Summary
Overflate-plasmonresonans (SPR) er en etikett-fri fremgangsmåte for detektering av bio-molekylære vekselvirkninger i sanntid. Heri, en protokoll for en membran protein: er reseptorinteraksjon eksperiment beskrevet, mens de diskuterer fordeler og ulemper med teknikken.
Introduction
Protein-protein interaksjoner (PPI); dannelse og dissosiasjon av proteinkomplekser, er sentrale hendelser i mange biologiske prosesser (f.eks, replikering, transkripsjon, oversettelse, signalisering, celle-celle kommunikasjon). Semi-kvantitative studier av PPI blir ofte utført ved hjelp av rullegardin eller immunutfellingen eksperimenter. Imidlertid er disse (og liknende) teknikker er begrenset i området fra affiniteter som kan måles (lavt mikromolområde og høyere affinitet) på grunn av vasketrinnene som er iboende i slike teknikker. Slike "end-point" teknikker kan ikke identifisere forbigående eller lav affinitet interaksjoner som ofte er av stor biologiske konsekvenser. I tillegg er den tidsmessige oppløsningen av slike metoder ytterst begrenset, vanligvis flere størrelsesordener langsommere enn utbredelsen av reaksjonen. SPR overvinner disse mangler på grunn av sin økt følsomhet og overlegen tidsmessig oppløsning 1,2. SPR er en etikett-fri metode, og som sådanmolekylær interaksjon kan måles (så lenge masse endringene kan bli detektert). I tillegg til PPI, har det vært mye brukt for å karakterisere protein-ligand, protein-medikament (eller lite molekyl), protein-DNA og protein-RNA interaksjoner 3-5. Resultatene er registrert og plottet i sann tid, noe som muliggjør hurtig endring av eksperimentelle betingelser og eksperimentelle fleksibel utforming.
Den fysiske prinsippet bak SPR baserte instrumenter er utnyttelsen av et optisk system som måler en endring av brytningsindeksen på sensoroverflaten når massen endres 2. En av de samvirkende partnere (heretter ligand) immobilisert på en polymer matrise chip og andre molekyl (heretter analytt) føres over overflaten. Analytt å bindes til liganden forandrer massen på chip overflaten. Denne masseendring er direkte og proporsjonalt relatert til endringer i brytningsindeksen til overflaten. Resultatene er plottet i sanntid ogpresenteres som respons heter (RU), som en funksjon av tid. Et slikt plott er betegnet en sensogram (f.eks, figur 1). Siden SPR følger hele tidsforløpet av interaksjonen, blir pre-likevektskinetiske hastighetskonstanter avledet, i tillegg til likevekt affiniteter. Som beskrevet nedenfor, har den pre-likevekt oppførselen til et gitt system mye informasjon, og gir et helt annet perspektiv enn likevekt alene. Når systemet er kalibrert forsøk er meget rask og krever bare små mengder av proteinmaterialet (mikrogram til nanogram mengder). Oppsamling av det komplette bevegelsesinformasjon for et gitt system kan oppnås i løpet av dager. Den høye følsomheten SPR gir målinger som ikke er mulig å bruke noen annen teknikk 6. Dette er imidlertid høy følsomhet en "tveegget sverd" siden det kan være en viktig kilde for falske positive data. Annen faktor som påvirker reflekterende indeksen er registrert og plottet på sensogram. Som sådan, apsikts kontroller må brukes til å eliminere falske positiver, og støtte fra komplementære tilnærminger er svært oppmerksom.
Figur 1 illustrerer utviklingen av en SPR eksperiment ved bruk av en NTA-belagt sensor chip. Den sensogram i panel A viser injeksjon av nikkelioner over NTA matrisen (unsubtracted data), og paneler BD vise dataene etter å subtrahere det signal som utledes fra den negative kontrollcellen. Rød og blå pilene viser injeksjon start og slutt, henholdsvis. Immobilisering av liganden på brikken gradvis forandrer massen før injeksjonen er avsluttet. Den stabile platå observert etter avslutning av ligand s injeksjon reflekterer stabil assosiasjon av liganden til overflaten (figur 1B, syklus 2). Når en stabil grunnlinje er oppnådd en buffer blir injisert i løpet av liganden og referansecellen (figur 1B, syklus 3) .Dette injeksjon tjener som en "blindprøve" og vil blitrekkes under analysen. Ved injeksjon, er mindre endringer registreres, noe som reflekterer en strømning av massen gjennom brikken. Så i en egen syklus (figur 1B, syklus 4), blir analytten injisert; den gradvise økning i RU representerer analytten tilknytning til liganden. Bindingssetene blir gradvis opptatt inntil likevekt er nådd. Så snart injeksjonen ender, en nedgang i jernbaneforetak reflekterer kompleksets dissosiasjon. Fra slike sensograms pre-likevekt og likevekts hastighetskonstanter kan avledes (se senere). Figur 1 viser en transient interaksjon mellom liganden og analytten. Når samspillet er mer stabil, er nedgangen i RU nivå tregere, noe som reflekterer en lavere k d.
Heri, beskriver vi en SPR eksperiment som tar sikte på å karakterisere interaksjonen mellom en membran transportør (vaskemiddel oppløst) og dens funksjonelle partner, dens beslektede substrat bindende protein 6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassett (ABC) transporter, ModBC-A av Archeaglobus fulgidus. Dette systemet ble valgt for sin svært reproduserbare resultater, høy signal til støyforhold, og klassisk 'on / off "priser. I tillegg homologer ABC transportører er tilgjengelige for å tjene som viktige negative kontroller. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved hjelp av vaskemiddel, renset og immobilisert på chipen. Sin løselig samspill partner, Moda, er analytten. Som en negativ kontroll-ligand, er en annen ABC-transportør RbsBC brukt ("ligand B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein Utvalg og Buffer Forberedelse
- Prøvepreparering: rense proteinene av interesse, og sørge for at alle aggregater er fjernet, ved injisering av proteinet før forsøket på en gel-filtreringskolonne eller ved ultrasentrifugering (vanligvis 10 minutter ved 100 000 xg er tilstrekkelig).
MERK: Selv om ønskelig, svært rene proteinpreparater er ikke et must. SPR har blitt brukt med mindre enn perfekt renselser og selv med total ekstrakt 8,9. - Buffer forberedelse:
- Forbered buffer av forsøket (kalt "buffer", eller RB). For protokollen beskrevet her, bruk 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,05% (w / v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltosid). Husk at valget av buffersammensetningen kan lett modifiseres i henhold til den studerte system.
- Filtrere alle buffere og proteinprøver bruker 0,22 mikrometer filtre. Forsikre deg om på forhånd at filtrene er protein-kompatible. Generelt er nylig markedsført SPR plattformer inneholder en in-line de-Gasser; Hvis dette ikke er tilfelle, de-gass bufferne før bruk.
- Dialyser over natten eller fortynne prøvene mot RB å unngå buffer uoverensstemmelser. Dialyse (eller noen annen metode for buffer utveksling) anbefales spesielt ved bruk av kjemikalier av høy viskositet (f.eks sukrose, glyserol, DMSO). Før tilkobling av RB-flaske til pumpeinnløpet holde til side for 10 ml av RB i et separat rør.
- Fortynne den konsentrerte ligand lager i RB til en endelig konsentrasjon på ~ 20 pg / ml. Som en tommelfingerregel for stabil ligand immobilisering, bruke lave konsentrasjoner ligand med lengre injeksjoner ved lav strømning, i motsetning til høye konsentrasjoner, høy flyt og kortere injeksjoner.
- Fortynn analytt inn i RB til den ønskede konsentrasjon. Vanligvis teste område av konsentrasjoner for et system av ukjent affinitet fra 10 uM til 10 nM i ti gangers fortynninger. Starter alltidmed lavere konsentrasjoner første.
2. Sensor Chip
- Chip valg: Bruk en nitriltrieddiksyre (NTA) kombinert chip egnet for å fange proteiner med en oligo-histidin tag.
- Chip-bruk:
- Ved bruk av en ny chip, ta brikken ut fra skjeden, skyll forsiktig med dobbelt destillert vann (DDW), tørk av forsiktig resten av væsken ved hjelp av delikate vindusviskere, og sørg for ikke berører gull lag overflaten. Plassere chip tilbake i sliren i riktig retning (innsetting er glatt når brikken er riktig plassert).
- Når gjenbruk en chip, ta ut den lagrede chip fra bufferen, skyll grundig med DDW og tørr forsiktig som nevnt ovenfor, og fyll i sin opprinnelige slire.
MERK: akkumulering av ikke-spesifikk uønsket materiale på brikken kan påvirke dens 'levedyktighet'. Dette kan overvåkes ved å sammenligne jernbaneforetak før ligand immobilisering og etter stripping. Selv om mange målinger kan væregjøres ved hjelp av samme NiNTA chip, er spørsmålet om sin levetid ikke en "entydige" og varierer sterkt mellom ulike chips.
- Chip docking: Åpne sensorbrikken døren og plassere chip i sliren. Ved bruk av en ny chip, for å legge inn chip serienummer holde bruken posten. Lukk døren og trykk 'dock chip'.
3. temperaturinnstillinger
- Still chip celletemperatur til 25 ° C (eller den foretrukne eksperimenttemperaturen).
- Valgfritt: stiller prøvene rommet til 7 ° C for å holde proteinene stabil gjennom hele forsøket.
4. Løsninger for Lasting og Stripping
Fremstille de følgende løsninger for lasting og stripping: 0,5 mM NiCl2 i RB, 350 mM EDTA i RB (i vaskemiddel til EDTA-løsning til en sluttkonsentrasjon som i RB), 0,25% SDS i H2O, og 100 mM HCI i H 2 O. Når du bruker mikro-sentrifuge badekares og ikke SPR utpekt rør, ikke glem å avskjære caps av rørene.
5. Prime SPR Instrument med RB
6. Start en ny Run
- Angi strømningshastigheten som skal brukes i løpet av eksperimentet. For å oppnå de resultater som er beskrevet her angir strømmen til 50 mL / min.
MERK: Denne parameteren kan varieres under forsøket. - Definere strømningsbaner og referanse subtraksjon. For å oppnå de resultatene som er beskrevet her satt stiene Fc = 1 og Fc = 2, subtraksjon Fc = 2-1.
MERK: Programmet vil vise i sanntid subtraksjon av to målte celler. Husk at denne parameteren ikke kan endres i løpet av eksperimentet. - Velg passende prøvestativ (det kan påvirke prøvevolum forbruk).
- Lagre resultatene fil.
7. Forsøk Cycles
Hvert eksperiment består av sykluser, holde en klar rekord av injeksjonene gjøres i ealm syklus, og skille de ligander 'lasting, bufferen er tom injeksjon, og analytten injeksjon i forskjellige sykluser.
- Syklus 1: Chip forberedelse og nikkel lasting
- Sørge for flyt og banene er satt i henhold til punkt 6.1 og 6.2.
- Injisere 350 mM EDTA for en min å vaske bort rester.
- Satt strømmen til 10 pl / min.
- Injisere 0,5 mM NiCl2 i 2 min.
MERK: Nå chip harpiks er belagt med nikkel-ioner.
- Syklus 2: Ligander immobilisering
- Set strømning til 15 pl / min, strømningsbanen Fc = 2.
- Injisere ligand A inntil nå RU verdier som er 10-20 ganger av sin molekylvekt. For eksempel legge en ligand av 50 kDa til 500-1000 jernbaneforetakene. Hold oversikt over den RU verdi oppnådd.
- Set strømning til 15 pl / min, strømningsbanen Fc = 1.
- Injisere ligand B (kontroll) opp til den samme RU verdi som for ligand A. Overvåk subtraksjon sensogram (Fc = 2-1) på nettet for å bidra til å kontrollereinjeksjon lengde.
- Sett strømmen til 50 pl / min, strømningsbanen Fc = 1 og Fc = 2, vask systemet for 5-20 min inntil basislinjen (Fc = 2-1) stabiliseres.
- Syklus 3: Blank injeksjon. Dette injeksjon vil tjene for blank subtraksjon, derfor omfatte alle komponenter som vil bli injisert med analytten, bortsett analytten selv.
MERK: Injeksjon lengde kan variere avhengig av tiden det tar å nå likevekt (signal platåer).- Set strømning til 15 pl / min, strømningsbanen Fc = 1 og Fc = 2, Fc = 2-1 subtraksjon.
- Sett 'vente' kommando (referert heretter som 'vente') i 30 sek (for å ha en stabil baseline).
- Injisere 15 sek RB.
MERK: Varigheten av injeksjon vil variere mellom ulike systemer, avhengig av deres pre-likevektskinetiske konstanter (for det meste på k-a). - Vent 120-600 sek å registrere dissosiasjon fasen.
MERK: Lengden av dette trinnet varierer avhengig av
- Syklus 4: Analytt injeksjon
- Kopier / lim inn de nøyaktige betingelser som anvendes i referanse injeksjon (syklus 3) slik at disse to injeksjoner kan senere trekkes fra. Endre plasseringen av sporet i stativet fra en som har kontroll løsning til en som holder analytten løsning. Velg en konsentrasjon som er litt over forventet K D. Hvis ingen forkunnskaper er tilgjengelig, velger du en mikrometer som et godt utgangspunkt.
- Sykle 5: Buffer injeksjon
- Gjenta syklusen tre.
- Syklus 6: Analytt injeksjon
- Gjenta syklusen fire.
- Syklus 7: Chip kle av
- Satt strømmen til 50 mL / min. </ Li>
- Injisere 350 mM EDTA i 1 min. Gjenta dette trinnet to ganger til. Ikke bruk en enkelt injeksjon av 3 min, da dette kan skade chip.
- Injisere 0,25% SDS i 1 min. Gjenta dette trinnet to ganger til. Ikke bruk en enkelt injeksjon av 3 min, da dette kan skade chip.
- Hvis baseline nivå ikke er nådd, injisere 100 mM HCl for 1 min som ekstra stripping trinn.
- Sett 'end run' kommando som bytter til standby-modus.
- Chip lagring
- Fradokke sensorbrikken og ta den ut av instrumentet.
- Ta sensoren ut fra skjeden, unngå å berøre overflaten, skyll med DDW, og plasser i en 50 ml tube inneholder RB. Oppbevares ved 4 ° C.
8. dataanalyse ved hjelp Dedikert Evaluering Programvare
- Utfør følgende trinn for å behandle rådata innhentet av SPR før avledning av de kinetiske parametre.
- Ved hjelp av evalueringsprogramvaren, åpenresultatfilen, velger sykluser 3-6 Fc = 2-1 (referanse trekkes data).
- Axis skift:
- Skjerm sykluser 3-6.
- Null Y-aksen verdi av referanse (den første 30 sek ventetid i hver syklus) til alle fire kurver.
- Justere X- aksen av de fire kurvene. Velg uttalt funksjoner (f.eks pigger av injeksjon start eller slutt) for perfekt justere de fire kurvene langs X-aksen. Angi tidspunktet for start av analytt (eller kontrollbuffer) til null.
- Referanse subtraksjon
- Subtrahere bakgrunnsresponsen ved å subtrahere kurven av syklus 3 fra kurven av syklus 4 og kurve av syklus 5 fra kurven av syklus 6. Bruk kurve subtraksjon operasjon som kan finnes i Y-aksen forskyves menyen.
MERK: Det er viktig å utføre dette trinnet som det opphever noen uspesifikke komponenter (relatert til analytten) som kan ha påvirket overflaten brytningsindeks.- Redd trekkes kurver i than prosjektets ark under et annet navn.
- Referere til disse kurver som "dobbelt trekkes kurver": den første subtraksjon er 2-1 subtraksjon utføres på begge injeksjoner, og den andre er subtraksjon av en kurve fra en annen.
MERK: En slik dobbel referering er gullstandarden i SPR eksperimenter. - Lapper trekkes kurver ved å utføre akse skift som forklart tidligere.
- Subtrahere bakgrunnsresponsen ved å subtrahere kurven av syklus 3 fra kurven av syklus 4 og kurve av syklus 5 fra kurven av syklus 6. Bruk kurve subtraksjon operasjon som kan finnes i Y-aksen forskyves menyen.
- Bestemmelse av kinetikk konstanter og modell montering
- Gjennomføre en kinetisk eksperiment
- Injisere en serie på 6-7 analyttkonsentrasjoner å ha en pålitelig av data for bestemmelse av kinetiske konstanter. Velg analyttkonsentrasjoner fra 10-ganger over til 10 ganger under det beregnede K D, i 2-3 gangers fortynninger. Inkludere "null" konsentrasjon, senere brukt for dobbel referanse subtraksjon (se ovenfor). Gjennomføre injeksjoner i tre paralleller og i tilfeldig rekkefølge.
- Justerog trekke fra alle kurver med hensyn til Y-aksen og X-aksen før du prøver modell montering.
- Modell montering
- Velg en egnet analyseprogram.
MERK: De fleste tilgjengelige passer programmer tilbyr flere modeller som kan brukes for montering og bestemmelse av kinetiske konstanter. - Anvende den enkleste modellen (Langmuir) forutsatt at en reversibel 1: 1 interaksjonen mellom analytten og ligand for montering. Med mindre overbevisende data er tilgjengelig fra andre eksperimentelle metoder for eksistensen av et mer komplekst samspill, bruk alltid enkel Langmuir modell.
- Velg en egnet analyseprogram.
- Gjennomføre en kinetisk eksperiment
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det system som her er beskrevet, er en NiNTA brikke brukes for å immobilisere His-tagget membran transportør 6,7. Å være en homo-dimer er hver transporter dobbelt merket, forbedre sin binding til NiNTA chip. Etter nikkel lasting, ligand A (den transportør av interesse) er immobilisert på Fc = 2, opp til ~ 3500 RU (protokoll syklus 2, Figur 2A black label). Deretter, ved bruk av samme injeksjonsstrøm og varighet, ligand B (kontroll-ligand) blir injisert på Fc = 1, først nådde bare opp til et ~ 3000 RU. Å sørge for at lignende protein beløpene er immobilisert på begge strømnings celler; ligand B er videre lastet, bruker kortere injeksjon, mens nøye overvåke lasting opp til 3.500 jernbaneforetakene. The 'trappene' form representerer en gradvis økning i massen på Fc = 1 på hver injeksjon (Figur 2A grå etikett). Et on-line overvåking av Fc = 2-1 hjelper kontrollere lik ligand lasting. Figur 2B demonstrerer Fc = 2-En subtraksjon, dvs. trekke den maksimale RU verdi i Fc = 2, fra trinnvise økninger i RU verdi i Fc = 1. Det er viktig å variere varigheten av de ligander 'injeksjoner for å oppnå lik belastning av de undersøkte og kontroll ligander. I motsetning til dette, ved injisering analytten, varigheten av injeksjonen må holdes konstant for alle konsentrasjoner benyttes. Figur 3A og 3B viser responsene målt ved å injisere en "blank analytt '(dvs. RB utelater bare analytten) i 3 sykluser og 5, og analytten injeksjoner (i sykluser 4 og 6). Legg merke til at begge sensograms representerer Fc = 2-1 subtraksjon. I hver av de sykluser (3-6) en identisk analytt injeksjon (blank eller en gitt konsentrasjon) blir påført de to strømningsceller, immobilisert med forskjellige ligander. De to gjentar innkopierer svært godt, demonstrere høy reproduserbarhet av SPR. Et svar er registrert i begge tilfeller; ~ 3 RU for blind versus ~ 40 RU for analytten. Disse verdiene representerer et signal-til-støy-forhold på ~ 13. For å oppnå de doble refererte sensograms, som bare representerer den spesifikke binding respons, blir den tomme injeksjon nå subtraheres fra analytten injeksjon (~ 37 RU, figur 3C). Den sensogram registreres viser det karakteristiske mønster av en transient interaksjon. Ved injeksjon blir krets fase kjennetegnet ved en hurtig økning i mengden av ligand-bundet analytt, nå stabil tilstand etter at ~ 7 sekunder. Den stabil tilstand opprettholdes så lenge som analytten er injisert. Når injeksjons opphører, blir cellene vasket med RB utløser dissosiasjon fase. Komplekset spaltes hurtig, og som analytten vaskes vekk fra liganden SPR-signalet går tilbake til grunnlinjen.
For å få kvantitative data (pre-likevekt og likevekts konstanter), er en rekke analyttkonsentrasjoner injisert i duplikater eller triplicates (se 8.3.1 i protokollen).
Figur 1. Illustrasjon av trinnene i en SPR eksperiment ved bruk av en Ni-NTA-sensorbrikke. (A (B - D) Illustrasjon av Fc = 2-1 sensogram registrert i en SPR eksperiment. I syklus 2 som hans-merket ligand injiseres over Ni-ladet overflate, gradvis akkumulerer masse. Injeksjon avsluttes når nå en endelig RU verdi i området mellom 1000-5000 RU (avhengig av ligand s MW). En grunnlinje er dannet, noe som reflekterer den stabile binding av liganden til brikken. I syklus 3, er en blank injeksjon på forhånd dannet, injisering av komponentene av analytt prøven med unntak av bare analytten. I denne injeksjon ofte en lav svar registreres (1-5 jernbaneforetak). I syklus 4 analytten injiseres ved hjelp av det samme regime som blind injeksjon. Den økende jernbaneforetak reflektere masseendring på overflaten, dvs. binding av analytten til liganden. Signalet øker raskt og deretter platåer som the systemet når likevekt. Når injeksjonen er avsluttet, spaltes analytten fra liganden, noe som resulterer i en reduksjon i signalet, og komme tilbake til grunnivåer.
Figur 2. På line overvåking av ligand belastninger. (A) Unsubtracted kurver av ligand lasting. Liganden av interesse (ligand "A") er lagt til å flyte cellen 2 (Fc = 2, sort) til å nå det ønskede nivå RU (~ 3500 RU i dette eksempelet). Deretter er den negative kontroll-ligand (ligand "B") trinnvis lastet på en strømningscelle (Fc = 1, grå) til en identisk RU nivå er nådd. (B) De to injeksjoner som utføres i (A) overvåkes i sanntid som en Fc = 2-1 subtraksjon. Denne overvåkingen letter identisk lasting av ligander av interesse og kontroll.
Figur 3. Dobbelt henvisning. (A) Duplikater av en 2-1 subtraksjon (dvs. Fc = 2-1) av emnet injeksjon. (B) Som i (A), er det kun analytt injisert. (C) Slutt sensograms etter subtraksjon av bakgrunnsresponsen vist i (A) fra den målte responsen i (B). Disse kurvene er referert til som "double slukket" eller "dobbel referert". Duplikater er sekvensielle sykluser.
. Figur 4. Fastsettelse av kinetiske hastighetskonstanter ved injeksjoner av flere analyttkonsentrasjoner (i duplikater) De svarte strekene er de passer som ble beregnet ved hjelp av en enkel 1: 1 Langmuir samhandlingsmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR er en svært følsom metode for å studere molekylære interaksjoner, og er ofte den eneste tilnærming som gir sanntids overvåking av forbigående (men viktige) interaksjoner. Et eksempel er transient interaksjon presentert heri, som ikke kunne påvises ved hvilken som helst annen metode (pull-down-analyser, liposomer sedimente assays 6). Videre, mens andre fremgangsmåter er begrenset til likevekt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), er SPR et av de få teknikker som måler også pre-likevektskinetikk.
Dens økt følsomhet er også dens påminnelse. Falske positive sensograms er lett registreres. Det anbefales derfor å etablere eksistensen av samspillet med andre metoder før du prøver SPR målinger. Forkunnskaper i systemets egenskaper (grov vurdering av K D, stabil vs. forbigående samhandling) er svært nyttig i å sette opp SPR experiments og evaluere den funksjonelle relevansen av de oppnådde målinger. En viktig sak å huske på før du starter SPR målinger er kvaliteten på proteinprøver. SPR er meget følsomme for aggregater og disse må fjernes fra både liganden og analytten preparater (ved gelfiltreringskromatografi eller ultrasentrifugering når det er mulig). En annen kilde til støy og falske signaler kan stamme fra buffer mismatch mellom RB og bufferen av analytten. Dette kan løses ved dialysering av analytten mot RB, eller ved hjelp av en svært konsentrert preparat av analytten som er fortynnet mange folder (~ 100-1.000-ganger) i RB. Falske positive data kan også være et resultat av ikke-spesifikke interaksjoner med analytten med brikkens matrise eller med den negative kontroll. Disse interaksjonene er av lav affinitet, så noen ganger kan unngås ved å bruke lave analyttkonsentrasjoner. I tillegg inkludere lav BSA og / eller detergentkonsentrasjoner (0,1 mg / ml og / eller 0.05-0,1% (W v /), respektivt) til RB og til den injiserte analyttprøve kan redusere uspesifikke interaksjoner. Å endre innholdet i den negative kontrollcellen (forskjellig negativ kontroll) er en annen metode for behandling av ikke-spesifikke bindingsproblemer. Alternativt, ved hjelp av en annen type chip kan også påvirke kvaliteten på data. Ulike typer sensorbrikkene er kommersielt tilgjengelig, basert på ulike kjemikalier. I den mest brukte sensorbrikke (CM-5 chip) karboksymetylert dekstran er kovalent bundet til en gulloverflate. Proteiner kan være kovalent bundet til føleroverflaten ved hjelp av en rekke meget enkle overflatekjemi (oftest amin eller tiol kopling). Men i våre hender, når du arbeider med membran proteiner kovalente immobilisering ofte gir artefakter og er dermed ikke metoden for valg. I sammenheng med å studere et membranprotein, er det verdt å merke seg at det finnes kommersielle chips som er belagt med lipofile molekyler. Disse gjør det IMMOBilization av membran proteiner på en innfødt-lignende miljø. Lignende sensorbrikkene kan også være forberedt "i huset". For en beskrivelse av andre koblingsmetoder se 10,11. Protokollen er beskrevet her er basert på bruk av Ni-NTA-brikke for immobilisering av en Hans tagget, vaskemiddel oppløst transportør (analytten ikke er His-tagget for å unngå analytt binding til chip overflaten). Etter vår erfaring 6,12, kinetiske konstanter avledet fra eksperimenter utført med Ni-NTA chips er i god overensstemmelse med de som ble bestemt i native-lignende miljøer. Selv Ni-NTA chips er relativt dyre, er deres primære fordelen at de kan bli strippet av ligand og gjenbrukt. Hundrevis av målinger kan gjøres per chip. Dessuten er den ligand orientering på brikken bestemmes av posisjonen til den his-tag, og er således ganske homogen.
Når en interaksjon har blitt spilt inn av SPR, en rekke kontroller og RepeATS er nødvendig for å bekrefte gyldigheten av SPR signal. Verifisering av de følgende parametere kan hjelpe til å validere SRP data:
1. Spesifisitet av SPR-signal: på grunn av den høye følsomheten til SPR, er bruken av egnede negative kontroller av spesiell betydning. Ikke-spesifikk interaksjon registrert av SRP kan være på grunn av adsorpsjon av en analytt til matriksen. Derfor er en tom strømningscelle ofte ikke det beste alternativet siden en strømningscelle lastet med protein (ligand) ikke er kjemisk ekvivalent til en tom strømningscelle. Et bedre alternativ er å bruke en inaktiv mutant variant av liganden, som er kjent for ikke å binde analytten. Alternativt kan man bruke en tilsvarende mutert analytt. Dersom slike mutanter er ikke tilgjengelige et homologt protein (men forskjellig bindingsspesifisitet) kan brukes 12. Eksempler på gode negative kontroller er en homolog ligand (som beskrevet her), eller en punktmutasjon i en av de samvirkende partnere som er kjent for åavskaffe foreningen. En annen anbefalt negativ kontroll er endring av en post-translasjonell modifikasjon (f.eks, fosforylering, metylering, tiol avledning) som er essensielle for interaksjon. For eksempel, de-fosforylering av et tyrosin som er avgjørende for SH2 domene interaksjon. Andre negative kontroller kan være systemspesifikk. Ved bruk av SPR, kan betydningen av å bruke strenge negative kontroller ikke overdrives.
2. Reproduserbarhet av SPR-signal: SPR er en svært reproduserbar metode. Når like store mengder ligand er lastet på biosensor chip og like konsentrasjoner av analytten blir injisert gjentakelser bør perfekt justere (se figur 3).
3. Regenerering av systemet: i interaksjoner med en langsom dissosiasjon hastighet (k d), analytten må strippes fra liganden samtidig bevare funksjonell og strukturell integritet latter. Hvis dissosiasjon og / eller regenerering er ufullstendige, vil SPR signal gradvis forfalle på påfølgende injeksjoner av analytten. Typiske Regenererende forhold som kan testes er høye konsentrasjoner av Mg 2 + (opp til 2 m), sure eller basiske betingelser (for eksempel 10 mM glysin pH 2,5, 10 mM NaOH), høy salt (opp til 4 M NaCl), eller høy konsentrasjon vaskemiddel (f.eks 1% DDM). Imidlertid er den regenererende virkningen av disse reagensene (og andre) høyt systemspesifikke og dermed regenereringer betingelser må testes. I noen tilfeller er samspillet så stabil og sterk at regenerering er aldri fullstendig, som i tilfellet av E. coli vitamin B 12 transportsystem (BtuCD-F) 7. Under slike forhold er det eneste alternativet å strippe liganden fra biosensor chip og legg en ny ladning for hver injeksjon. I de tilfeller hvor dissosiasjon av analytten fra liganden er rask og fullstendig overflate regenerering er unødvendig(Se protokoll og figurene 2-3).
4. Membranproteiner er alltid renses i nærvær av detergent, noe som kan påvirke SPR følsomhet og reaksjonshastigheter. Men i vår erfaring med BtuCD, de målte priser er svært like. Man trenger alltid å få støtte bevis ved hjelp av gratis tilnærminger som størrelse utelukkelse kromatografi (SEC), pull-down-analyser, liposom sedimente analysen, etc. For eksempel en sammenheng mellom SPR og andre teknikker har blitt vist for metionin, vitamin B 12, og to molybdat systemer 6,12.
Feilaktig bestemmelse av de kinetiske hastighetskonstantene ofte oppstår under tilpasningsprosessen. Som en tommelfingerregel, bør du påføre den enkle Langmuir 1: 1 samhandlingsmodell for analyse kinetiske eksperimenter. De mer komplekse modeller foreta ytterligere forutsetninger konformasjonsendringer, bivalent analytt, eller prøve heterogenitet. Disse forutsetningene bør værelaget kun hvis den støttes av bevis fra andre eksperimentelle tilnærminger. Legg merke til at bruk av disse modellene vil mest sannsynlig resultere i bedre montering og lavere Chi to verdier, men dette bør ikke bli sett på som et vitnesbyrd for sin pålitelighet. De høyere grader av frihet gis av de mer komplekse modeller er vanligvis ansvarlig for bedre tilpasning, snarere enn deres mekanistisk relevans.
En av fordelene med SPR er dens brede kjemisk kompatibilitet, særlig med hensyn til vaskemidler som brukes for å oppløse og rense membranproteiner. Imidlertid, sukrose og glycerol (og andre viskøse løsninger) som ofte tilsettes under renseprosessen av membranproteiner har dramatiske effekter på RU. Det anbefales derfor å unngå disse hvis mulig, eller i det minste redusere deres konsentrasjon. Ved bruk av viskøse løsninger, unngå buffer mismatch blir avgjørende. Legge lipider til et vaskemiddel som inneholder RB kan forsterke bindingen tegnal med så mye som ti-fold. Imidlertid er en slik oppgave dyr (for de fleste lipider) og har en tendens til å forkorte levetiden av biosensor chips.
Tips og feilsøking nevnt ovenfor kan hjelpe når du kalibrerer et nytt system. Men et gitt system krever ofte spesiell tilpasning (for eksempel valg av vaskemiddel, salt, pH) for å oppnå optimale resultater.
SPR har lenge vært anerkjent som en kraftig og unik tilnærming til å måle molekylære interaksjoner. I de senere årene tilgjengeligheten av ulike SPR plattformer og deres fallende priser har gjort SPR mer tilnærmelig. Det er raskt blitt gullstandarden tilnærming for å studere protein-protein interaksjoner, target protein-interaksjoner, og i å oppdage bly små molekyl hemmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
