Summary
Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.
Introduction
Interacciones proteína-proteína (PPI); la formación y disociación de complejos de proteínas, son acontecimientos clave en muchos procesos biológicos (por ejemplo, replicación, transcripción, traducción, señalización, comunicación célula-célula). Estudios semi-cuantitativos de PPI se realizan a menudo utilizando desplegable o experimentos de inmuno-precipitación. Sin embargo, estas técnicas (y similares) están limitados en la gama de afinidades que se puede medir (micromolar bajo y mayor afinidad) debido a las etapas de lavado que son inherentes a tales técnicas. Tales técnicas de "punto final" no pueden identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que a menudo son de grandes consecuencias biológicas. Además, la resolución temporal de estos enfoques es extremadamente limitado, generalmente órdenes de magnitud más lento que las tarifas de la reacción. SPR superar estas críticas debido a su mayor sensibilidad y resolución temporal superior 1,2. SPR es un método libre de etiquetas, y como talinteracción molecular se puede medir (siempre y cuando los cambios de masa pueden detectarse). Además de PPI, se ha utilizado ampliamente para caracterizar la proteína-ligando, la proteína-fármaco (o una molécula pequeña), la proteína de ADN, y las interacciones proteína-ARN 3-5. Los resultados se registran y se representan en tiempo real, que permite la modificación rápida de las condiciones experimentales y diseño experimental flexible.
El principio físico detrás instrumentos basados en SPR es la utilización de un sistema óptico que mide un cambio del índice de refracción en la superficie del sensor a los cambios de masa 2. Uno de los socios que interactúan (ligando de aquí en adelante) está inmovilizado en un chip de matriz de polímero y la segunda molécula (analito en lo sucesivo) se hace fluir sobre la superficie. El analito se une al ligando altera la masa sobre la superficie del chip. Este cambio de masa está directamente relacionado y proporcional a los cambios en el índice de refracción de la superficie. Los resultados se representan en tiempo real ypresentarse como unidades de respuesta (RU) como una función del tiempo. Tal trama se denomina una Sensograma (por ejemplo, Figura 1). Desde SPR sigue el transcurso de tiempo completo de la interacción, pre-equilibrio constantes de velocidad cinética se derivan, además de equilibrio afinidades. Como se detalla a continuación, el comportamiento de pre-equilibrio de un sistema dado tiene mucha información, y proporciona una perspectiva muy diferente de equilibrio solo. Una vez que el sistema se calibra, los experimentos son muy rápidos y requieren sólo pequeñas cantidades de material de proteína (microgramos a nanogramos cantidades). Recogida de la información cinética completa de un sistema dado se puede lograr en día. La alta sensibilidad del SPR proporciona mediciones que no son posibles de utilizar cualquier otra técnica 6. Sin embargo, esta alta sensibilidad es un "arma de doble filo", ya que puede ser una fuente importante de datos falsos positivos. Cualquier factor que afecta el índice de reflexión se registra y se representa en el Sensograma. Como tal, apcontroles apro- deben utilizarse para eliminar los falsos positivos, y el apoyo de enfoques complementarios, es muy recomendable.
La Figura 1 ilustra la progresión de un experimento SPR usando un chip sensor recubierto-NTA. El Sensograma en el panel A muestra la inyección de los iones de níquel más de la matriz de NTA (datos sin sustraer), y los paneles BD mostrar los datos después de restar la señal derivada de la célula control negativo. Flechas rojas y azules muestran inicio de la inyección y final, respectivamente. La inmovilización del ligando en el chip altera gradualmente la masa hasta que se termine la inyección. La meseta estable observada después de la terminación de la inyección del ligando refleja la asociación estable del ligando a la superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una vez que se consigue una línea de base estable un tampón se inyecta sobre el ligando y la célula de referencia (Figura 1B, el ciclo 3) .Este inyección sirve como un "blanco de control", y serásustraído durante el análisis. Tras la inyección, se registran cambios menores, lo que refleja un flujo de masa a través del chip. Luego, en un ciclo separado (Figura 1B, ciclo de 4), se inyecta el analito; el aumento gradual de RU representa la asociación de analito al ligando. Los sitios de unión ocupados se vuelven gradualmente hasta que se alcanza el equilibrio. Tan pronto como termina la inyección, la disminución de las EEFF refleja la disociación del complejo. De tales sensograms pre-equilibrio de equilibrio y constantes de velocidad se pueden derivar (ver más adelante). La Figura 1 representa una interacción transitoria entre el ligando y el analito. Cuando la interacción es más estable, el descenso en el nivel de RU es más lento, lo que refleja un menor k d.
Aquí se describe un experimento SPR objetivo de caracterizar la interacción entre un transportador de membrana (detergente solubiliza) y su socio funcional, su sustrato cognado proteína de unión 6,7. El mod elegidosistema el es un casete de unión a ATP (ABC) transportador, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Este sistema fue seleccionada por sus resultados altamente reproducibles, alta relación señal-ruido, y clásico 'on / off' tarifas. Además, los transportadores ABC homólogos están disponibles para servir como importantes controles negativos. El transportador, ModBC (ligando A) se extrae de la membrana utilizando detergente, purificada e inmovilizada en el chip. Su interacción socio soluble, Moda, es el analito. Como un ligando de control negativo, un RbsBC transportador ABC diferente se utiliza ("ligando B").
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Protocol
1. proteína de la muestra y la Preparación Buffer
- Preparación de la muestra: purificar las proteínas de interés y asegurarse de que se eliminan todos los agregados, mediante la inyección de la proteína antes del experimento en una columna de filtración en gel o por ultracentrifugación (por lo general 10 minutos a 100.000 xg es suficiente).
NOTA: Aunque los preparados de proteínas deseables, altamente puros no son una necesidad. SPR ha sido utilizado con éxito con menos-que-perfecta purificaciones y hasta con 8,9 total del extracto. - Preparación Buffer:
- Preparar el tampón del experimento (denominado "tampón", o RB). Para el protocolo descrito aquí, utilizar Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenga en cuenta que la elección de la composición del tampón se puede modificar fácilmente de acuerdo con el sistema estudiado.
- Filtra todos los tampones y muestras de proteínas utilizando 0,22 micras filtros. Asegúrese de antemano que los filtros están en proteínascompatible. En general, las plataformas SPR recientemente comercializados contienen un filtro en línea de-Gasser; Si este no es el caso, de-gas los tampones antes de su uso.
- Dializar noche o diluir las muestras contra la RB para evitar desajustes de amortiguamiento. Diálisis (o cualquier otro método de intercambio de tampón) es especialmente recomendable cuando se utilizan productos químicos de alta viscosidad (por ejemplo, sacarosa, glicerol, DMSO). Antes de conectar la botella RB a la entrada de la bomba mantener a un lado 10 ml de la RB en un tubo separado.
- Diluir el ligando madre concentrada en RB a una concentración final de ~ 20 mg / ml. Como regla general, para la inmovilización del ligando estable, utilizar concentraciones de ligando bajas con inyecciones más largos a bajo flujo, en oposición a altas concentraciones, de alto flujo y las inyecciones más cortas.
- Diluir el analito en el RB a la concentración deseada. Típicamente, probar la gama de concentraciones para un sistema de afinidad desconocido de 10 M a 10 nM en diluciones de diez veces. Comience siemprecon las concentraciones más bajas primero.
2. Sensor de Chip
- Selección Chip: Utilice un ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adecuado para la captura de proteínas con una etiqueta oligo-histidina.
- Uso Chip:
- Cuando se utiliza un nuevo chip, tomar el chip fuera de la vaina, enjuague suavemente con agua doblemente destilada (DDW), secar líquidos restantes cuidadosamente usando limpiadores delicados, y asegúrese de no tocar la superficie de la capa de oro. Coloque el chip en la vaina en la orientación correcta (la inserción es suave cuando el chip se coloca correctamente).
- Cuando vuelva a utilizar un chip, sacar el chip almacenado desde la memoria intermedia, enjuague bien con DDW y seca suavemente como se ha dicho, y colocar en su vaina originales.
NOTA: La acumulación de material de chatarra no específica en el chip puede afectar a su 'viabilidad'. Esto puede ser controlado mediante la comparación de las EF antes de la inmovilización del ligando y post extracción. Aunque muchas mediciones pueden serhecho usando el mismo chip NiNTA, el tema de su longevidad no es una 'clara' y varía mucho entre los diferentes chips.
- Docking Chip: Abra la puerta chip sensor y coloque el chip en su vaina. Cuando se utiliza un nuevo chip, el número de serie de entrada del chip para mantener registro de uso. Cierre la puerta y pulse 'chip de muelle ".
3. Los ajustes de temperatura
- Ajuste la temperatura de la célula de chips a 25 ° C (o la temperatura experimento preferido).
- Opcional: establecer el compartimiento de muestras a 7 ° C para mantener las proteínas estable durante todo el experimento.
4. Las soluciones para carga y el arrastre
Preparar las siguientes soluciones para la carga y el arrastre: 0,5 mM NiCl 2 en RB, EDTA 350 mM en RB (añadir detergente a la solución de EDTA a una concentración final como en RB), 0,25% SDS en H 2 O, y HCl 100 mM en H 2 O. Cuando se utiliza bañera de micro-centrífugaes y no SPR tubos designados, no se olvide de cortar las tapas de los tubos.
5. Primer Instrumento SPR con RB
6. Iniciar un nuevo Run
- Ajuste el caudal que se utilizará durante el experimento. Para obtener los resultados descritos aquí establecer el flujo de 50 l / min.
NOTA: Este parámetro se puede modificar durante el experimento. - Definir las vías de flujo y la resta de referencia. Para obtener los resultados descritos aquí establecidas las rutas de Fc = 1 y Fc = 2, Fc sustracción = 2-1.
NOTA: El programa mostrará en tiempo real la sustracción de dos células de medición. Tenga en cuenta que este parámetro no puede ser alterado durante el experimento. - Seleccione la gradilla de muestras adecuado (que puede influir en el consumo de volumen de la muestra).
- Guarde el archivo de resultados.
7. Ciclos Experiment
Cada experimento se compone de ciclos, mantener un registro claro de las inyecciones realizadas en eaciclo ch, y separar la carga de los ligandos, la inyección en blanco de la memoria intermedia, y la inyección analito en diferentes ciclos.
- Ciclo 1: preparación Chip y níquel carga
- Asegúrese de que el flujo y caminos se establecen de acuerdo con el paso 6.1 y 6.2.
- Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min para lavar platos sobrantes.
- Definir el flujo de 10 l / min.
- Inyectar 0,5 mM NiCl2 durante 2 min.
NOTA: Ahora el chip de resina se recubre por iones de níquel.
- Ciclo 2: Ligandos inmovilización
- Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 2.
- Inyectar ligando A hasta alcanzar valores de RU que son 10-20 veces de su peso molecular. Por ejemplo, cargar un ligando de 50 kDa a 500-1000 EF. Mantenga un registro del valor RU logrado.
- Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1.
- Inyectar ligando B (control) hasta el mismo valor que el de RU ligando A. Seguimiento de la Sensograma resta (Fc = 2-1) en línea para ayudar a controlar lalongitud de la inyección.
- Flujo Set a 50 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, lavar el sistema de 5-20 minutos hasta que la línea de base (Fc = 2-1) se estabiliza.
- Ciclo 3: inyección en blanco. Esta inyección servirá para la resta en blanco, por lo tanto, incluir todos los componentes que se inyectan con el analito, excepto el propio analito.
NOTA: La longitud de inyección puede variar en función del tiempo que tarda en alcanzar el equilibrio (mesetas de la señal).- Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, Fc = 1.2 resta.
- Introduzca el comando 'espera' (en lo sucesivo como "esperar") durante 30 segundos (para tener una línea de base estable).
- Inyectar 15 seg RB.
NOTA: La duración de la inyección puede variar entre los diferentes sistemas, en función de sus constantes cinéticas pre-equilibrio (sobre todo el k A). - Espere 120-600 segundos para registrar la fase de disociación.
NOTA: La duración de esta etapa varía de acuerdo con el
- Ciclo 4: inyección de analitos
- Copia / pega las condiciones exactas utilizadas en la inyección de referencia (ciclo 3), por lo que estos dos inyecciones pueden ser más tarde restan. Cambio de la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a uno que tiene la solución de analito. Elija una concentración que es ligeramente superior a la esperada K D. Si no hay ningún conocimiento previo está disponible, elija 1 mM como un buen punto de partida.
- Ciclo 5: Inyección Buffer
- Repita el ciclo de 3.
- Ciclo 6: inyección del analito
- Repita el ciclo de 4.
- Ciclo 7: Chip desnudarse
- Definir el flujo de 50 l / min. </ Li>
- Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip.
- Inyectar 0,25% SDS durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip.
- Si no se alcanza el nivel de referencia, inyectar HCl 100 mM durante 1 min como etapa de separación adicional.
- Introduzca el comando 'run final' que cambia al modo de espera.
- Almacenamiento chip
- Desacoplar el chip sensor y lo saca del instrumento.
- Tome el sensor fuera de su funda, evite tocar la superficie, enjuagar con DDW, y colocar en un tubo de 50 ml que contiene RB. Almacenar a 4 ° C.
8. Análisis de datos utilizando Designado Software de evaluación
- Realice los siguientes pasos para procesar los datos brutos obtenidos por SPR antes de derivación de los parámetros cinéticos.
- Utilizando el software de evaluación, abiertael archivo de resultados, seleccione los ciclos 3-6 Fc = 2.1 (referencia resta de datos).
- Eje de cambio:
- Mostrar ciclos 3-6.
- Poner a cero el valor del eje Y de la línea de base (el 30 seg tiempo de espera inicial en cada ciclo) a la de todos los cuatro curvas.
- Alinear el eje X de las cuatro curvas. Elija las acentuadas características (por ejemplo, los picos de salida de la inyección o el final) para alinear perfectamente los cuatro curvas a lo largo del eje X. Establezca la hora del comienzo de analito (o tampón de control) a cero.
- Referencia de resta
- Restar la respuesta de fondo restando la curva de ciclo 3 de la curva de ciclo de 4 y la curva de ciclo 5 de la curva de ciclo de la operación 6. Uso curva de sustracción que se puede encontrar en el eje Y se desplaza menú.
NOTA: Es importante realizar este paso en que anula los componentes no específicos (relacionados con el analito) que pueden haber influido en el índice de refracción de la superficie.- Guarde las curvas restados en tél hoja de proyecto bajo un nombre diferente.
- Consulte estas curvas como "curvas" doblemente restados: la primera es la sustracción 2-1 resta se realiza en ambas inyecciones, y la segunda es la resta de una curva de otro.
NOTA: Tal doble referencias es el estándar de oro en los experimentos de SPR. - Superposición de las curvas sustraídas mediante la realización de cambio del eje como se ha explicado antes.
- Restar la respuesta de fondo restando la curva de ciclo 3 de la curva de ciclo de 4 y la curva de ciclo 5 de la curva de ciclo de la operación 6. Uso curva de sustracción que se puede encontrar en el eje Y se desplaza menú.
- Determinación de la cinética de las constantes y ajuste del modelo
- La realización de un experimento de cinética
- Inyectar una serie de 6-7 concentraciones de analitos tener un fiable de datos para la determinación de las constantes cinéticas. Elige concentraciones de analito a partir de 10 veces por encima de 10 veces por debajo del estimado K D, en diluciones 2-3 veces. Incluya la concentración "cero", posteriormente utilizado para la sustracción de referencia de matrimonio (ver arriba). Llevar a cabo inyecciones por triplicado y en orden aleatorio.
- Alineary restar todas las curvas con respecto al eje Y y el eje X antes de intentar el ajuste del modelo.
- Ajuste del modelo
- Seleccione un programa de análisis adecuado.
NOTA: La mayoría de los programas de ajuste disponibles ofrecen varios modelos que se pueden aplicar para el montaje y la determinación de las constantes cinéticas. - Aplicar el modelo más simple (Langmuir) suponiendo una reversible 1: 1 la interacción entre el analito y el ligando para el montaje. A menos convincentes datos disponibles de otros métodos experimentales para la existencia de una interacción más compleja, utilice siempre el modelo de Langmuir simple.
- Seleccione un programa de análisis adecuado.
- La realización de un experimento de cinética
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Representative Results
En el sistema descrito en el presente documento, un chip de NiNTA se utiliza para inmovilizar el transportador de membrana Su-etiquetados 6,7. Al ser un homo-dímero, cada transportador está doblemente etiquetada, mejorando su unión al chip NiNTA. Después de la carga de níquel, ligando A (el transportador de interés) se inmoviliza sobre Fc = 2, hasta ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A etiqueta negro). Luego, utilizando el mismo flujo y la duración de la inyección, ligando B (el ligando de control) se inyecta en Fc = 1, inicialmente alcanzar sólo hasta un ~ 3000 RU. Para asegurarse de que las cantidades de proteínas similares se inmovilizan en ambas células de flujo; ligando B se carga aún más, utilizando la inyección más cortos, mientras se controla cuidadosamente la carga de hasta 3.500 empresas ferroviarias. La forma 'escaleras' representa el aumento gradual de la masa en Fc = 1 en cada inyección (etiqueta gris Figura 2A). Un monitoreo en línea de Fc = 2-1 ayuda a controlar la carga igual ligando. Figura 2B demuestra el Fc = 2-1 resta, es decir, restando el valor máximo en el RU Fc = 2, a partir de los incrementos graduales en el valor RU en Fc = 1. Es importante variar la duración de las inyecciones de los ligandos 'para lograr la igualdad de carga de los ligandos investigados y control. En contraste, cuando la inyección del analito, la duración de la inyección se debe mantener constante para todas las concentraciones utilizadas. Figura 3A y 3B muestran las respuestas medidas mediante la inyección de un "analito en blanco '(es decir, RB omitiendo únicamente el analito) en los ciclos 3 y 5, y las inyecciones de analito (en ciclos de 4 y 6). Tenga en cuenta que ambos sensograms representan el Fc = 1.2 resta. En cada uno de los ciclos (3-6) una inyección analito idéntico (en blanco o una concentración dada) se aplica sobre las dos células de flujo, inmovilizada con diferentes ligandos. Los dos repeticiones superponen muy bien, lo que demuestra la alta reproducibilidad de SPR. Una respuesta se registra en ambos casos; ~ 3 RU para el blanco frente a ~ 40 RU para el analito. Estos valores representan una relación señal-ruido de ~ 13. Para obtener los sensograms doble referencia, lo que representa sólo la respuesta de unión específica, la inyección en blanco está ahora resta de la inyección de analitos (~ 37 RU, Figura 3C). El Sensograma registrado revela el patrón característico de una interacción transitoria. Tras la inyección, la fase de asociación se caracteriza por un rápido aumento en la cantidad de analito unido a ligando, de alcanzar el estado estacionario después de ~ 7 segundos. El estado estacionario se mantiene durante el tiempo que se inyecta el analito. Cuando termina la inyección, las células se lavan con RB activación de la fase de disociación. El complejo se disocia rápidamente, y como el analito se lava de distancia de la señal de SPR ligando los vuelve a la línea de base.
Para obtener datos cuantitativos (pre-equilibrio y constantes de equilibrio), se inyecta una gama de concentraciones de analitos en duplicados o triplicados (véase 8.3.1 en el protocolo).
Figura 1. Ilustración de los pasos de un experimento SPR usando un chip sensor Ni-NTA. (A (B - D) Ilustración de la Fc = 2.1 Sensograma registrado durante un experimento SPR. En el ciclo 2 como el ligando marcado con His se inyecta sobre la superficie cargada-Ni, la masa se acumula gradualmente. La inyección se termina cuando se alcanza un valor final que oscila entre 1.000-5.000 RU RU (dependiendo de MW del ligando). Una línea de base se forma, lo que refleja la unión estable del ligando al chip. En el ciclo 3, una inyección de blanco se preforma, la inyección de los componentes de la muestra de analito excluyendo sólo el analito. En esta inyección a menudo se registra una baja respuesta (1-5 RU). En el ciclo 4 se inyecta el analito usando el mismo régimen que la inyección en blanco. La creciente EF refleja el cambio de masa en la superficie, es decir, la unión del analito al ligando. La señal aumenta rápidamente para luego estancarse como ªsistema de correo alcanza el equilibrio. Cuando termina la inyección, el analito se disocia del ligando, lo que resulta en una disminución de la señal y volver a los niveles basales.
Figura 2. El monitoreo de línea de cargas ligando. (A) Curvas sin sustraer de ligando de carga. El ligando de interés (ligando "A") se carga a la celda de flujo 2 (Fc = 2, negro) hasta alcanzar el nivel deseado RU (~ 3500 RU en este ejemplo). Entonces, el ligando de control negativo (ligando "B") es por etapas cargado en la celda de flujo 1 (Fc = 1, gris) hasta un nivel RU idénticos es alcanzado. (B) Los dos inyecciones realizadas en (A) monitoreado en tiempo real como un Fc = 2-1 resta. Este seguimiento facilita la carga idéntica de ligandos de interés y control.
Figura 3. Haga doble referencia. (A) Duplicados de una resta 2-1 (es decir, Fc = 1.2) de la inyección en blanco. (B) Como en (A), sólo se ha inyectado analito. (C) sensograms finales después de la sustracción de la respuesta de fondo se muestra en (A) de la respuesta medida en (B). Estas curvas se refieren como "doble suprimida" o "doble referencia". Los duplicados son de ciclos secuenciales.
. Figura 4. Determinación de las constantes cinéticas con inyecciones de varias concentraciones de analitos (por duplicado) Las líneas negras son los ajustes que se calcularon usando un simple 1: 1 modelo de interacción Langmuir.
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Discussion
SPR es un método muy sensible para estudiar las interacciones moleculares, y es a menudo el único enfoque que proporciona monitoreo en tiempo real de (pero importantes) interacciones transitorias. Un ejemplo es la interacción transitoria presentada en este documento, que no podía ser detectado por cualquier otro método (pull-down ensayos, los ensayos de liposomas de sedimentación 6). Por otra parte, mientras que otros métodos están limitados a mediciones de equilibrio (ya sea cuantitativa o cualitativa), SPR es una de las únicas técnicas que miden también la cinética de pre-equilibrio.
Su sensibilidad es también su advertencia. Sensograms falsos positivos se registran fácilmente. Por ello se recomienda establecer la existencia de la interacción con otros métodos antes de realizar mediciones de SPR. El conocimiento previo de las características del sistema (evaluación aproximada de la K D, estable frente a la interacción transitoria) es muy útil en la creación de SPR EXPERIMENTS y evaluar la relevancia funcional de las mediciones obtenidas. Una cuestión importante a tener en cuenta antes de iniciar las mediciones de SPR es la calidad de las muestras de proteínas. SPR es altamente sensible a los agregados y éstos se debe quitar de tanto el ligando y la preparación de analito (por cromatografía de filtración en gel o ultracentrifugación cuando sea posible). Otra fuente de falsas señales de ruido y puede provenir de los descalces de amortiguamiento entre el RB y el buffer de la sustancia analizada. Esto puede ser resuelto por diálisis del analito en contra de la RB, o mediante el uso de una preparación altamente concentrada de analito que se diluye muchos pliegues (~ 100-1.000 veces) en el RB. Datos falsos positivos pueden también resultar de interacciones no específicas del analito con la matriz del chip o con el control negativo. Estas interacciones son de baja afinidad, así que a veces se puede evitar mediante el uso de bajas concentraciones de analito. Además, la inclusión de bajo BSA y / o concentraciones de detergente (0,1 mg / ml y / o 0,05-0,1% (W / v), respectivamente) para el RB y el analito de la muestra inyectada puede disminuir las interacciones no específicas. Cambiar el contenido de la célula de control negativo (diferente control negativo) es otro enfoque para tratar los asuntos de unión no específicos. Alternativamente, el uso de otro tipo de chip también puede afectar a la calidad de los datos. Varios tipos de chips sensores están disponibles comercialmente, sobre la base de diferentes químicas. En el chip más comúnmente utilizado sensor (el chip CM-5) carboximetilado dextrano está unido covalentemente a una superficie de oro. Las proteínas se pueden acoplar de forma covalente a la superficie del sensor usando una variedad de químicas de superficie muy simples (más comúnmente amina o tiol de acoplamiento). Sin embargo, en nuestras manos, cuando se trabaja con proteínas de membrana inmovilización covalente a menudo produce artefactos y por lo tanto no es el método de elección. En el contexto del estudio de una proteína de membrana, es de destacar que no son chips comerciales que están recubiertas con moléculas lipófilas. Estos permiten que el immobilization de proteínas de membrana en un entorno nativo. Chips sensores similares también se pueden preparar 'en casa'. Para una descripción de otros métodos de acoplamiento ver 10,11. El protocolo descrito en el presente documento se basa en el uso de chip de Ni-NTA para la inmovilización de un His, detergente transportador solubilizado (el analito no es Su-etiquetados para evitar la unión a la superficie del chip analito). En nuestra experiencia 6,12, constantes cinéticas derivadas de experimentos llevados a cabo con chips de Ni-NTA están en buen acuerdo con los determinados en entornos nativo. Aunque los chips de Ni-NTA son relativamente caros, su principal ventaja es que pueden ser despojado de ligando y volver a utilizarse. Cientos de mediciones se pueden hacer por chip. Por otra parte, la orientación del ligando en el chip se determina por la posición de la etiqueta de His y es por tanto bastante homogénea.
Una vez que una interacción ha sido registrado con éxito por SPR, una serie de controles y repeats son necesarios para verificar la validez de la señal de SPR. Verificación de los parámetros siguientes puede ayudar a validar los datos SRP:
1. Especificidad de la señal de SPR: debido a la alta sensibilidad de SPR, el uso de controles negativos apropiados es de especial importancia. Interacción no específica grabada por SRP puede ser debido a la adsorción de un analito a la matriz. Por lo tanto, una célula de flujo de vacío a menudo no es la mejor opción desde una celda de flujo cargado con la proteína (el ligando) no es químicamente equivalente a una célula de flujo de vacío. Una mejor opción es utilizar una variante mutante inactivo del ligando, uno que se sabe que no unir el analito. Alternativamente, se puede utilizar un analito de manera similar mutado. Si tales mutantes no están disponibles una proteína homóloga (pero de diferente especificidad de unión) se puede utilizar 12. Ejemplos de buenos controles negativos son un ligando homóloga (como se describe aquí), o una mutación puntual en uno de los socios que interactúan que se sabe queabolir la asociación. Otra recomienda un control negativo es la alteración de una modificación post-traduccional (por ejemplo, fosforilación, metilación, derivación tiol) que es esencial para la interacción. Por ejemplo, de-la fosforilación de una tirosina que es esencial para la interacción de dominio SH2. Otros controles negativos pueden ser específicos del sistema. Al usar SPR, la importancia de utilizar los estrictos controles negativos no puede ser exagerada.
2. La reproducibilidad de la señal de SPR: SPR es un método extremadamente reproducible. Cuando cantidades iguales de ligando se cargan en el chip biosensor y concentraciones iguales de analito se inyectan las repeticiones deben alinear perfectamente (ver Figura 3).
3. La regeneración del sistema: en las interacciones con una tasa de disociación lenta (k d), el analito debe ser despojado del ligando mientras que preserva la integridad funcional y estructural de la latter. Si la disociación y / o regeneración son incompletos, la señal de SPR decaerá gradualmente en inyecciones posteriores del analito. Condiciones de regeneración típicos que se pueden probar son las altas concentraciones de Mg 2 + (hasta 2 m), condiciones ácidas o básicas (por ejemplo, 10 mM glicina pH 2,5, NaOH 10 mM), alto contenido de sal (hasta 4 M NaCl), o alta concentración de detergente (por ejemplo, 1% DDM). Sin embargo, la eficacia de regeneración de estos reactivos (y otros) es y por lo tanto las condiciones regeneraciones deben ser probados altamente específica del sistema. En algunos casos, la interacción es tan estable y fuerte que la regeneración nunca es completa, como en el caso de la E. coli sistema de transporte de la vitamina B 12 (BtuCD-F) 7. En tales condiciones, la única opción es desnudar el ligando del chip biosensor y volver a cargar un nuevo lote para cada inyección. En los casos en que la disociación del analito del ligando es la regeneración superficie rápida y completa es innecesaria(Véase el protocolo y las Figuras 2-3).
4. Las proteínas de membrana siempre se purifican en presencia de detergente, que puede afectar las tasas de sensibilidad y reacción SPR. Sin embargo, en nuestra experiencia con BtuCD, las tasas medidas son muy similares. Uno siempre tiene que obtener evidencia que apoya el uso de enfoques complementarios, como la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), ensayos de pull-down, ensayo de sedimentación liposoma, etc. Por ejemplo se ha demostrado una correlación entre la SPR y otras técnicas para la metionina, vitamina B 12, y dos sistemas de molibdato 6,12.
Determinación errónea de los constantes cinéticas a menudo se produce durante el proceso de adaptación. Como regla general, siempre se aplica la sencilla Langmuir 1: 1 para modelo de interacción de análisis experimentos cinéticos. Los modelos más complejos hacen suposiciones adicionales de cambios conformacionales, analito bivalente, o muestra de la heterogeneidad. Estos supuestos deben serhecho sólo si se acompaña de pruebas de otros enfoques experimentales. Tenga en cuenta que la aplicación de estos modelos será muy probablemente a Chi 2 valores mejor ajuste y más bajos, pero esto no debe ser visto como un testimonio de su fiabilidad. Los mayores grados de libertad que ofrecen los modelos más complejos suelen ser responsables de la mejor ajuste, más que por su relevancia mecanicista.
Una de las ventajas de la SPR es su amplia compatibilidad química, especialmente con respecto a los detergentes que se utilizan para solubilizar y purificar proteínas de membrana. Sin embargo, sacarosa y glicerol (y otras soluciones viscosas) que a menudo se añade durante el proceso de purificación de proteínas de membrana tienen efectos dramáticos en la RU. Por lo tanto, se recomienda evitar estos si es posible, o al menos reducir su concentración. Cuando se utilizan soluciones viscosas, evitando desajuste tampón se vuelve esencial. Adición de lípidos a un detergente que contiene RB puede amplificar la señal de uniónal por tanto como diez veces. Sin embargo, tal esfuerzo es caro (para la mayoría de los lípidos) y tiende a acortar la duración de la vida de los chips biosensores.
Los consejos y solución de problemas enumerados anteriormente pueden ayudar al calibrar un nuevo sistema. Sin embargo, un sistema dado a menudo requiere ajustes específicos (por ejemplo, elección del detergente, sal, pH) para lograr resultados óptimos.
SPR ha sido reconocida como un enfoque poderoso y único para medir las interacciones moleculares. En los últimos años la disponibilidad de diversas plataformas SPR y la reducción de costos ha hecho SPR más accesible. Se está convirtiendo rápidamente en el método estándar de oro para estudiar las interacciones proteína-proteína, proteína diana interacciones con las drogas, y en el descubrimiento de inhibidores de moléculas pequeñas de plomo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
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