Summary
표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.
Introduction
단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI); 형성과 단백질 복합체의 해리는 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 복제, 전사, 번역, 신호 전달, 세포 - 세포 통신)의 주요 이벤트입니다. PPI의 반 정량적 연구는 종종 풀다운 또는 면역 침전 실험을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 (유사한) 기술로 인해 이러한 기술에 내재 된 세척 단계로 측정 할 수있다 친화의 범위 (낮은 마이크로 몰과 높은 친 화성을) 제한됩니다. 이러한 "엔드 포인트"기술은 종종 큰 생물학적 결과의 일시적인 또는 선호도가 낮은 상호 작용을 식별 할 수 없습니다. 또한, 이러한 접근 방식의 시간 해상도는 극도의 반응 속도보다 느리다 보통 수주 제한된다. SPR은 인해 높아진 감도와 뛰어난 시간 해상도 1, 2에 이러한 단점을 극복한다. SPR과 같은, 라벨없는 방법(질량 변화를 검출 할 수있는 것이면), 분자 상호 작용은 측정 할 수있다. PPI 이외에, 그것은 광범위 단백질 - 리간드, 단백질 약물 (또는 작은 분자), 단백질 DNA, RNA 및 단백질 상호 작용 3-5을 특성화하는데 사용되어왔다. 결과 기록 및 실험 조건과 유연한 실험 설계의 신속한 수정을 가능하게 실시간에 그려집니다.
SPR 기반 악기 뒤에 물리적 원리는 질량이 변화에 따라 센서면에서의 굴절률의 변화를 측정하는 광학 시스템의 이용이다. 상호 작용 파트너 (이하 리간드) 중 하나는 폴리머 매트릭스 칩과 상기 제 분자 (이하, 피검) 표면 상에 고정화 흐르게된다. 분석 물에 결합하는 리간드 칩 표면에 질량을 변화. 이러한 질량의 변화는 직접적으로 비례 표면의 굴절률의 변화에 관한 것이다. 그 결과를 실시간으로 플롯 및시간의 함수로서 반응 단위 (RU)로 표시. 이러한 플롯은 sensogram이라고한다 (예를 들어, 그림 1). SPR은 상호 작용의 전체 시간 코스를 따르기 때문에, 미리 평형 운동 속도 상수는 평형 친화도에 부가하여, 유도된다. 아래에 설명 된 바와 같이, 주어진 시스템의 사전 평형 동작은 많은 정보를 보유하고, 혼자 평형보다 매우 다른 관점을 제공한다. 시스템이 교정되면, 실험은 매우 빠르며 (나노 그램 양하는 마이크로 그램) 단백질 물질의 소량을 필요로한다. 주어진 시스템의 전체 운동 정보를 수집하는 일 달성 될 수있다. SPR의 높은 민감도는 다른 기술 6을 사용 불가능 측정을 제공한다. 그러나이 감도는 위양성 데이터의 주요 원인이 될 수 있기 때문에 '양날의 칼'이다. 반사 지수에 영향을 미치는 요인은 기록 sensogram에 그려집니다. 같은 AP로방법은 적절한 제어는 가양를 제거하는 데 사용되어야하며, 상호 보완적인 접근 방식의 지원은 매우 좋습니다.
도 1은 NTA 코팅 센서 칩을 이용하여 SPR 실험의 진행을 도시한다. 패널에 sensogram는 NTA 매트릭스 위에 니켈 이온 (unsubtracted 데이터)의 주입을 도시하고, 패널은 BD 음성 대조군 세포로부터 유도 된 신호를 감산 한 후 데이터를 표시. 빨간색과 파란색 화살표는 각각 주입 시작과 끝을 보여준다. 분사가 종료 될 때까지의 칩 상에 리간드를 고정화 서서히 질량을 변경한다. 리간드의 분사 종료 후 관찰 안정 고원 표면 (그림 1B, 사이클 2)에 대한 리간드의 안정적인 관계를 반영한다. 안정한 기준선이 달성되면 버퍼 리간드 마도 주입 '빈 제어 "로서 기능 레퍼런스 셀 (사이클 3도 1b)을 통해 주입되고,되고분석에서 차감. 주입하면, 작은 변화는 칩을 통해 대량의 흐름을 반영, 기록됩니다. 그러면 별도의주기 (도 1b, 4 사이클)에서, 분석 물을 주입하고; RU의 점진적 증가는 리간드 분석의 관계를 나타냅니다. 평형에 도달 할 때까지 결합 부위가 점차 점유해진다. 즉시 분사가 종료로, RU에의 감소는 복잡한의 분리를 반영합니다. 미리 평형 평형 속도 상수가 도출 될 수 sensograms부터. (후에 참조) (1) 분석 물과 리간드 사이의 일시적인 상호 작용을 도시도. 상호 작용이 더 안정되면, RU 수준의 감소는 더 낮은 K D를 반영 느리다.
여기서 우리는, 동종의 기판 -6,7- 단백질 결합 막 수송 체 (세제가 용해) 및 그 기능 파트너 간의 상호 작용을 특성화 목표 SPR 실험을 설명한다. 선택 모드엘 시스템은 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 수송, Archeaglobus 오글로 부스 풀기 두스의 ModBC-A이다. 이 시스템은 요금 '온 / 오프', 그 재현성이 높은 결과 잡음비 높은 신호를 선택하고, 고전 하였다. 또한, 동체 ABC 트랜스 포터는 중요한 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. 수송 체는, ModBC (리간드)을 세제, 정제 상에 고정화 칩을 이용하여 막으로부터 추출 하였다. 그 용해 작용 파트너 모다는 피 분석이다. 음성 대조군 리간드, 다른 ABC 트랜스 포터는 RbsBC ( "리간드 B")를 사용한다.
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Protocol
1. 단백질 샘플 및 버퍼 준비
- 샘플 준비 : 관심의 단백질을 정화하고 젤 여과 컬럼으로 또는 초 원심 분리에 의해 이전에 실험에 단백질을 주입하여, 모든 집계가 제거되어 있는지 확인 (100,000 XG 충분 보통 10 분에서).
주 : 바람직한 고순도의 단백질 제제는 필수는 아니지만. SPR 성공적으로보다 적게보다는 완벽한 정제를 함께 심지어 총 추출 8,9로 사용되어왔다. - 버퍼 준비 :
- ( "버퍼를 실행 중"이라고, 또는 RB) 실험의 버퍼를 준비합니다. 프로토콜은 여기에 설명을 위해, 50 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨 및 0.05 % (w / v)의 DDM (N- 도데 실 β-D-말토 사이드)를 사용한다. 버퍼 조성물의 선택은 쉽게 공부 시스템에 따라 변경 될 수 있음을 유의하십시오.
- 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 버퍼 및 단백질 시료를 필터링합니다. 필터가 단백질 - 있는지 사전에 확인호환. 일반적으로, 최근에 판매 SPR 플랫폼은 인라인 드 GASSER를 포함; 이 경우, 탈 가스되지 않은 경우 종래에 사용하는 버퍼.
- 밤새 투석 완충액 또는 불일치를 피하기 위해 RB에 대해 샘플을 희석한다. 고점도의 화학 물질을 사용하는 경우 투석 (또는 버퍼 교환 된 임의의 다른 방법)이 특히 바람직하다 (예를 들어, 수 크로스, 글리세롤, DMSO). 펌프 흡입구에 RB 병을 연결하기 전에 별도의 튜브에 따로 RB 10 ㎖를 유지합니다.
- 20 ㎍ / ml의 ~ 최종 농도로 농축 RB 리간드 스톡을 희석. 높은 농도, 높은 흐름과 짧은 주사 반대로 엄지 손가락의 규칙으로, 안정적인 리간드 고정화, 저 유량에서 더 이상 주사 낮은 리간드 농도를 사용합니다.
- 원하는 농도 RB에 분석을 희석. 전형적으로, 10 배 희석액을 10 nm의 10 μM에서 알 친화 시스템의 농도 범위를 테스트한다. 항상 시작먼저 낮은 농도.
2. 센서 칩
- 칩 선택 : 니트릴 산 (NTA) 올리고 히스티딘 태그로 단백질을 캡처하기에 적합한 결합 된 칩을 사용합니다.
- 칩 사용 :
- 새로운 칩을 사용하는 경우, 칼집에서 칩을 꺼내 증류수 (DDW)으로 가볍게 씻어 섬세한 와이퍼를 사용하여 조심스럽게 남아있는 액체를 건조하고, 금 층 표면에 닿지 않도록해야합니다. (칩이 제대로 배치 할 때 삽입이 원활) 올바른 방향으로 다시 칼집에 칩을 놓습니다.
- 칩을 재사용하는 경우, 버퍼에서 저장된 칩을 꺼내 전술 한 바와 같이 부드럽게 DDW 건조 깨끗이 씻어 원래 칼집에 배치합니다.
주 : 칩 비특이적 정크 물질의 축적은 그 생존력을 '에 영향을 미칠 수있다. 이는 리간드 고정화 및 포스트 스트립 핑 된 RU를 비교함으로써 모니터링 될 수있다. 많은 측정 할 수 있지만같은 NiNTA 칩을 사용하여 수행, 장수의 문제는 '명확한'하지 않고 다른 칩 사이에 크게 다릅니다.
- 칩 도킹 : 센서 칩 문을 열고 칼집에 칩을 놓습니다. 새로운 칩을 사용하는 경우, 입력은 칩의 일련 번호는 사용 기록을 유지한다. 문를 눌러 '독 칩'을 닫습니다.
3. 온도 설정
- 25 ° C (또는 선호하는 실험 온도)에 칩 셀 온도를 설정합니다.
- 선택 사항 : 실험을하는 동안 안정적으로 단백질을 유지하기 위해 7 ° C에 샘플 구획을 설정합니다.
로드 및 스트리핑 4. 솔루션
H 2 O에 RB (RB 같이 최종 농도로 EDTA 용액에 세제를 추가)에 RB 0.5 mM의 NiCl 2, 350 mM의 EDTA, 0.25 % SDS, 및 H 100mm의 염산 :로드 및 제거에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 2 O. 마이크로 원심 분리기 욕조를 사용하는 경우ES하지 지정된 튜브 SPR, 튜브의 캡을 차단하는 것을 잊지 마세요.
5. 프라임 SPR 악기 RB와
6. 새로운 실행을 시작합니다
- 실험 기간 동안 사용되는 유량을 설정한다. 여기에 설명 된 결과를 얻으려면 50 μL / 분에 흐름을 설정합니다.
참고 :이 매개 변수는 실험 기간 동안 수정 될 수 있습니다. - 유로 및 참조 빼기를 정의합니다. 여기에 설명 된 경로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 뺄셈 된 Fc = 2-1 결과 집합을 구하십시오.
참고 :이 프로그램은 실시간으로 측정 된 두 세포의 뺄셈을 표시합니다. 이 매개 변수는 실험 기간 동안 변경 될 수 있음을 유의하십시오. - 적합한 샘플을 선택 랙 (이는 샘플 량 소비에 영향을 미칠 수있다).
- 결과 파일을 저장합니다.
7. 실험 사이클
각 실험 사이클로 구성되어, EA에서 수행 주사의 명확한 기록을 유지CH주기 및 리간드 "로딩 버퍼의 빈 주입하고, 다른 사이클에 주입 분석 물을 분리.
- 사이클 1 : 칩 준비와 니켈로드
- 6.1 및 6.2 단계에있어서의 흐름과 경로가 설정되어 있는지 확인합니다.
- 1 분 먹다 남은 음식을 씻어 350 mM의 EDTA를 주입한다.
- 10 μL / 분으로 설정 흐름.
- 2 분 동안 0.5 mM의 NiCl 2를 주입한다.
주 : 이제 칩 수지 니켈 이온으로 코팅된다.
- 사이클 2 : 고정을 리간드
- 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 2로 설정 흐름.
- 분자량 10 ~ 20 배이다 RU 값에 도달 할 때까지 리간드를 주입한다. 예를 들어, RU는 500 ~ 1,000 50 kDa의의 리간드를로드합니다. 달성 RU 값의 기록을 보관합니다.
- 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1로 설정 흐름.
- A. 리간드의 그 제어에 도움을 줄 감산 sensogram FC (= 2-1) 모니터와 같은 RU 값까지 리간드 B (대조군)을 주입주입 길이.
- 50 μL / 분, 유로 된 Fc 된 Fc = 1 = 2로 설정 유량이, 기준선까지 5-20 분 동안 세척 시스템 (FC = 2-1)를 안정화시킨다.
- 사이클 3 : 빈 주입. 따라서, 주입 분석 물 자체를 제외하고, 피 분석 물 주입되는 모든 컴포넌트들을 포함 빈 빼기 위해 봉사한다.
주 : 사출 길이는 평형 (신호 고원)에 도달하는데 걸리는 시간에 따라 변할 수있다.- 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 된 Fc = 2-1 빼기로 설정 흐름.
- 30 초 동안 ( '대기'로 이하 함) '대기'명령을 삽입 (안정 기준을 가지고).
- 15 초 RB를 주입한다.
참고 분사의 기간들은 미리 평형 반응 속도 상수 (K 대부분의 a)에 따라, 상이한 시스템마다 다를 것이다. - 해리 상을 기록 120-600 초를 기다립니다.
참고 :이 단계의 길이에 따라 달라집니다
- 사이클 4 : 분석 주입
- 복사 / 기준 주입 (사이클 3) 그래서이 두 주사 나중에 뺄 수에 사용되는 정확한 조건을 붙여 넣습니다. 검체 용액을 보유 하나 대조 용액을 잡고 하나의 랙의 슬롯의 위치를 변경. 예상 K의 D보다 약간 농도를 선택합니다. 사전 지식을 사용할 수없는 경우, 좋은 출발점으로 1 μM을 선택한다.
- 사이클 5 : 버퍼 주입
- 반복주기 3.
- 사이클 6 : 분석 주입
- 반복주기 4.
- 사이클 7 : 칩이 벗겨
- 50 μL / 분으로 설정 흐름. </ 리>
- 1 분 동안 350 mM의 EDTA를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오.
- 1 분 동안 0.25 % SDS를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오.
- 기준 레벨에 도달하지 않은 경우, 추가 제거 단계로서 1 분 동안 100 mM의 염산을 주입.
- 대기 모드로 전환 '최종 실행'명령을 삽입합니다.
- 칩 저장
- 센서 칩의 도킹을 해제하고 장비를 꺼내.
- , 칼집에서 센서를 꺼내 표면에 손이 닿지 않도록, DDW 씻어하고, RB를 포함하는 50 ML 튜브에 장소. 4 ℃에서 보관하십시오.
8. 데이터 분석은 평가 소프트웨어 지정 사용
- 동역학 파라미터 유도 전에 SPR에 의해 얻어진 원 데이터를 처리하는 다음 단계를 수행한다.
- 평가 소프트웨어를 사용하여, 오픈결과 파일은 선택주기는 3-6 된 Fc = 2-1 (참조 데이터를 차감).
- 축 이동 :
- 디스플레이 사이클 3-6.
- 제로 네 곡선의 기준선 (각 사이클에서 초기 30 초 대기 시간)의 Y 축값.
- 네 개의 곡선의 X- 축에 맞 춥니 다. 발음 기능을 선택합니다 (예를 들어, 분사 개시 또는 마무리 스파이크) 완벽 X 축을 따라 네 개의 곡선을 정렬합니다. 제로 분석 (또는 제어 버퍼)의 시작 시간을 설정합니다.
- 참조 뺄셈
- 사용 Y 축에서 찾을 수 커브 감산 동작 메뉴를 순환 시프트 (6)의 곡선으로부터 사이클 4 및 5 사이클 곡선의 곡선으로부터 사이클 (3)의 곡선을 뺀 배경 응답을 뺀다.
참고 : 그것은 표면의 굴절률에 영향을했을 수 있습니다 (분석과 관련이없는) 어떤 비특이적 구성 요소를 말살로이 단계를 수행하는 것이 중요합니다.- t의 감산 곡선을 저장그는 다른 이름으로 프로젝트의 시트.
- "이중 감산 곡선"이들 곡선 참조 : 1 감산 모두 주사 수행 2-1 감산하며, 두 번째는 다른 하나의 곡선을 감산한다.
참고 : 이러한 두 참조는 SPR 실험에서 골드 표준입니다. - 앞서 설명한 바와 같이 축 이동을 수행하여 감산 곡선을 오버레이.
- 사용 Y 축에서 찾을 수 커브 감산 동작 메뉴를 순환 시프트 (6)의 곡선으로부터 사이클 4 및 5 사이클 곡선의 곡선으로부터 사이클 (3)의 곡선을 뺀 배경 응답을 뺀다.
- 반응 속도 상수 및 모델 피팅의 결정
- 운동 실험을 실시
- 운동 상수 판정 용 데이터의 신뢰성을 갖도록 6-7 분석 물 농도의 일련의 주입한다. 에서 분석 농도를 선택 2-3 배 희석에, 추정 K D 아래의 10 배에 위의 10 배. 이상 (위 참조)을 두 번 참조 빼기에 사용되는 "제로"의 농도를 포함합니다. 3 회 반복하고 임의의 순서로 주사를 실시한다.
- 맞 춥니 다및 모델 피팅 시도하기 전에 Y 축 및 X 축에 대하여 모든 커브 빼기.
- 모델 피팅
- 적절한 분석 프로그램을 선택합니다.
주 : 대부분의 사용 가능한 피팅 프로그램은 피팅과 운동 상수의 결정에 적용 할 수있는 몇 가지 모델을 제공합니다. - 분석과 피팅에 대한 리간드 사이의 상호 작용 (1) : 가역적 인 1 가정 간단한 모델 (랭 뮤어)를 적용합니다. 데이터를 설득하는 것이 더 복잡한 상호 작용의 존재에 대한 다른 실험 방법에서 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 항상 간단한 랭 뮤어 모델을 사용하고 있습니다.
- 적절한 분석 프로그램을 선택합니다.
- 운동 실험을 실시
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Representative Results
본원에 기재된 시스템에서는, NiNTA 칩 그의 태깅 막 수송 -6,7- 고정화하기 위해 사용된다. 호모 다이머이기 때문에, 각각의 수송은 이중 그것 NiNTA 칩에 결합 개선, 태그됩니다. 니켈로드, 리간드 (관심 수송)을 따라하는 것은 RU 3,500 ~까지 된 Fc = 2에 고정화 (프로토콜주기 2, 그림 2A 블랙 라벨). 다음에, 동일한 흐름 및 분사 기간, 리간드 B (제어 리간드)를 사용하는 것은 초기까지만 ~ 3000 RU에 도달 된 Fc = 1 상으로 분사된다. 유사한 단백질 양의 두 흐름 세포에 고정되어 있는지 확인하십시오; 리간드는 또한 신중 B 3500에 로딩 된 RU를 모니터링하면서, 짧은 주입하여,로드된다. '계단'형태는 각각의 주입 (그림 2A 회색 라벨)에 따라 된 Fc = 1에 대량의 점진적 증가를 나타냅니다. FC를 온라인 모니터링 = 2-1은 동일한 리간드 로딩을 제어하는 데 도움이됩니다. 그림 2B가 된 Fc = 2 보여줍니다감산 한, 즉 된 Fc = 1 RU 값에 단계적으로 증가 된 Fc = 2의 최대 RU 값을 감산. 그것은 조사 및 제어 리간드의 동일한 로딩을 달성하기 위해 리간드 '주사의 지속 시간을 변화시키는 것이 중요하다. 분석 물을 주입하는 경우에 대조적으로, 분사의 기간이 사용 된 모든 농도에 대한 일정하게 유지되어야한다.도 3a 및도 3b는 '빈 분석 물을'주입하여 측정 된 응답을 증명 (즉, RB만을 분석 생략) 사이클 3 및 5, 분석 물 주입 (사이클 4 및 6). 모두 sensograms가 된 Fc = 2-1 빼기를 표현합니다. 사이클 (3-6) (빈 또는 특정 농도)와 동일한 분석 물 분사의 각각에, 두 개의 플로우 셀에인가되는 다른 리간드 고정화. 두 반복은 SPR의 높은 재현성을 보여주는, 아주 잘 중첩. 응답이 두 경우 모두에 기록되고; ~ 3 대 빈에 대한 RU ~ 4분석 0 RU. 이러한 값은 ~ (13)의 노이즈에 대한 신호의 비율을 나타낸다. 에만 특이 적 결합 반응을 나타내는 이중 참조 sensograms을 얻고,이 블랭크 주입 이제 검체 주입 (~ 37 RU,도 3C)로부터 감산된다. 기록 sensogram는 과도 상호 작용의 특성 패턴을 보여준다. 주입시, 연관 상 7 ~ 초 후에 일정한 상태에 도달하는, 리간드 - 결합 분석 물의 양의 급격한 증가에 의해 특징된다. 정상 상태 동안에는 검체가 주입되어있는 동안 유지된다. 주사가 종료되면, RB는 세포 해리 단계를 트리거로 세정한다. 복잡한 빠르게 해리 및 분석 멀리 리간드의 기준에 SPR 신호 수익률을 세척한다.
정량적 데이터 (프리 평형 평형 상수)을 얻으려면, 분석 물 농도 범위는 중복 또는 삼중 (프로토콜 8.3.1 참조)에 주입된다.
니켈 NTA 센서 칩을 사용한 SPR 실험의 단계 중도 1 그림. (A (B - D) SPR 실험 기간 동안 기록 된 Fc = 2-1 sensogram의 그림입니다. 자신의 태그가 리간드와 같은주기 2에서 NI-충전 표면에 주입, 질량은 점차 저장. (리간드의 MW)에 따라 1000 ~ 5000 사이의 범위 RU RU 최종 값에 도달 할 때 주입이 종료된다. 기준선은 칩 리간드의 안정한 결합을 반영하여 형성된다. 사이클 3에서, 블랭크 주입 분석 물은 분석 물을 제외한 시료의 성분을 주입, 예비 성형된다. 주입이 종종 낮은 응답 (1-5 개의 RU)에 기록된다. 사이클 4에서, 분석 물은 빈 주입 동일한 체제를 사용하여 주입된다. 증가 된 RU는 표면, 즉, 리간드 결합 분석 물의 질량에 변화를 반영한다. 신호는 다음과 같이 신속하게 번째 고원 높이고전자 시스템은 평형 상태에 도달한다. 주사가 종료되면, 피 분석 물은 신호의 저하를 초래 리간드로부터 해리 기준선 수준으로 복귀.
리간드 부하의 라인 모니터링에 그림 2. (A) 리간드로드의 Unsubtracted 곡선. 관심 (리간드 "A")의 리간드가 원하는 RU 레벨 (~이 예에서는 3,500 RU)에 도달 할 때까지 셀 (2) (FC = 2, 검은 색)을 흐름로드됩니다. 그 다음, 음성 대조군 리간드 (배위자 "B")는 단계적로드 동일한 RU 수준까지 플로우 셀 1 (FC = 1, 회색) 상에 도달한다. 감산 된 Fc = 2-1 실시간으로 모니터링 (B) (A)에서 수행되는 두 개의 주사. 관심이 모니터링 및 제어 리간드의 동일한 로딩을 용이하게한다.
2-1 뺄셈의 그림 3. 두 번 참조. (A) 중복 (즉, 된 Fc = 2-1) 빈 주입. (A)에서와 같이, (B)는, 피 분석 물 만이 주입된다. (C) (B)에서 측정 된 응답에서 (A)에 나타내는 배경 응답의 감산 후 최종 sensograms. 이 곡선은 '더블 블랭킹'또는 '더블 참조 "라고합니다. 중복 순차적 사이클의이다.
. 1 랭 뮤어 상호 작용 모델 그림 (중복의) 여러 분석 농도의 주사에 의한 운동 속도 상수 4. 결정 검은 선은 단순한 1을 사용하여 계산 된 맞는이다.
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Discussion
SPR은 분자 상호 작용을 연구하는 고감도 방법이며, 과도 (아직 중요) 상호 작용의 실시간 모니터링을 제공하는 유일한 방법은 많다. 예는 다른 방법 (풀 - 다운 분석법 리포좀 침강 분석법 6)에 의해 검출 될 수없는 본 명세서 과도 상호 작용한다. 다른 방법 (정량적 또는 정 성적 관계없이) 측정을 평형 제한되어 있지만 또한, SPR은 미리 평형 동역학을 측정 만 기술 중 하나이다.
그 고조 감도는 또한주의해야 할 점이다. 거짓 양성 sensograms 용이하게 기록되어있다. 이 때문에 SPR 측정을 시도하기 전에 다른 방법을 사용하여 상호 작용의 존재를 설정하는 것을 권장한다. (과도 상호 작용에 대 안정 K D의 거친 평가) 시스템의 특성에 대한 사전 지식은 SPR의 experime을 설정에 많은 도움이 될 것입니다NTS 얻어진 측정의 기능적 적합성을 평가. SPR 측정을 시작하면 단백질 시료의 품질이되기 전에 중요한 문제는 염두에 두어야합니다. SPR은 응집체에 매우 민감하며 이들은 리간드 (겔 여과 크로마토 그래피에 의해 초 원심 분리 가능한) 피 분석 제제 모두에서 제거되어야한다. 소음과 잘못된 신호의 또 다른 소스는 RB 및 분석의 버퍼 사이의 버퍼 불일치에서 기인 할 수있다. 따라서, RB에 대해 분석 물질을 투석에 의해 또는 RB에 많은 주름을 희석 검체 (~ 100 ~ 1000 배)의 고도로 농축 된 제제를 사용함으로써 해결 될 수있다. 가양 데이터는 칩의 매트릭스 또는 음성 대조군으로 분석 종의 비특이적 상호 작용이 발생할 수있다. 이러한 상호 작용은 때로 매우 낮은 피 분석 물 농도를 사용함으로써 회피 될 수 있고, 낮은 친 화성이다. 또한, 낮은 BSA 및 / 또는 세제 농도 (0.1 ㎎ / ㎖ 및 / 또는 0.05의 포함)는 각각 (/ V w) RB 및 검체 시료 주입 -0.1 %의 비특이적 상호 작용을 감소시킬 수있다. 음성 대조군 세포 (다른 음성 대조군)의 내용을 변경하는 것은 비특이적 결합을 다루는 문제점에 대한 또 다른 접근법이다. 대안 적으로, 다른 유형의 칩을 사용하여도 데이터의 품질에 영향을 줄 수있다. 센서 칩은 다양한 종류의 상이한 화학에 기초하여, 시판되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 센서 칩 (CM-5 칩) 카르복시 메틸화 된 덱스 트란에서 공유 금 표면에 부착된다. 단백질은 매우 간단한 공유 표면 다양한 화학을 (가장 일반적으로 아민 또는 티올 결합)를 사용하여 센서 표면에 결합 될 수있다. 막 단백질 공유 고정 작업을 할 때 그러나, 우리의 손에, 자주 아티팩트를 얻을 수있어 선택의 방법이 아닙니다. 세포막 단백질을 연구의 맥락에서, 친 유성 분자로 코팅 상업적인 칩이 있음을 주목할 만하다. 이들은 immob 수 있도록네이티브 같은 환경 상에 막 단백질의 ilization. 유사 이미지 센서 칩은 '집'을 제조 할 수있다. 다른 커플 링 방법에 대한 설명은 10, 11을 참조하십시오. 본원에 기재된 프로토콜은 그의 태그, 세제 용해 전달체 고정화 용 NI-NTA 칩의 사용에 기초한다 (분석 물은 칩 표면에 결합하는 피 분석 물을 피하기 위해 자신이 태깅 아니다). 우리의 경험 6,12 년, 니켈 NTA 칩 실시한 실험에서 파생 된 운동 상수는 네이티브와 같은 환경에서 결정된와 잘 일치하는 것을 알 수 있었다. 니켈 NTA 칩은 상대적으로 고가이지만, 그 주 이점은 리간드 스트리핑 및 재사용 될 수 있다는 것이다. 측정 수백명의 칩 당 할 수 있습니다. 또한, 칩상의 리간드의 배향은 그 태그의 위치에 의해 결정되며, 따라서 매우 균일하다.
상호 작용을 성공적으로 SPR, 제어 및 REPE 일련으로 기록되면ATS는 SPR 신호의 유효성을 확인하기 위해 필요하다. 다음 매개 변수의 검증은 SRP 데이터의 유효성을 검사하는 데에 도움을 줄 수있다 :
1. SPR 신호의 특이성 : SPR의 높은 민감도 때문에, 적절한 음성 대조군의 사용은 특히 중요하다. SRP에 의해 기록 된 비 - 특이 적 상호 작용은 매트릭스 분석 물의 흡착에 기인 할 수있다. 단백질 (리간드)로드 흐름 세포 화학적 빈 흐름 세포에 해당하지 않기 때문에 따라서, 빈 흐름 세포는 종종 가장 좋은 방법이 아닙니다. 더 옵션 리간드 비활성 돌연변이 변이체 분석 물에 결합하지 않는 알려진 하나를 사용하는 것이다. 대안 적으로, 하나의 돌연변이 분석 물을 유사하게 사용할 수있다. 이러한 돌연변이 체를 사용할 수없는 경우 동종 단백질 (하지만 서로 다른 결합 특이성) (12)를 사용할 수 있습니다. 음성 대조군의 좋은 예로는 (여기에 기술 된 바와 같이) 상동 리간드, 또는 공지되어 상호 작용하는 파트너들 중 하나에 점 돌연변이협회를 폐지. 또 다른 음성 대조군은 상호 작용에 필수적인 번역 후 변형 (예를 들면, 인산화, 메틸화, 티올 유도)의 변형이다 권장. 예를 들어, SH2 도메인의 상호 작용에 필수적인 티로신 탈 인산화. 다른 부정적인 제어 시스템에 한정 될 수 있습니다. SPR을 사용하는 경우, 엄격한 음성 대조군을 사용하는 중요성은 과장 될 수 없다.
SPR 신호의 2. 재현성 : SPR은 매우 재현 방법이다. 리간드 동일한 양의 바이오 센서 칩에 탑재되고, 피 분석 물 농도의 동일한 반복을 완벽하게 정렬되어야 주입되면 (도 3 참조).
3. 재생 시스템은 : 라의 기능적 및 구조적 무결성을 유지하면서 느린 해리 속도 (k 값 d)과의 상호 작용으로, 피 분석 물은 리간드로부터 제거되어야라 자세 히. 분리 및 / 또는 재생이 완료되지 않은 경우, SPR 신호 서서히 피검 물의 후속 주사시에 소멸된다. 테스트 할 수있는 일반적인 재생 조건은 마그네슘의 높은 농도 2+ (2 M까지), 산성 또는 염기성 조건 (예를 들어, 10 mM의 글리신의 pH 2.5, 10 mM의 NaOH를), 높은 소금 (최대 4 M의 NaCl에), 또는이다 세제 높은 농도 (예를 들어, 1 % DDM). 그러나 이러한 시약 (및 기타)의 재생 효과가 높은 시스템 별 따라서 재생성 조건을 테스트해야합니다. 어떤 경우에는, 상호 작용 재생이 E.의 경우와 같이, 결코 완료 정도로 안정되고 강한 대장균 비타민 B (12) 교통 시스템 (BtuCD-F) 7. 이러한 조건에서, 유일한 옵션은 바이오 센서 칩에서 리간드를 제거하고 각 주입을위한 신선한 배치를 다시하는 것입니다. 리간드 분석 물의 해리 인 경우 신속하고 완전한 표면 재생은 불필요(프로토콜을보고 2 ~ 3도).
4. 막 단백질은 항상 SPR 감도 및 반응 속도에 영향을 미칠 수있는 세제의 존재하에 정제. 그러나 BtuCD의 경험에서, 측정 된 속도는 매우 유사하다. 하나는 항상 같은 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 무료 접근법 (SEC)를 이용하여지지하는 증거를 얻기 위해 필요 SPR 및 다른 기술 간의 상관이 메티오닌에 대해 도시 한 예를 들면 풀다운 분석 리포좀 침전 분석법 등의 비타민 B 12 두 몰리브덴 시스템 6,12.
운동 속도 상수의 잘못된 결정은 종종 피팅 과정에서 발생한다. 분석 운동 실험 한 상호 작용 모델 : 엄지 손가락의 규칙으로, 항상 간단한 랭 뮤어 (1)을 적용합니다. 더 복잡한 모델은 구조 변화, 가의 분석, 또는 샘플 이질성의 추가 가정을. 이러한 가정해야한다다른 실험 방법에서 증거에 의해 지원되는 경우 만했다. 이 모델을 적용하는 것은 더 나은 피팅 및 낮은 치 2 값의 가능성이 가장 높은 결과 만이 자신의 신뢰성에 대한 증거로 간주되어서는 안됩니다합니다. 더 복잡한 모델에 의해 제공되는 자유의 이상도 오히려 자신의 기계론의 관련성보다 일반적으로 더 나은 피팅에 대한 책임이 있습니다.
SPR의 장점 중 하나는, 특히 용해 및 멤브레인 단백질을 정제하기 위해 사용되는 계면 활성제에 대하여, 광범위한 화학적 호환성이다. 그러나, 종종 막 단백질의 정제 과정에서 첨가 크로스 및 글리세롤 (및 기타 점성 용액) RU에 극적인 영향을 미친다. 그것은 따라서 가능하면이를 방지하거나 적어도 자신의 농도를 감소하는 것이 좋습니다. 점성 용액을 사용하는 경우, 완충액의 불일치를 피하는 것이 필수적이된다. RB를 포함하는 세제에 지질를 추가하면 결합 기호를 증폭 할 수 있습니다만큼 10 배에 의해 알. 그러나, 이러한 노력은 (대부분의 지질 대) 고가이고 바이오 센서 칩의 수명을 단축시키는 경향이있다.
새로운 시스템을 보정하면서 위에 나열된 팁과 문제 해결 도움이 될 수 있습니다. 그러나 소정의 시스템은 종종 최적의 결과를 달성하기 위해 (예를 들어, 세제, 염, pH를 선택) 특별한 조정이 필요하다.
SPR은 긴 분자 상호 작용을 측정 할 수있는 강력하고 독특한 접근 방식으로 인식되고있다. 최근 몇 년 동안 다양한 SPR 플랫폼과 가격 하락의 가능성은 SPR 더 가까이했다. 그것은 빠르게, 납 작은 분자 억제제를 발견 단백질 - 단백질 상호 작용, 목표 단백질 약물 상호 작용을 연구하는 황금 표준 접근되고있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
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- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
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