forberedelse:
- Forbered buffer af eksperimentet (betegnet "running buffer" eller RB). For protokollen beskrevet her, bruger 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,05% (w / v) DDM (n-dodecyl β-D-maltosid). Husk, at valget af puffer sammensætning kan let modificeres i overensstemmelse med den undersøgte system.
- Filtrere alle buffere og proteinprøver der bruger 0,22 um filtre. Sørg på forhånd, at filtrene er protein-kompatible. I almindelighed, for nylig markedsført SPR platforme indeholde en in-line de-Gasser; hvis dette ikke er tilfældet, de-gas bufferne før brug.
- Dialyse natten over eller fortyndet prøverne mod RB for at undgå buffer uoverensstemmelser. Dialyse (eller enhver anden metode buffer exchange) er især tilrådeligt, når brug af kemikalier med høj viskositet (fx saccharose, glycerol, DMSO). Før tilslutning af RB flaske til pumpens indløb holde til side 10 ml af RB i et separat rør.
- Fortynd det koncentrerede ligand lager i RB til en slutkoncentration på ~ 20 ug / ml. Som en tommelfingerregel, til stabil ligand immobilisering, bruger lave ligandkoncentrationer med længere injektioner ved lavt flow, i modsætning til høje koncentrationer, højt flow og kortere injektioner.
- Fortynd analytten i RB til den ønskede koncentration. Typisk teste koncentrationsområde for et system af ukendt affinitet fra 10 pm til 10 nM i Tifoldsfortyndinger. Start altidmed lavere koncentrationer først.
2. Sensor Chip
- Chip valg: Brug en nitrilotrieddikesyre (NTA) koblet chip er egnet til at indfange proteiner med en oligo-histidinmærke.
- Chip brug:
- Når du bruger en ny chip, tage chippen ud fra skeden, skylles forsigtigt med dobbelt destilleret vand (DDW), tørre omhyggeligt resterende væsker ved hjælp af sarte vinduesviskere, og sørg for ikke at røre ved guldlag overflade. Placer chip tilbage i skeden i den korrekte orientering (indsættelse er glat, når chippen er korrekt placeret).
- Når genbrug en chip, tage den lagrede chip fra bufferen, skylles grundigt med DDW og tør forsigtigt som anført ovenfor, og anbringes i sin oprindelige kappe.
BEMÆRK: akkumulering af ikke-specifik junk materiale på chippen kan påvirke sin »levedygtighed«. Dette kan overvåges ved at sammenligne jernbanevirksomheder før ligand immobilisering og efter stripning. Selvom mange målinger kangøres ved hjælp af samme NiNTA chip, spørgsmålet om dens levetid er ikke en "entydig" og varierer meget mellem de forskellige chips.
- Chip docking: Åbn sensorchip døren og placere chip i sin kappe. Når du bruger en ny chip, indtaste chippen serienummer holde brugen rekord. Luk døren og tryk på 'dock chip «.
3. temperaturindstillinger
- Indstil chip celle temperaturen til 25 ° C (eller den foretrukne eksperiment temperatur).
- Valgfrit: indstil prøver rum til 7 ° C for at holde proteinerne stabilt under hele forsøget.
4. Løsninger til læsning og Stripping
Forbered følgende løsninger til lastning og afisolering: 0,5 mM NiCl2 i RB, 350 mM EDTA i RB (tilføj rengøringsmiddel til EDTA-opløsning til en endelig koncentration som i RB), 0,25% SDS i H 2 O, og 100 mM HCI i H 2 O. Ved brug af mikro-centrifuge badekares og ikke SPR udpegede rør, så glem ikke at afskære hætterne af rørene.
5. Prime SPR instrumentet med RB
6. Start en ny kørsel
- Indstil strømningshastighed, som vil blive anvendt under eksperimentet. For at opnå de resultater, der er beskrevet her indstille flowet til 50 pl / min.
BEMÆRK: Denne parameter kan ændres under eksperimentet. - Definer strømningsvejene og henvisning subtraktion. For at opnå de resultater, der er beskrevet her, der er stierne Fc = 1 og FC = 2, subtraktion Fc = 2-1.
BEMÆRK: Programmet vil vise i realtid subtraktion af to målte celler. Husk, at denne parameter ikke kan ændres under eksperimentet. - Vælg den passende stikprøve rack (det kan påvirke volumen forbrug prøven).
- Gemme resultaterne filen.
7. Eksperiment Cycles
Hvert eksperiment er sammensat af cyklusser, holde en klar registrering af injektionerne foretaget i eaCH cyklus, og adskille ligander 'læsning, bufferens blank injektion, og den analyt injektion i forskellige cyklusser.
- Cyklus 1: Chip forberedelse og nikkelbelastning
- Sørg for, at strømmen og stier indstilles i henhold til trin 6.1 og 6.2.
- Indsprøjtes 350 mM EDTA i 1 min at vaske væk madrester.
- Indstil flow til 10 pl / min.
- Injicer 0,5 mM NiCl2 for 2 min.
BEMÆRK: Nu chip harpiksen er belagt med nikkel ioner.
- Cyklus 2: Ligander immobilisering
- Sæt strøm til 15 pl / min, strømningsbane Fc = 2.
- Injicer ligand A indtil den når RUC værdier, som er 10-20 gange af dets molekylvægt. For eksempel indlæse en ligand på 50 kDa til 500-1.000 jernbanevirksomheder. Hold regnskab med RUC-værdi opnået.
- Sæt strøm til 15 pl / min, strømningsbane Fc = 1.
- Sprøjt ligand B (kontrol) op til den samme jernbanevirksomhed værdi som ligand A. Overvåg subtraktion Sensogrammet (Fc = 2-1) on-line at hjælpe med at kontrollereinjektion længde.
- Sæt strøm til 50 pl / min, strømningsbane Fc = 1 og Fc = 2, vaske system for 5-20 min, indtil basislinjen (Fc = 2-1) stabiliseres.
- Cyklus 3: Blank injektion. Denne injektion vil tjene til blank subtraktion derfor omfatte alle komponenter, der vil blive injiceret med analytten, undtagen selve analytten.
BEMÆRK: Injection længde kan variere afhængigt af den tid, det tager at nå ligevægt (signal plateauer).- Sæt strøm til 15 pl / min, strømningsbane Fc = 1 og Fc = 2, Fc = 2-1 subtraktion.
- Indsæt kommando "vent" (benævnt i det følgende som "vente") i 30 sekunder (for at have en stabil baseline).
- Injicer 15 sek RB.
BEMÆRK: Varigheden af injektion vil variere mellem forskellige systemer, afhængigt af deres pre-ligevægts kinetiske konstanter (for det meste k a). - Vent 120-600 sek at optage dissociation fase.
BEMÆRK: Længden af dette trin varierer afhængigt af
- Cyklus 4: analyt injektion
- Kopier / indsæt nøjagtige betingelser, der anvendes i henvisningen injektion (cyklus 3), så disse to injektioner kan senere trækkes. Ændre placeringen af rillen i rack fra en bedrift kontrolopløsningen til en, der holder analytopløsningen. Vælg en koncentration, der er lidt over det forventede KD. Hvis der ikke forudgående viden er tilgængelig, skal du vælge 1 pm som et godt udgangspunkt.
- Cyklus 5: Buffer injektion
- Gentag cyklus 3.
- Cyklus 6: analyt injektion
- Gentag cyklus 4.
- Cyklus 7: Chip strip off
- Indstil flow til 50 pl / min. </ Li>
- Injicer 350 mM EDTA i 1 min. Gentag dette trin to gange mere. Brug ikke en enkelt injektion af 3 min, da dette kan beskadige chip.
- Injicer 0,25% SDS i 1 min. Gentag dette trin to gange mere. Brug ikke en enkelt injektion af 3 min, da dette kan beskadige chip.
- Hvis baseline niveau ikke nås, injicere 100 mM HCl i 1 min som ekstra stripping skridt.
- Indsæt kommando 'enden køre', der skifter til standby.
- Chip opbevaring
- Frigør sensorchippen og tage den ud af instrumentet.
- Tag sensoren ud fra skeden, undgå at berøre overfladen, skyl med DDW og sted i et 50 ml rør indeholdende RB. Opbevares ved 4 ° C.
8. Dataanalyse af dertil Evaluation Software
- Udfør følgende trin for at behandle de rå data opnået ved SPR før udledning af de kinetiske parametre.
- Ved hjælp af evalueringen software, åbenresultaterne fil ved at vælge cykler 3-6 Fc = 2-1 (reference fratrækkes data).
- Axis skift:
- Display cykler 3-6.
- Nul Y-aksen værdi baseline (den oprindelige 30 sek ventetiden i hver cyklus) til alle fire kurver.
- Ret X- aksen i de fire kurver. Vælg markante funktioner (f.eks toppe af injektion starte eller slutte) til perfekt justere de fire kurver langs X-aksen. Indstil tiden for starten af analyt (eller kontrol buffer) til nul.
- Henvisning subtraktion
- Fratræk baggrunden reaktion ved at subtrahere kurve for cyklus 3 fra kurven af cyklus 4 og kurve cyklus 5 fra kurven af cyklus 6. Brug kurven subtraktion operation, der kan findes i Y-aksen skifter menu.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre dette trin som den annullerer eventuelle ikke-specifikke komponenter (uden forbindelse med analyt), der kan have påvirket overfladen brydningsindeks.- Gem de trækkes kurver i than projektets ark under et andet navn.
- Se disse kurver som "dobbelt trækkes kurver": Det første subtraktion er 2-1 subtraktion udføres på begge injektioner, og den anden er subtraktion af en kurve fra en anden.
BEMÆRK: En sådan dobbelt referencer er den gyldne standard i SPR eksperimenter. - Overlay de trækkes kurver ved at udføre akse skift som forklaret før.
- Fratræk baggrunden reaktion ved at subtrahere kurve for cyklus 3 fra kurven af cyklus 4 og kurve cyklus 5 fra kurven af cyklus 6. Brug kurven subtraktion operation, der kan findes i Y-aksen skifter menu.
- Bestemmelse af kinetiske konstanter og model fitting
- Gennemførelse af en kinetisk eksperiment
- Injicer en række 6-7 analytkoncentrationer at have en pålidelig data for kinetiske konstanter bestemmelse. Vælg analytkoncentrationer fra 10-fold over til 10-fold under den anslåede K D, 2-3-fold fortyndinger. Medtag koncentrationen "nul", senere brugt til dobbelt henvisning subtraktion (se ovenfor). Gennemføre injektioner i tre eksemplarer og i tilfældig rækkefølge.
- Justerog trække alle kurver i forhold til Y-aksen og X-aksen før forsøger model fitting.
- Model fitting
- Vælg en passende analyse program.
BEMÆRK: De fleste tilgængelige montering programmer tilbyder flere modeller, der kan anvendes til montering og bestemmelse af kinetiske konstanter. - Påfør den enkleste model (Langmuir) antager en reversibel 1: 1 interaktion mellem analysanden og liganden til montering. Medmindre overbevisende data er tilgængelige fra andre eksperimentelle metoder til eksistensen af et mere komplekst samspil, altid bruge den simple Langmuir model.
- Vælg en passende analyse program.
- Gennemførelse af en kinetisk eksperiment
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det heri beskrevne system er en NiNTA chip anvendes til at immobilisere det His-mærkede membran transporter 6,7. At være en homo-dimer, er hver transportør dobbelt mærkede, forbedre sin binding til NiNTA chip. Efter nikkelbelastning, ligand A (transportøren af interesse) immobiliseres på Fc = 2, op til ~ 3.500 RU (protokol cyklus 2, figur 2A Black Label). Derefter bruger det samme flow og injektion varighed, ligand B (kontrol ligand) injiceres på Fc = 1, i første omgang nåede kun op til en ~ 3.000 RU. For at sikre, at lignende protein beløb immobiliseres på begge flowceller; ligand B yderligere indlæst, ved hjælp af kortere injektion, mens omhyggeligt overvåge lastning op til 3.500 jernbanevirksomheder. Den "trappen 'form repræsenterer den gradvise stigning i masse på Fc = 1 ved hver injektion (figur 2A grå etiket). En on-line overvågning af Fc = 2-1 hjælper kontrollere lige ligand belastning. Figur 2B viser Fc = 2-1 subtraktion, dvs trække den maksimale RUC værdi i Fc = 2, fra intervaller den trinvise i RUC værdi i Fc = 1. Det er vigtigt at variere varigheden af liganderne 'injektioner for at opnå lige læsning af de undersøgte og kontrol ligander. I modsætning hertil, når indsprøjtning analytten, varigheden af injektionen skal holdes konstant for alle koncentrationer anvendes. Figur 3A og 3B demonstrere responser målt ved at injicere en "blank analyt '(dvs. RB kun udelade analyt) i cyklusser 3 og 5, og analytten injektioner (i cyklusser 4 og 6). Bemærk, at begge sensogrammer repræsenterer Fc = 2-1 subtraktion. I hver af cyklusserne (3-6) en identisk analyt injektion (blank eller en given koncentration) påføres de to strømningshastigheder celler immobiliseret med forskellige ligander. De to gentagelser overlejre meget godt, hvilket viser høj reproducerbarhed af SPR. Et svar er optaget i begge tilfælde; ~ 3 RUC for blindprøven versus ~ 40 RU for analysanden. Disse værdier repræsenterer et signal-støj-forhold på ~ 13. For at opnå den dobbelte refererede sensogrammer, repræsenterer kun den specifikke binding reaktion, er den tomme indsprøjtning nu trukket fra analyt injektion (~ 37 RU, figur 3C). Sensogrammet registreres afslører karakteristiske mønster af en forbigående interaktion. Ved injektion foreningen fase præget af en hurtig stigning i mængden af ligand-bundne analyt og nåede steady state efter ~ 7 sekunder. Steady state opretholdes så længe analytten injiceres. Når injektionen ophører, vaskes cellerne med RB udløser dissociation fase. Komplekset hurtigt dissocierer, og som analytten vaskes bort fra liganden SPR signal vender tilbage til udgangspunktet.
For at få kvantitative data (pre-ligevægts og ligevægtskonstanter), er en række analytkoncentrationer injiceret i duplikater eller tre eksemplarer (se 8.3.1 i protokol).
Figur 1. Illustration af trin i en SPR eksperiment under anvendelse af en Ni-NTA sensor chip. (A (B - D) Illustration af Fc = 2-1 Sensogrammet registreret under en SPR eksperiment. I cyklus 2 som His-mærket ligand injiceres over Ni-ladet overflade, masse gradvist ophobes. Injektion afsluttes, når der træffes en endelig RUC værdi på mellem 1.000-5.000 RU (afhængigt af liganden s MW). En baseline er dannet, der afspejler den stabile binding af liganden til chippen. I cyklus 3 er en tom injektion præformet indsprøjte bestanddele af analyt prøven bortset kun analytten. I denne injektion ofte en lav reaktion registreres (1-5 RU). I cyklus 4 analysanden injiceres ved brug af den samme ordning som den tomme injektion. Den stigende jernbanevirksomheder afspejler masseændringen på overfladen, dvs. bindingen af analytten til liganden. Signalet hurtigt stiger og derefter plateauer som the systemet når ligevægt. Når injektionen er afsluttet, analysanden dissocierer fra liganden, hvilket resulterer i et fald i signal og vende tilbage til udgangsniveauet.
Figur 2. On line overvågning af ligand belastninger. (A) usubtraheret kurver ligand belastning. Den ligand af interesse (ligand "A") indlæses til at flyde celle 2 (Fc = 2, sort) indtil man kommer til det ønskede RUC niveau (~ 3.500 RU i dette eksempel). Derefter negativ kontrol ligand (ligand "B") er trinvis påsat flowcelle 1 (Fc = 1, grå), indtil en identisk RU er nået. (B) De to injektioner udføres i (A) overvåges i realtid som en Fc = 2-1 subtraktion. Denne overvågning letter identisk lastning af ligander af interesse og kontrol.
Figur 3. Dobbelt henvisninger. (A) kopier af en 2-1 subtraktion (dvs. Fc = 2-1) i den tomme injektion. (B) som i (a) er det kun analyt injiceres. (C) det endelige sensogrammer efter subtraktion af baggrund respons vist i (A) fra den målte reaktion i (B). Disse kurver er benævnt »double udstanset" eller "dobbelt refereres". Dubletter af sekventielle cyklusser.
. Figur 4. Bestemmelse af kinetiske hastighedskonstanter af injektioner af flere analytkoncentrationer (i dubletter) De sorte streger er de passer, der blev beregnet ved hjælp af en simpel 1: 1 Langmuir interaktion model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR er en meget følsom metode til at studere molekylære interaktioner, og ofte er den eneste metode, der giver real-time overvågning af forbigående (men vigtige) interaktioner. Et eksempel er den forbigående interaktion præsenteret heri, som ikke kunne påvises ved en anden metode (pull-down assays liposomer sedimentation 6 assays). Desuden, mens andre metoder er begrænset til ligevægt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), SPR er en af de eneste teknikker, der måler også pre-ligevægts kinetik.
Dens øget følsomhed er også dens advarsel. Falsk-positive sensogrammer let registreres. Det anbefales derfor at fastslå eksistensen af interaktionen ved hjælp af andre metoder, før du forsøger SPR målinger. Forudgående kendskab til systemets karakteristika (ru vurdering af KD, stabil vs. forbigående interaktion) er meget nyttige i opsætning af SPR experiments og vurdering af den funktionelle relevans af de opnåede målinger. Et vigtigt spørgsmål at huske på, før du starter SPR målinger er kvaliteten af protein prøver. SPR er meget følsom over aggregater, og disse skal fjernes fra både liganden og analytten præparater (ved gelfiltreringskromatografi eller ultracentrifugering når det er muligt). En anden kilde til støj og falske signaler kan skyldes buffer misforhold mellem RB og bufferen af analysanden. Dette kan løses ved at dialysere analytten mod RB eller ved anvendelse af en stærkt koncentreret præparat af analyt, der fortyndes mange folder (~ 100-1.000-fold) i RB. Falsk positive data kan også skyldes uspecifikke vekselvirkninger mellem analyt med chippen matrix eller med den negative kontrol. Disse interaktioner er af lav affinitet, så nogle gange kan undgås ved anvendelse af lave analytkoncentrationer. Desuden inddragelse af lav BSA og / eller detergent-koncentrationer (0,1 mg / ml og / eller 0,05-0.1% (W v /) henholdsvis) til RB og det injicerede analyt prøven kan falde uspecifikke interaktioner. Ændring af indholdet i den negative kontrol celle (forskellig negativ kontrol) er en anden fremgangsmåde i forbindelse med ikke-specifik binding spørgsmål. Alternativt kan ved hjælp af en anden type chip også påvirke kvaliteten af data. Forskellige former for sensor chips er kommercielt tilgængelige, baseret på forskellige kemier. I den mest almindeligt anvendte sensor chip (det CM-5 chip) carboxymethyleret dextran er kovalent bundet til en guldoverflade. Proteiner kan være kovalent koblet til sensoroverfladen anvendelse af en række meget simple overfladekemier (mest almindeligt amin eller thiol kobling). Men i vores hænder, når du arbejder med membranproteiner covalent immobilisering ofte giver artefakter og er således ikke den foretrukne metode. I forbindelse med at studere et membranprotein, er det bemærkelsesværdigt, at der er kommercielle chips, der er belagt med lipofile molekyler. Disse gør det muligt IMMOBilization membranproteiner på en nativ-lignende miljø. Lignende sensor chips kan også fremstilles "in house". For en beskrivelse af andre koblingsfremgangsmåder se 10,11. Den heri beskrevne protokol er baseret på anvendelse af Ni-NTA chip til immobilisering af et His-mærket, detergent solubiliseret transporter (analytten er ikke His-mærket for at undgå analytbinding til chip overflade). I vores erfaring 6,12, kinetiske konstanter afledt fra eksperimenter udført med Ni-NTA chips er i god overensstemmelse med de bestemt i nativ-lignende miljøer. Selvom Ni-NTA chips er relativt dyre, deres primære fordel er, at de kan fjernes af ligand og genbruges. Hundredvis af målinger kan gøres pr chip. Desuden er liganden orientering på chippen bestemt af positionen af His-mærket og er derfor helt homogen.
Når en interaktion er lykkedes indspillet af SPR, en række kontroller og repEATS er nødvendige for at kontrollere gyldigheden af SPR signal. Verifikation af nedenstående parametre kan hjælpe til at validere SRP data:
1. egenart SPR signal: på grund af den høje følsomhed SPR, anvendelse af passende negative kontroller er af særlig betydning. Ikke-specifik vekselvirkning registreres af SRP kan skyldes adsorption af en analyt til matrixen. Derfor er en tom strømningscelle er ofte ikke den bedste løsning, da en flow-celle fyldt med protein (liganden) ikke kemisk svarer til en tom flowcelle. En bedre løsning er at anvende en inaktiv mutant variant af liganden, en, der vides ikke at binde analysanden. Alternativt kan man anvende et tilsvarende muteret analyt. Hvis sådanne mutanter ikke findes et homologt protein (men forskellig bindingsspecificitet) kan anvendes 12. Eksempler på gode negative kontroller er en homolog ligand (som beskrevet her) eller en punktmutation i en af de samvirkende parter, der vides atafskaffe foreningen. En anden anbefalede negative kontrol er ændring af en post-translationel modifikation (f.eks, phosphorylering, methylering, thiol afledning), der er afgørende for interaktion. For eksempel, de-phosphorylering af en tyrosin, der er afgørende for SH2-domæne-interaktion. Andre negative kontroller kan være systemets specifikke. Når du bruger SPR, kan betydningen af at bruge strenge negative kontroller ikke overvurderes.
2. reproducerbarhed af SPR signal: SPR er en yderst reproducerbar metode. Når der indlæses lige ligand beløb på biosensorchip og lige koncentrationer af analytten injiceres gentagelserne skal slutter perfekt (se figur 3).
3. Regenerering af systemet: i interaktionen med en langsom dissociation rate (Kd), analytten skal strippes fra liganden samtidig bevare den funktionelle og strukturelle integritet af latter. Hvis dissociation og / eller regenerering er ufuldstændige, vil det SPR signal gradvist henfalde på efterfølgende injektioner af analysanden. Typiske regenererende betingelser, der kan testes, er høje koncentrationer af Mg2 + (op til 2 m), sure eller basiske betingelser (f.eks 10 mM glycin pH 2,5, 10 mM NaOH), høj salt (op til 4 M NaCl), eller høj koncentration detergent (f.eks, 1% DDM). Men den regenererende effektiviteten af disse reagenser (og andre) er meget systemspecifikke og dermed regenerationer betingelser skal afprøves. I nogle tilfælde interaktionen er så stabil og stærk, at regenerering er aldrig fuldstændig, som i tilfælde af E. coli vitamin B12 transportsystem (BtuCD-F) 7. Under sådanne betingelser, den eneste mulighed er at fratage liganden fra biosensorchip og genindlæse en frisk batch til hver injektion. I tilfælde, hvor dissociation af analytten fra liganden er hurtig og fuldstændig overflade regenerering er unødvendig(Se protokol og figur 2-3).
4. Membranproteiner altid oprenses i nærvær af detergent, som kan påvirke SPR sensitivitet og reaktionshastigheder. Men vores erfaring med BtuCD, de målte satser er meget ens. Man skal altid opnå dokumentation hjælp gratis tilgange såsom størrelse (SEC), pull-down-analyser, liposom sedimentation assay, etc. For eksempel er vist en sammenhæng mellem SPR og andre teknikker til methionin, vitamin B 12, og to molybdat systemer 6,12.
Fejlagtig bestemmelse af de kinetiske hastighedskonstanter ofte opstår under tilpasningsprocessen. Som en tommelfingerregel, altid anvende den enkle Langmuir 1: 1 interaktion model for analyse kinetiske eksperimenter. De mere komplekse modeller foretage yderligere forudsætninger om konformationsændringer, bivalente analyt eller prøve heterogenitet. Disse forudsætninger skal værekun foretages, hvis det understøttes af dokumentation fra andre eksperimentelle tilgange. Bemærk, at anvendelsen af disse modeller vil sandsynligvis resultere i bedre montering og lavere Chi 2 værdier, men dette bør ikke ses som et vidnesbyrd for deres pålidelighed. De højere frihedsgrader som tilbydes af mere komplekse modeller er som regel ansvarlig for bedre pasform, snarere end deres mekanistiske relevans.
En af fordelene ved SPR er dens brede kemisk kompatibilitet, navnlig med hensyn til vaske- og rengøringsmidler, der anvendes til at solubilisere og oprense membranproteiner. Men sucrose og glycerol (og andre viskøse opløsninger), der ofte tilsættes under rensningsprocessen af membranproteiner have dramatiske virkninger på RU. Det anbefales derfor at undgå disse, hvis det er muligt, eller i det mindste reducere deres koncentration. Ved brug af viskose opløsninger, undgå buffer mismatch bliver afgørende. Tilføjelse lipider til et vaskemiddel indeholdende RB kan forstærke bindingen tegnal med så meget som ti gange. Men en sådan bestræbelse er dyrt (for de fleste lipider) og har tendens til at forkorte levetiden af biosensor chips.
De tips og fejlfinding er anført ovenfor, kan hjælpe under kalibrering et nyt system. Men et givet system kræver ofte særlig tweaking (fx valg af detergent, salt, pH) for at opnå optimale resultater.
SPR har længe været anerkendt som en stærk og unik tilgang til at måle molekylære interaktioner. I de senere år tilgængeligheden af forskellige SPR platforme og deres faldende priser har gjort SPR mere imødekommende. Den er hurtigt ved at blive den gyldne standard metode til at studere protein-protein interaktioner, target protein-lægemiddelinteraktioner, og i at opdage bly småmolekylære inhibitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
