Summary
Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI); de vorming en dissociatie van eiwitcomplexen, zijn belangrijke gebeurtenissen in veel biologische processen (bijvoorbeeld, replicatie, transcriptie, translatie, signalering, cel-cel communicatie). Semi-kwantitatieve studies van de PPI worden vaak uitgevoerd met behulp van pull-down of immuno-neerslag experimenten. Echter, deze (en dergelijke) technieken beperkt het bereik van affiniteiten die meetbaar (lage micromolaire affiniteit en hoger) door de wasstappen die inherent zijn aan dergelijke technieken. Dergelijke "eindpunt" technieken kunnen niet van voorbijgaande of lage affiniteit interacties die vaak van grote biologische gevolgen zijn te identificeren. Bovendien wordt de temporele resolutie van deze aanpak uiterst beperkt, gewoonlijk orden van grootte lager dan de tarieven van de reactie. SPR overwint deze tekortkomingen te wijten aan de verhoogde gevoeligheid en superieure temporale resolutie van 1,2. SPR is een label vrij methode, en als zodanigmoleculaire interactie kan worden gemeten (als de massa veranderingen kunnen worden gedetecteerd). Naast PPI, is uitgebreid gebruikt om eiwit-ligand, eiwit-geneesmiddel (of klein molecuul), eiwit-DNA en eiwit-RNA-interacties 3-5 karakteriseren. De resultaten worden geregistreerd en uitgezet in real time, die een snelle gewijzigde experimentele omstandigheden en flexibel experimenteel ontwerp maakt.
Het fysieke principe SPR gebaseerde instrumenten is het gebruik van een optisch systeem dat een verandering van de brekingsindex gemeten aan het sensoroppervlak op massaveranderingen 2. Eén van de interagerende partners (hierna ligand) geïmmobiliseerd op een polymeermatrix chip en de tweede molecule (hierna analyt) stroomt over het oppervlak. Analyt binding aan het ligand verandert de massa op het chip oppervlak. Deze massa verandering is direct en proportioneel verband met veranderingen in de brekingsindex van het oppervlak. De resultaten zijn uitgezet in realtimegepresenteerd als respons eenheden (RU) als functie van de tijd. Een dergelijke grafiek wordt aangeduid als Sensogram (bijvoorbeeld figuur 1). Aangezien SPR volgt de volledige tijdsverloop van de interactie, worden pre-evenwicht kinetische snelheidsconstanten verkregen, naast affiniteiten evenwicht. Zoals hieronder uiteengezet, de pre-evenwicht gedrag van een bepaald systeem bevat veel informatie, en geeft een ander perspectief dan evenwicht alleen. Zodra het systeem is gekalibreerd, experimenten zeer snel en vereist slechts kleine hoeveelheden eiwitmateriaal (microgram bedragen nanogram). Verzamelen de volledige kinetische informatie van een bepaald systeem kan op dagen. De hoge gevoeligheid van SPR biedt metingen die niet mogelijk zijn met behulp van een andere techniek 6. Echter, deze hoge gevoeligheid is een 'tweesnijdend zwaard', omdat het een belangrijke bron voor vals positieve data kan zijn. Elke factor die de brekingsindex van invloed is geregistreerd en uitgezet op de Sensogram. Als zodanig appropriate controles moeten worden gebruikt om vals-positieven te elimineren, en de steun van complementaire aanpak wordt sterk geadviseerd.
Figuur 1 toont het verloop van een SPR-experiment met een NTA beklede sensorchip. De Sensogram in panel A geeft de injectie van de nikkel-ionen over de NTA-matrix (unsubtracted gegevens), en panelen BD de gegevens weer te geven na aftrek van het signaal afkomstig van de negatieve controle cel. Rode en blauwe pijlen geven injectie begin en einde, respectievelijk. Immobilisatie van de ligand op de chip geleidelijk verandert de massa tot injectie beëindigd. De stabiele plateau waargenomen na beëindiging van de injectie ligand weerspiegelt de stabiele associatie van de ligand aan het oppervlak (Figuur 1B, cyclus 2). Zodra een stabiele basislijn wordt bereikt een buffer wordt geïnjecteerd over het ligand en de celverwijzing (Figuur 1B, cyclus 3) .Deze injectie dient als een 'blanco-controle ", en zal zijnafgetrokken tijdens de analyse. Bij inspuiting zijn kleine wijzigingen opgenomen, hetgeen een stroom van massa door de chip. Vervolgens in een aparte cyclus (Figuur 1B, cyclus 4), de analyt wordt geïnjecteerd; de geleidelijke toename RU vertegenwoordigt vereniging van de analyt aan het ligand. De bindingsplaatsen raken geleidelijk bezet tot evenwicht is bereikt. Zodra injectie eindigt, een daling van de SO's weerspiegelt dissociatie van het complex. Uit zulke sensogrammen pre-evenwicht en evenwicht snelheidsconstanten worden afgeleid (zie later). Figuur 1 toont een transiënte interactie tussen het ligand en de analyt. Wanneer de interactie is stabieler, de daling van de RU-niveau is langzamer, als gevolg van een lagere k d.
Hierin beschrijven we een SPR experiment gericht op het karakteriseren van de interactie tussen een membraan transporter (detergens oplosbaar) en de functionele partner zijn verwante substraat bindend eiwit 6,7. De gekozen model-systeem is een ATP-binding cassette (ABC) transporter, ModBC-A van Archeaglobus fulgidus. Dit systeem is 'aan / uit' tarieven geselecteerd voor zijn zeer reproduceerbare resultaten, hoge signaal-ruisverhouding en klassieke. Daarnaast homologen ABC transporters zijn beschikbaar om als belangrijke negatieve controles dienen. De vervoerder, ModBC (ligand A) wordt gewonnen uit het membraan met afwasmiddel, gezuiverd en geïmmobiliseerd op de chip. De oplosbare interactie partner, moda, is de analyt. Als negatieve controle ligand, wordt een andere ABC transporter RbsBC gebruikt ("ligand B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eiwitmonster en Buffer Voorbereiding
- Monstervoorbereiding: zuiveren het eiwit van belang en of alle aggregaten worden verwijderd door het injecteren van het proteïne voorafgaand aan het experiment op een gelfiltratie kolom of ultracentrifugatie (meestal 10 min bij 100.000 xg is voldoende).
OPMERKING: Hoewel wenselijk, zeer zuivere eiwit voorbereidingen zijn geen must. SPR is met succes gebruikt bij minder dan perfecte zuiveringen en zelfs droge stof 8,9. - Buffer voorbereiding:
- Bereid de buffer van het experiment (genoemd "running buffer" of RB). Voor de hier beschreven protocol gebruikt 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl en 0,05% (w / v) DDM (n-dodecyl β-D-maltoside). Houd in gedachten dat de keuze van de buffer samenstelling gemakkelijk kan worden aangepast aan het bestudeerde systeem.
- Filter alle buffers en eiwitten monsters met behulp van 0,22 pm filters. Zorg ervoor dat op voorhand dat de filters zijn eiwit-compatibel. In het algemeen recentelijk met SPR platforms bevatten een in-line de-Gasser; indien dit niet het geval is, de gas de buffers voor gebruik.
- Dialyseren nachts of verdun de monsters tegen de RB naar buffer mismatches voorkomen. Dialyse (of een andere methode van bufferuitwisseling) is vooral geschikt bij gebruik van chemicaliën met hoge viscositeit (bijvoorbeeld sucrose, glycerol, DMSO). Voor het aansluiten van de RB fles naar de inlaat van de pomp te houden opzij 10 ml van de RB in een aparte buis.
- Verdun de geconcentreerde ligand voorraad in RB tot een uiteindelijke concentratie van ~ 20 pg / ml. Als vuistregel voor stabiele ligand immobilisatie, gebruiken lage ligand concentraties met langere injecties bij lage stroom, in tegenstelling tot hoge concentraties, hoge stroomsnelheden en kortere injecties.
- Verdun de analyt in de RB tot de gewenste concentratie. Typisch, het testen van de reeks concentraties voor een systeem van onbekende affiniteit van 10 uM tot 10 nM in tienvoudige verdunningen. Begin altijdmet de lagere concentraties eerste.
2. Sensor Chip
- Chip selectie: Gebruik een nitrilotriazijnzuur (NTA) gekoppeld chip geschikt voor het vastleggen van eiwitten met een oligo-histidine tag.
- Chip gebruik:
- Bij gebruik van een nieuwe chip, neem de chip uit de schede, spoel voorzichtig met dubbel gedestilleerd water (DDW), afdrogen zorgvuldig resterende vloeistoffen met behulp van delicate ruitenwissers, en zorg ervoor dat de goudlaag oppervlak niet aanraakt. Plaats de chip weer in de schede in de juiste oriëntatie (de insertie glad wanneer de chip correct is geplaatst).
- Bij hergebruik van een chip, neem de opgeslagen chip uit de buffer, goed naspoelen met DDW en droog voorzichtig zoals hierboven vermeld, en plaats in zijn originele schede.
OPMERKING: De accumulatie van niet-specifieke ongewenste materiaal op de chip zijn levensvatbaarheid beïnvloeden. Dit kan worden gecontroleerd door de spoorwegondernemingen te vergelijken voorafgaand aan ligand immobilisatie en post strippen. Hoewel veel metingen kunnen wordengedaan met behulp van dezelfde NiNTA chip, de kwestie van de lange levensduur is niet een 'duidelijke cut' en varieert sterk tussen de verschillende chips.
- Chip docking: Open de sensor chip deur en plaats de chip in de schede. Bij gebruik van een nieuwe chip, serienummer invoeren van de chip om het gebruik register bijhouden. Sluit de deur en druk op 'dock chip'.
3. Temperatuur Instellingen
- Stel de chip celtemperatuur tot 25 ° C (of het experiment temperatuur voorkeur).
- Optioneel: set monsters compartiment 7 ° C aan de eiwitten gedurende het experiment stabiel.
4. Oplossingen voor laden en Strippen
Bereid de volgende oplossingen voor het laden en strippen: 0.5 mM NiCl2 in RB, 350 mM EDTA in RB (wasmiddel aan EDTA oplossing tot een uiteindelijke concentratie als in RB), 0,25% SDS in H2O en 100 mM HCl in H 2 O. Bij het gebruik van micro-centrifuge tubes en niet spr aangewezen buizen, vergeet dan niet om de doppen van de buizen af te snijden.
5. Prime de SPR Instrument met RB
6. Start een Nieuwe Run
- Stel de stroomsnelheid die wordt gebruikt tijdens het experiment. Voor de hier beschreven resultaten te bereiken stelt de materiaal- 50 pl / min.
OPMERKING: Deze parameter kan tijdens het experiment worden gewijzigd. - Definieer de stroomwegen en referentie aftrekken. Om de hier beschreven ingestelde paden Fc = 1 en Fc = 2, aftrekken Fc = 1/2 resultaten.
OPMERKING: Het programma wordt weergegeven in real-time het aftrekken van twee gemeten cellen. Houd in gedachten dat deze parameter niet tijdens het experiment kan worden gewijzigd. - Selecteer de geschikte steekproef rek (het kan het monstervolume verbruik beïnvloeden).
- Sla het bestand met resultaten.
7. Experiment Cycles
Elk experiment bestaat uit cycli, houden een duidelijk overzicht van de injecties gedaan in each-cyclus, en scheiden de liganden 'laden, lege injectie van de buffer, en de analyt injectie in verschillende cycli.
- Cyclus 1: Chip voorbereiding en nikkellading
- Zorg ervoor dat de stroom en de paden worden ingesteld volgens stap 6.1 en 6.2.
- Injecteer 350 mM EDTA gedurende 1 min weg restjes wassen.
- Stel stroom 10 pl / min.
- Injecteer 0,5 mM NiCl2 2 min.
OPMERKING: Nu is de chip hars wordt bekleed met nikkel-ionen.
- Cyclus 2: Liganden immobilisatie
- Stel flow 15 pl / min, stromingsbaan Fc = 2.
- Injecteer ligand A tot aan RU waarden die 10-20 vouw van het molecuulgewicht. Plaats bijvoorbeeld een ligand van 50 kDa tot 500-1.000 spoorwegondernemingen. Een register bijhouden van de RU waarde bereikt.
- Stel flow 15 pl / min, stromingsbaan Fc = 1.
- Injecteren ligand B (controle) tot dezelfde RU waarde als die van ligand A. Monitor het aftrekken Sensogram (Fc = 2-1) on-line te helpen de controle van deinjectie lengte.
- Set stroom 50 pl / min, stromingsbaan Fc = 1 en Fc = 2, was het voor 5-20 min tot de basislijn (Fc = 1/2) stabiliseert.
- Cyclus 3: Blank injectie. Deze injectie zal dienen voor blanco aftrekken derhalve alle onderdelen die worden geïnjecteerd met het analyt, behalve de analyt zelf omvatten.
OPMERKING: Injectie lengte kan variëren afhankelijk van de tijd die nodig is om evenwicht (signaal plateaus) te bereiken.- Stel flow 15 pl / min, stromingsbaan Fc = 1 en Fc = 2, Fc = 2-1 aftrekken.
- Plaats de "wacht" commando (hierna als "wachten") gedurende 30 seconden (een stabiele basislijn te hebben).
- Injecteren 15 sec RB.
OPMERKING: De duur van de injectie zal variëren tussen de verschillende systemen, afhankelijk van hun pre-evenwicht kinetische constanten (meestal de k a). - Wacht 120-600 sec de dissociatiefase te nemen.
OPMERKING: De duur van deze stap varieert afhankelijk van de
- Cyclus 4: Analyte injectie
- Copy / paste de exacte voorwaarden worden gebruikt in de referentie-injectie (cyclus 3), zodat deze twee injecties kan later worden afgetrokken. De locatie van de sleuf in de rek van het ene bedrijf de controleoplossing die de analyt oplossing bevat. Kies een concentratie die iets boven de verwachte KD. Als er geen voorkennis is beschikbaar, kiest u 1 uM als een goed uitgangspunt.
- Cyclus 5: Buffer injectie
- Herhaal de cyclus 3.
- Cyclus 6: Analyte injectie
- Herhalingscyclus 4.
- Cyclus 7: Chip strippen af
- Stel stroom 50 pl / min. </ Li>
- Injecteer 350 mM EDTA gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap nog twee keer. Gebruik geen enkele injectie van 3 min als dit de chip kan beschadigen.
- Injecteren 0,25% SDS gedurende 1 min. Herhaal deze stap nog twee keer. Gebruik geen enkele injectie van 3 min als dit de chip kan beschadigen.
- Als basisniveau niet bereikt, Injecteer 100 mM HCl gedurende 1 minuut als extra stripstap.
- Steek het 'einde run "commando dat overschakelt naar de stand-bymodus.
- Chip opslag
- Loskoppelen van de sensor chip en neem het uit van het instrument.
- Neem de sensor uit de schede, vermijd het oppervlak aan te raken, spoelen met DDW, en plaats in een 50 ml buis met RB. Bewaar bij 4 ° C.
8. analyse met behulp van Aangewezen Evaluation Software
- Voer de volgende stappen uit om de ruwe data verkregen door SPR voor afleiding van de kinetische parameters te verwerken.
- Met behulp van de evaluatie software, geopendde resultaten bestand, selecteer cycli 3-6 Fc = 2-1 (referentie afgetrokken gegevens).
- As shift:
- Weergave cycli 3-6.
- Nul de Y-as de waarde van de basislijn (de eerste 30 seconden wachttijd per cyclus) om alle vier bochten.
- Lijn de X-as van de vier bochten. Kies uitgesproken kenmerken (bv, pieken van injectie start of finish) om perfect uitlijnen van de vier bochten langs de X-as. Stel het tijdstip van aanvang van analyt (of controle buffer) op nul.
- Referentie aftrekken
- Aftrekken van de achtergrond respons door het aftrekken curve van de cyclus 3 uit curve van de cyclus 4 en curve van de cyclus 5 uit curve van cyclus 6. Gebruik de curve aftrekken operatie die kan worden gevonden in de Y-as verschuift menu.
OPMERKING: Het is belangrijk om deze stap als het vernietigt elke niet-specifieke onderdelen (los van de analyt) dat het oppervlak brekingsindex invloed kunnen zijn geweest uit te voeren.- Sla de afgetrokken bochten in tHij vel project onder een andere naam.
- Zie deze curven als "dubbel afgetrokken curves": de eerste is het aftrekken 2-1 aftrekking uitgevoerd op zowel injecties, en de tweede is het aftrekken van een curve van een ander.
OPMERKING: Een dergelijke dubbele verwijzing is de gouden standaard in SPR experimenten. - Overlay de afgetrokken bochten door het uitvoeren van as shift zoals eerder uitgelegd.
- Aftrekken van de achtergrond respons door het aftrekken curve van de cyclus 3 uit curve van de cyclus 4 en curve van de cyclus 5 uit curve van cyclus 6. Gebruik de curve aftrekken operatie die kan worden gevonden in de Y-as verschuift menu.
- Bepaling van de kinetiek constanten en modelfitting
- Het uitvoeren van een kinetische experiment
- Injecteer reeks 6-7 analytconcentraties betrouwbare gegevens voor kinetische constanten bepaling te hebben. Kies analyt concentraties 10-voudig hoger 10-voudig lager dan de geschatte Kd, 2-3-voudige verdunningen. Neem de "nul" concentratie, later gebruikt voor dubbele referentie aftrekken (zie hierboven). Gedrag injecties in drie exemplaren en in willekeurige volgorde.
- Richtenen aftrekken alle curven met betrekking tot de Y-as en X-as voordat passingsprocedure.
- Modelfitting
- Selecteer een geschikte analyse programma.
LET OP: De meeste beschikbare montage programma's bieden verschillende modellen die kunnen worden toegepast voor de montage en de bepaling van kinetische constanten. - Breng de eenvoudigste model (Langmuir) uitgaande van een omkeerbare 1: 1 interactie tussen de analyt en de ligand voor montage. Behalve overtuigend gegevens uit andere experimentele methoden voor het bestaan van een complexe interactie, altijd de eenvoudige Langmuir model.
- Selecteer een geschikte analyse programma.
- Het uitvoeren van een kinetische experiment
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het hier beschreven systeem wordt een NiNTA chip gebruikt om de His-tag membraan transporter 6,7 immobiliseren. Omdat het een homo-dimeer, wordt elke transporter dubbel gelabeld, verbetering van de binding aan de NiNTA chip. Volgende nikkellading, ligand A (de vervoerder van belang) wordt geïmmobiliseerd op Fc = 2, tot ~ 3500 RU (protocol cyclus 2, figuur 2A zwart label). Vervolgens worden met dezelfde stroomsnelheid en inspuitduur, ligand B (controle ligand) wordt geïnjecteerd Fc = 1, aanvankelijk bereiken slechts tot ~ 3000 RU. Om ervoor te zorgen dat vergelijkbaar eiwit bedragen worden geïmmobiliseerd op zowel stroom cellen; ligand B wordt verder geladen, met behulp van een kortere injectie, terwijl zorgvuldig bewaken van de belasting tot 3.500 spoorwegondernemingen. De 'trappen' vorm vertegenwoordigt de geleidelijke toename van de massa op Fc = 1 op elke injectie (Figuur 2A grijze label). Een on-line monitoring van Fc = 2-1 helpt het beheersen van de gelijke ligand laden. Figuur 2B toont de Fc = 2-1 aftrekken, dat wil zeggen, af te trekken van de maximale RU-waarde in Fc = 2, van de stappen van stapsgewijze in de RU waarde in Fc = 1. Het is belangrijk dat de duur van de injectie liganden "variëren gelijke hoeveelheden van de onderzochte en controle liganden bereiken. Daarentegen, bij het injecteren van de analyt, de duur van de injectie moet constant voor alle concentraties cyclisch 3 bewaard gebruikt. Figuur 3A en 3B tonen de responsen gemeten door injectie van een blanco analyt (bijv RB weglating van de analyt) en 5, en de analyt injecties (in cycli 4 en 6). Merk op dat zowel sensogrammen vertegenwoordigen de Fc = 2-1 aftrekken. In elk van de cycli (06/03) dezelfde analyt injectie (blanco of een bepaalde concentratie) wordt aangebracht op de twee stromen cellen, geïmmobiliseerde verschillende liganden. De twee herhalingen superimpose zeer goed, het aantonen van de hoge reproduceerbaarheid van de SPR. Een antwoord wordt opgenomen in beide gevallen; ~ 3 RU voor de blanco versus ~ 40 RU voor de analyt. Deze waarden vertegenwoordigen de signaalruisverhouding van ~ 13. Om de dubbele verwezen sensogrammen, die slechts de specifieke binding respons te krijgen, wordt de lege injectie nu afgetrokken van de analyt injectie (~ 37 RU, Figuur 3C). De Sensogram opgenomen toont het karakteristieke patroon van een transiënte interactie. Na injectie wordt de vereniging fase gekenmerkt door een snelle toename van de hoeveelheid ligand gebonden analyt, bereiken steady state na ca. 7 seconden. De steady state wordt gehandhaafd zolang als de analyt wordt geïnjecteerd. Wanneer de injectie beëindigd, worden de cellen gewassen met RB triggering de dissociatiefase. Het complex snel dissocieert en de analyt van het ligand wordt gewassen het SPR signaal terugkeert tot de basislijn.
Kwantitatieve gegevens (pre-evenwicht en evenwichtsconstanten) krijgen, wordt een reeks van analytconcentraties geïnjecteerd in duplo of triplo (zie 8.3.1 in protocol).
Figuur 1. Illustratie van de stappen van een SPR experiment met behulp van een Ni-NTA sensorchip. (A (B - D) Illustratie van de Fc = 2-1 Sensogram opgenomen tijdens een SPR-experiment. In cyclus 2 als zijn gelabelde ligand wordt geïnjecteerd over de Ni-geladen oppervlak, massa geleidelijk accumuleert. Injectie wordt beëindigd bij het bereiken van een definitieve RU waarde variërend tussen 1000-5000 RU (afhankelijk van MW het ligand's). Een basislijn wordt gevormd, als gevolg van de stabiele binding van de ligand aan de chip. In cyclus 3, wordt een lege injectie voorgevormd, het injecteren van de componenten van de analyt monster exclusief alleen de analyt. In deze injectie vaak een lage respons is opgenomen (1-5 spoorwegondernemingen). In cyclus 4 de te analyseren stof wordt geïnjecteerd met behulp van dezelfde regeling als de lege injectie. De toenemende SO weerspiegelen de massaverandering op het oppervlak, dat wil zeggen, de binding van de analyt aan het ligand. Het signaal snel toeneemt en vervolgens plateaus als the-systeem in evenwicht is gekomen. Wanneer de injectie beëindigd, de analyt dissocieert van het ligand resulteert in een afname van het signaal en terug tot de uitgangswaarden.
Figuur 2. On line monitoring van ligand belasting. (A) Unsubtracted rondingen van ligand laden. Het ligand van belang (ligand "A") wordt geladen naar cel 2 (Fc = 2, zwart) stromen tot aan het gewenste spoorwegondernemingsniveau (~ 3500 RU in dit voorbeeld). Vervolgens wordt de negatieve controle ligand (ligand "B") wordt stapsgewijs geladen op doorstroomcel 1 (Fc = 1, grijs) tot een identiek spoorwegondernemingsniveau bereikt. (B) De twee injecties uitgevoerd (A) in real tijd als Fc = 2-1 aftrekken. Deze monitoring vergemakkelijkt identiek laden van liganden van rente en controle.
Figuur 3. Dubbelklik verwijzing. (A) Duplicaten van een 2-1 aftrekken (dwz, Fc = 2-1) van de blanco injectie. (B) Zoals in (A), wordt alleen analyt geïnjecteerd. (C) Definitieve sensogrammen na aftrek van het achtergrondniveau weergegeven in (A) van de gemeten respons in (B). Deze curven worden aangeduid als 'double Blanked "of" double verwezen ". Duplicaten zijn van opeenvolgende cycli.
. Figuur 4. Bepaling van de kinetische snelheidsconstanten door injecties van meerdere analytconcentraties (in duplo) De zwarte lijnen zijn de aanvallen die werden berekend met behulp van een eenvoudige 1: 1 Langmuir interactie model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR is een zeer gevoelige methode om moleculaire interacties te bestuderen, en is vaak de enige aanpak die real-time monitoring van voorbijgaande aard (nog belangrijker) interacties zorgt. Een voorbeeld is de transiënte interactie hierin gepresenteerde, die niet kan worden gedetecteerd door een andere methode (pull-down assays liposomen sedimentatie 6 assays). Bovendien, terwijl andere werkwijzen zijn beperkt tot metingen evenwicht (kwantitatief of kwalitatief), SPR is een van de weinige technieken die meten ook de pre-evenwicht kinetiek.
De verhoogde gevoeligheid is ook zijn waarschuwing. Vals-positieve sensogrammen worden gemakkelijk opgenomen. Het wordt daarom aanbevolen om het bestaan van de interactie met andere methoden voordat SPR metingen stellen. Voorafgaande kennis van de kenmerken van het systeem (ruwe schatting van de K D, stabiel versus voorbijgaande interactie) is zeer behulpzaam bij het opzetten van SPR experiments en evalueren van de functionele betekenis van de verkregen metingen. Een belangrijk punt om in gedachten te houden voordat SPR metingen is de kwaliteit van het eiwit monsters. SPR is zeer gevoelig voor aggregaten en deze moeten zowel het ligand en de analyt preparaten (door gelfiltratiechromatografie of ultracentrifugatie indien mogelijk) verwijderd. Een andere bron van ruis en valse signalen kunnen voortvloeien uit buffer mismatches tussen de RB en de buffer van de analyt. Dit kan worden opgelost door dialyseren de analyt tegen de RB, of door een sterk geconcentreerde preparaat van de analyt die wordt verdund veel plooien (~ 100-1.000-voudig) in de RB. Vals positieve gegevens kunnen ook het gevolg zijn van niet-specifieke interacties van de analyt met matrix van de chip of met de negatieve controle. Deze interacties zijn van lage affiniteit, zodat soms worden vermeden door lage concentraties analyt. Bovendien opneming van lage BSA en / of detergens concentraties (0,1 mg / ml en / of 0,05-0.1% (W v /), respectievelijk) om de RB en de geïnjecteerde monster analyt-specifieke interacties verminderen. De inhoud van de negatieve controle cellen (verschillende negatieve controle) veranderen is een andere aanpak om specifieke binding kwesties. Ook een andere soort chip kan ook invloed op de kwaliteit van de gegevens. Verschillende soorten sensor chips zijn in de handel verkrijgbaar, op basis van verschillende chemie. In de meest gebruikte sensorchip (CM-5 chip) gecarboxymethyleerd dextran covalent gehecht aan een goudoppervlak. Eiwitten kunnen covalent worden gekoppeld aan het sensoroppervlak met verschillende eenvoudige oppervlakchemie (meestal amine of thiol koppeling). Echter, in onze handen, bij het werken met membraaneiwitten covalente immobilisatie levert vaak artefacten en dus niet de methode van keuze. In de context van het bestuderen van een membraaneiwit, is het opmerkelijk dat er commerciële chips die zijn gecoat met lipofiele moleculen. Deze maken het immobilization van membraaneiwitten op een native-achtige omgeving. Vergelijkbare sensor chips kunnen ook worden bereid 'in huis'. Voor een beschrijving van andere koppelingsmethoden zien 10,11. De hierin beschreven protocol is gebaseerd op het gebruik van Ni-NTA chip voor de immobilisatie van een His tag, detergens gesolubiliseerde transporter (de analyt niet His-gemerkte analyt te binden aan het chip oppervlak beschadigt). In onze ervaring 6,12, kinetische constanten verkregen uit proeven uitgevoerd met Ni-NTA chips komen goed overeen met die bepaald natief-achtige omgevingen. Hoewel Ni-NTA chips relatief duur, hun primaire voordeel dat ze kunnen worden ontdaan van ligand en hergebruikt. Honderden metingen kunnen worden gedaan per chip. Bovendien is de oriëntatie van de ligand op de chip bepaald door de positie van de His-tag en dus vrij homogeen.
Wanneer een interactie succesvol opgenomen door SPR, een reeks controles en Repeats zijn nodig om de geldigheid van het SPR signaal te controleren. Verificatie van de volgende parameters kan helpen om de SRP gegevens te valideren:
1. Specificiteit van het SPR signaal: als gevolg van de hoge gevoeligheid van SPR, het gebruik van de juiste negatieve controles is van bijzonder belang. Non-specifieke interactie opgenomen door SRP kan zijn vanwege de adsorptie van een analyt aan de matrix. Daarom is een lege stroomcel is vaak niet de beste optie aangezien een stroomcel geladen met eiwit (de ligand) is chemisch equivalent aan een lege stroomcel. Een betere optie is om een inactieve mutant variant van het ligand, een die bekend is van de te analyseren stof niet te binden gebruiken. Als alternatief kan men een soortgelijke gemuteerd analyt gebruikt. Indien dergelijke mutanten zijn niet beschikbaar voor een homoloog eiwit (maar met verschillende bindingsspecificiteit) worden gebruikt 12. Voorbeelden van goede negatieve controles een homologe ligand (zoals hier beschreven), of een puntmutatie in één van de interagerende partners die bekend isafschaffing van de vereniging. Een andere aanbevolen negatieve controle is verandering van een post-translationele modificatie (bijvoorbeeld fosforylering, methylering, thiol afleiding) die essentieel is voor de interactie. Bijvoorbeeld, de fosforylatie van tyrosine die essentieel is voor SH2 domein interactie. Andere negatieve controles kan het systeem specifiek zijn. Bij het gebruik van SPR, kan het belang van het gebruik van strenge negatieve controles niet worden overschat.
2. Reproduceerbaarheid van het SPR signaal: SPR is een zeer reproduceerbare methode. Als gelijke hoeveelheden ligand worden geladen op de biosensor chip en gelijke concentratie van de analyt wordt geïnjecteerd de herhalingen moeten perfect uitlijnen (zie figuur 3).
3. Regeneratie van het systeem: in interacties met een lage dissociatiesnelheid (kd), de analyt moet worden gestript van het ligand met behoud van de functionele en structurele integriteit van de latter. Indien dissociatie en / of regeneratie onvolledig zijn, zal de SPR signaal geleidelijk verval op de volgende injecties van de analyt. Typische regenererende omstandigheden die getest kunnen worden hoge concentraties Mg2 + (tot 2 M), zure of basische omstandigheden (bijvoorbeeld 10 mM glycine pH 2,5, 10 mM NaOH), hoog zoutgehalte (tot 4 M NaCl) of hoge detergent concentratie (bv 1% DDM). De regenererende werking van deze reagentia (en anderen) is zeer systeem- en daardoor regeneratie voorwaarden moeten worden getest. In sommige gevallen, de interactie zo stabiel en sterk dat regeneratie niet voltooid, zoals in het geval van de E. coli vitamine B12 transportsysteem (BtuCD-F) 7. Onder dergelijke omstandigheden is de enige optie voor de ligand uit de biosensor chip strippen en herladen een verse partij voor elke injectie. Wanneer de dissociatie van de analyt uit het ligand snel en volledig oppervlak regeneratie overbodig(Zie protocol en de figuren 2-3).
4. Membraan eiwitten steeds gezuiverd in aanwezigheid van detergens, die invloed hebben op de SPR gevoeligheid en reactiesnelheden. Echter, in onze ervaring met BtuCD, de gemeten tarieven zijn zeer vergelijkbaar. Men moet altijd bewijsmateriaal te gebruiken gratis benaderingen zoals size exclusion chromatografie (SEC) te verkrijgen, pull-down assays, liposoom sedimentatie assay, etc. Bijvoorbeeld een correlatie tussen de SPR en andere technieken is aangetoond voor de methionine, vitamine B-12, en twee molybdaat systemen 6,12.
Onjuiste vaststelling van de kinetische snelheidsconstantes ontstaat vaak tijdens de montage proces. Als vuistregel geldt, gelden altijd de eenvoudige Langmuir 1: 1 interactie model voor analyse kinetische experimenten. De meer complexe modellen maken aanvullende hypothesen van vormveranderingen, bivalente analyt, of monster heterogeniteit. Deze veronderstellingen moetenalleen gemaakt indien dit wordt ondersteund door gegevens uit andere experimentele benaderingen. Merk op dat het toepassen van deze modellen zal zeer waarschijnlijk leiden tot een betere pasvorm en lagere Chi 2 waarden, maar dit moet niet worden gezien als een getuigenis voor hun betrouwbaarheid. De hogere mate van vrijheid geboden door de complexe modellen zijn meestal verantwoordelijk voor betere pasvorm, in plaats van hun mechanistische relevantie.
Eén van de voordelen van SPR het uitgebreide chemische bestendigheid, in het bijzonder met betrekking tot detergentia die worden gebruikt voor het solubiliseren en te zuiveren membraaneiwitten. Echter, sucrose en glycerol (en andere visceuze oplossingen) die vaak worden toegevoegd tijdens het zuiveringsproces van membraaneiwitten dramatische gevolgen voor de RU. Daarom wordt aanbevolen zo mogelijk deze te vermijden of althans de concentratie te verminderen. Bij het gebruik van viskeuze oplossingen, het vermijden buffer mismatch essentieel wordt. Het toevoegen van lipiden aan een detergent met RB kan de binding teken versterkenal met zoveel als tien keer. Echter, deze inspanning is duur (voor de meeste lipiden) en de neiging om de levensduur van de biosensor chips verkorten.
De bovenstaande tips en het oplossen van problemen kan helpen bij het kalibreren van een nieuw systeem. Echter, een bepaald systeem vereist vaak specifieke afstellen (bv keuze van wasmiddel, zout, pH) optimaal resultaat.
SPR is lang erkend als een krachtige en unieke benadering van moleculaire interacties te meten. In de afgelopen jaren de beschikbaarheid van verschillende SPR platforms en hun dalende prijzen SPR toegankelijker heeft gemaakt. Het is snel de gouden standaard benadering van proteïne-proteïne interacties doelwit eiwit-interacties te bestuderen en ontdekken lead kleine molecule inhibitoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
