Summary
Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.
Introduction
Interazioni proteina-proteina (PPI); la formazione e la dissociazione di complessi proteici, sono eventi chiave in molti processi biologici (ad esempio, la replicazione, la trascrizione, traduzione, di segnalazione, di comunicazione cellula-cellula). Studi semi-quantitativa di PPI sono spesso eseguiti con pull-down o esperimenti di immuno-precipitazione. Tuttavia, queste tecniche (e simili) sono limitati nella gamma di affinità che può essere misurata (basso e maggiore affinità micromolare) per le fasi di lavaggio che sono inerenti a tali tecniche. Tali tecniche "end-point" non in grado di identificare le interazioni affinità transitori o bassi che sono spesso di grandi conseguenze biologiche. Inoltre, la risoluzione temporale di tali approcci è estremamente limitato, solitamente ordini di grandezza più lento rispetto ai tassi di reazione. SPR supera queste carenze per la sua sensibilità e risoluzione temporale superiore a 1,2. SPR è un metodo privo di etichette, e come taleinterazione molecolare può essere misurata (purché le variazioni di massa possono essere rilevati). Oltre a PPI, è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare la proteina-ligando, proteina-farmaco (o piccola molecola), proteina-DNA, e le interazioni proteina-RNA 3-5. I risultati sono registrati e tracciati in tempo reale, che consente una rapida modifica delle condizioni sperimentali e il disegno sperimentale flessibile.
Il principio fisico dietro strumenti basati SPR è l'utilizzo di un sistema ottico che misura un cambiamento dell'indice di rifrazione sulla superficie del sensore sulla massa cambia 2. Uno dei partner interagenti (ligando di seguito) è immobilizzato su un chip matrice polimerica e la seconda molecola (in seguito analita) è fluita sulla superficie. Analita legame al ligando altera la massa sulla superficie del chip. Questo cambiamento massa è direttamente proporzionale alla variazioni dell'indice di rifrazione della superficie. I risultati sono riportati in tempo reale epresentate come unità di risposta (RU) in funzione del tempo. Tale trama è definita una Sensogramma (es, Figura 1). Poiché SPR segue il decorso completa dell'interazione, pre-equilibrio costanti di velocità cinetica derivano, oltre all'equilibrio affinità. Come descritto di seguito, il comportamento pre-equilibrio di un dato sistema contiene molte informazioni, e fornisce una prospettiva molto diverso equilibrio da solo. Una volta che il sistema è calibrato, esperimenti sono molto veloci e richiedono solo piccole quantità di materiale proteico (microgrammi di nanogrammi importi). Raccolta delle informazioni complete cinetica di un dato sistema può essere realizzato in giorni. L'elevata sensibilità della SPR offre misurazioni che non sono possibili con qualsiasi altra tecnica 6. Tuttavia, questa elevata sensibilità è una 'spada a doppio taglio' dal momento che può essere una fonte importante per i dati falsi positivi. Qualsiasi fattore che influenza l'indice di riflessione viene registrata e tracciata sul Sensogramma. Come tale, apcontrolli propriate devono essere utilizzati per eliminare i falsi positivi, e il sostegno di strategie complementari è altamente consigliato.
La figura 1 illustra la progressione di un esperimento SPR tramite un chip sensore NTA-rivestito. Il Sensogramma nel riquadro A mostra l'iniezione degli ioni nichel sulla matrice NTA (dati unsubtracted), e visualizza i dati BD pannelli dopo aver sottratto il segnale derivato dalla cella controllo negativo. Frecce rosse e blu mostrano inizio dell'iniezione e la fine, rispettivamente. Immobilizzazione del ligando sul chip altera gradualmente la massa fino iniezione è terminata. Il plateau stabile osservata dopo la cessazione di iniezione del ligando riflette l'associazione stabile del ligando alla superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una volta che una linea di base stabile si ottiene un buffer viene iniettato il ligando e la cella di riferimento (Figura 1B, ciclo 3) .Questo iniezione serve come 'controllo in bianco ", e saràsottratto durante l'analisi. Dopo l'iniezione, cambiamenti minori sono registrati, riflettendo un flusso di massa attraverso il chip. Quindi in un ciclo separato (Figura 1B, ciclo 4), l'analita viene iniettato; il graduale aumento RU rappresenta l'associazione della analita al ligando. I siti di legame diventano via via occupati fino al raggiungimento dell'equilibrio. Appena finisce l'iniezione, un calo della RU riflette dissociazione del complesso. Da tali sensograms pre-equilibrio e di equilibrio costanti di velocità possono essere derivati (vedi più avanti). La figura 1 illustra l'interazione transitorio tra il legante e analita. Quando l'interazione è più stabile, la diminuzione del livello di IF è più lento, riflettendo una minore k d.
Qui, descriviamo un esperimento SPR per caratterizzare l'interazione tra un trasportatore di membrana (detergente solubilizzato) e il suo partner funzionale suo substrato affine proteina di legame 6,7. Il mod sceltael sistema è un ATP cassette binding (ABC) trasportatore, ModBC-A di Archeaglobus fulgidus. Questo sistema è stato scelto per i suoi risultati altamente riproducibili, elevato rapporto segnale-rumore, e classica 'on / off' i tassi. Inoltre, trasportatori omologhi ABC sono a disposizione per servire come importanti controlli negativi. Il trasportatore, ModBC (ligando A) viene estratto dalla membrana con detersivo, purificata e immobilizzato sul chip. Il suo partner di interagire solubile, ModA, è l'analita. Come ligando controllo negativo, una diversa RbsBC ABC trasportatore viene utilizzato ("ligando B").
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Protocol
1. Protein Sample Buffer e preparazione
- Preparazione del campione: purificare le proteine di interesse e assicurarsi che tutti gli aggregati vengono rimossi, iniettando la proteina prima dell'esperimento su una colonna di gel-filtrazione o mediante ultracentrifugazione (di solito 10 min a 100.000 xg è sufficiente).
NOTA: Anche se auspicabile, preparati proteici altamente puri non sono un must. SPR è stato utilizzato con successo con purificazioni tutt'altro che perfetto e anche con l'estratto totale 8,9. - Buffer Preparazione:
- Preparare il buffer dell'esperimento (chiamato "tampone di corsa", o RB). Per il protocollo qui descritto, utilizzare 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltoside). Tenere presente che la scelta della composizione buffer può essere facilmente modificato secondo il sistema studiato.
- Filtrare tutti i tamponi e campioni di proteine con 0.22 micron filtri. Assicurarsi in anticipo che i filtri siano proteicacompatibili. In generale, le piattaforme SPR recentemente commercializzati contengono una in-line de-Gasser; Se questo non è il caso, de-gas buffer prima dell'uso.
- Dializzare durante la notte o diluire i campioni contro il RB per evitare discordanze tampone. Dialisi (o qualsiasi altro metodo di scambio buffer) è particolarmente consigliabile quando si utilizzano sostanze chimiche ad alta viscosità (per esempio, saccarosio, glicerolo, DMSO). Prima di collegare la bottiglia RB alla pompa tenere da parte 10 ml di RB in un tubo separato.
- Diluire il ligando magazzino concentrato in RB ad una concentrazione finale di ~ 20 ug / ml. Come regola generale, per stabile ligando di immobilizzazione, utilizzare basse concentrazioni di ligando con iniezioni più a basso flusso, in contrapposizione ad alte concentrazioni, ad alto flusso e iniezioni più brevi.
- Diluire l'analita nel RB alla concentrazione desiderata. Tipicamente, testare la gamma di concentrazioni per un sistema di sconosciuta affinità da 10 pM a 10 nM in diluizioni di dieci volte. Iniziare semprecon le concentrazioni inferiori prime.
2. Sensor Chip
- Selezione Chip: utilizzare un acido nitrilotriacetico (NTA) del circuito integrato accoppiato adatto per catturare le proteine con un tag oligo-istidina.
- Utilizzo Chip:
- Quando si utilizza un nuovo chip, prendere il chip fuori dal fodero, lavare delicatamente con doppia acqua distillata (DDW), asciugare accuratamente rimanenti liquidi con tergicristalli delicati, e fare attenzione a non toccare la superficie strato di oro. Posizionare il chip nel fodero con l'orientamento corretto (l'inserimento è liscia quando il chip è posizionato correttamente).
- Quando riutilizzare un chip, togliere il chip memorizzato dal buffer, sciacquare abbondantemente con DDW e asciugare delicatamente come detto in precedenza, e mettere nel fodero originale.
NOTA: L'accumulo di materiale spazzatura non specifici sul chip può influenzare il suo 'redditività'. Questo può essere monitorato confrontando UR prima ligando immobilizzazione e post stripping. Anche se molte misure possono esserefatto utilizzando lo stesso chip NiNTA, la questione della sua longevità non è una 'netta' e varia notevolmente tra i diversi chip.
- Chip attracco: Aprire la porta chip del sensore e posizionare il chip nel fodero. Quando si utilizza un nuovo chip, il numero di serie di input del chip di mantenere record di utilizzo. Chiudere la porta e premere 'di chip dock'.
3. Impostazioni di temperatura
- Impostare la temperatura della cella di chip a 25 ° C (o la temperatura preferita esperimento).
- Opzionale: impostare il vano campioni a 7 ° C per mantenere le proteine stabile per tutto l'esperimento.
4. Soluzioni per Caricamento e Spogliarello
Preparare le seguenti soluzioni di carico e stripping: 0.5 mM NiCl 2 in RB, 350 mM EDTA a RB (aggiungere detersivo per soluzione di EDTA ad una concentrazione finale in RB), 0,25% SDS in H 2 O, e HCl 100 mM in H 2 O. Quando si utilizza micro-centrifuga vascaES e non SPR tubi designati, non dimenticate di tagliare i tappi dei tubi.
5. Prime strumento SPR con RB
6. Avviare una nuova corsa
- Impostare la portata che verrà utilizzato durante l'esperimento. Per ottenere i risultati descritti qui impostare il flusso di 50 microlitri / min.
NOTA: Questo parametro può essere modificato durante l'esperimento. - Definire i percorsi di flusso e riferimento sottrazione. Per ottenere i risultati descritti qui definiti i percorsi Fc = 1 e Fc = 2, sottrazione Fc = 2-1.
NOTA: Il programma visualizza in tempo reale la sottrazione di due celle di misura. Tenete a mente che questo parametro non può essere modificato durante l'esperimento. - Selezionare il rack idoneo campione (che può influenzare il consumo di volume del campione).
- Salvare il file dei risultati.
7. Cicli Experiment
Ogni esperimento è composto da cicli, mantenere una chiara annotazione delle iniezioni fatte in EAciclo ch, e separare il carico dei ligandi ', iniezione vuoto del buffer e l'iniezione analita in diversi cicli.
- Ciclo 1: preparazione Chip e nichel carico
- Assicurarsi che il flusso e percorsi sono impostati secondo al punto 6.1 e 6.2.
- Iniettare 350 mM EDTA per 1 min a lavare via gli avanzi.
- Impostare il flusso a 10 ml / min.
- Iniettare 0,5 NiCl mM 2 per 2 minuti.
NOTA: Ora la resina chip è ricoperta da ioni nichel.
- Ciclo 2: ligandi immobilizzazione
- Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 2.
- Iniettare ligando A fino a raggiungere valori RU che sono 10-20 volte del suo peso molecolare. Ad esempio, caricare un ligando di 50 kDa a 500-1000 IF. Tenere un registro del valore RU raggiunto.
- Set flusso di 15 ml / min, percorso di flusso Fc = 1.
- Iniettare ligando B (controllo) fino allo stesso valore di quella di RU ligando A. Monitorare il Sensogramma sottrazione (Fc = 2-1) on-line per aiutare a controllare ilLunghezza iniezione.
- Impostare il flusso a 50 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, lavare il sistema per 5-20 minuti fino a quando la linea di base (Fc = 2-1) stabilizza.
- Ciclo 3: iniezione Blank. Questa iniezione servirà per vuoto sottrazione, pertanto includere tutti i componenti che verranno iniettati con l'analita, tranne dell'analita stesso.
NOTA: lunghezza iniezione può variare a seconda del tempo necessario per raggiungere l'equilibrio (segnale plateau).- Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, Fc = 2-1 sottrazione.
- Inserire il comando 'attendere' (denominato qui di seguito come 'aspettare') per 30 secondi (per avere una linea di base stabile).
- Iniettare 15 sec RB.
NOTA: La durata dell'iniezione può variare tra sistemi diversi, a seconda delle loro costanti cinetiche pre-equilibrio (principalmente k a). - Attendere 120-600 sec per registrare la fase di dissociazione.
NOTA: La lunghezza di questa fase varia secondo la
- Ciclo 4: iniezione Analita
- Copia / incolla le condizioni esatte utilizzate nella iniezione di riferimento (ciclo 3) così queste due iniezioni possono essere successivamente sottratti. Cambiare la posizione dello slot nel rack da quella contenente la soluzione di controllo a uno che contiene la soluzione di analita. Scegli una concentrazione che è leggermente superiore al previsto K D. Se alcuna conoscenza preliminare è disponibile, scegliere 1 micron come un buon punto di partenza.
- Ciclo 5: iniezione Buffer
- Ripetere il ciclo 3.
- Ciclo 6: iniezione Analita
- Ciclo Repeat 4.
- Ciclo 7: Chip spogliarsi
- Impostare il flusso a 50 ml / min. </ Li>
- Iniettare 350 mM EDTA per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip.
- Iniettare 0,25% SDS per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip.
- Se il livello di base non viene raggiunto, iniettare HCl 100 mm per 1 min, come ulteriore passo di stripping.
- Inserire il comando 'fine corsa' che passa alla modalità standby.
- Stoccaggio Chip
- Disancorare chip del sensore e portarlo dallo strumento.
- Prendete il sensore fuori dal fodero, evitare di toccare la superficie, risciacquare con DDW, e posto in un tubo da 50 ml contenente RB. Conservare a 4 ° C.
8. analisi dei dati utilizzando Designated Evaluation Software
- Effettuare le seguenti operazioni per elaborare i dati grezzi ottenuti da SPR prima derivazione dei parametri cinetici.
- Utilizzando il software di valutazione, apertoil file dei risultati, selezionare cicli 3-6 Fc = 2-1 (riferimento dati sottratto).
- Axis turno:
- Cicli di visualizzazione 3-6.
- Zero il valore Y della linea di base (30 sec tempo di attesa iniziale in ogni ciclo) al di tutte e quattro curve.
- Allineare l'asse x delle quattro curve. Scegli caratteristiche marcate (ad esempio, i picchi di inizio iniezione o arrivo) per allineare perfettamente le quattro curve lungo l'asse X. Impostare l'ora di inizio di analita (o buffer di controllo) a zero.
- Riferimento sottrazione
- Sottrarre la risposta di fondo sottraendo curva del ciclo 3 dalla curva del ciclo di 4 e la curva del ciclo di 5 dalla curva del ciclo 6. Utilizzare il menu l'operazione di sottrazione delle curve che si possono trovare nella Y sposta.
NOTA: E 'importante eseguire questo passaggio in cui annulla tutti i componenti non specifici (non collegati all'analita) che possono aver influenzato l'indice di rifrazione della superficie.- Salvare le curve sottratti in tegli scheda di progetto con un nome diverso.
- Vedere queste curve come "curve doppiamente sottratta": la prima è la sottrazione 2-1 sottrazione eseguita su entrambi iniezioni, e il secondo è la sottrazione di una curva da un altro.
NOTA: Tale doppio riferimento è il gold standard negli esperimenti SPR. - Sovrapponete le curve sottratti eseguendo spostamento dell'asse come spiegato prima.
- Sottrarre la risposta di fondo sottraendo curva del ciclo 3 dalla curva del ciclo di 4 e la curva del ciclo di 5 dalla curva del ciclo 6. Utilizzare il menu l'operazione di sottrazione delle curve che si possono trovare nella Y sposta.
- Determinazione delle cinetiche costanti e montaggio di modello
- Condurre un esperimento cinetica
- Iniettare una serie di 6-7 concentrazioni di analita avere un affidabile di dati per determinare le costanti cinetiche. Scegliere concentrazioni di analiti da 10 volte sopra a 10 volte inferiore alla stima K D, in diluizioni 2-3-fold. Includere la concentrazione "zero", poi utilizzato per la doppia sottrazione di riferimento (vedi sopra). Condurre iniezioni in triplice copia e in ordine casuale.
- Allinearee sottrarre tutte le curve rispetto asse Y e l'asse X prima di montaggio di modello.
- Montaggio Modello
- Selezionare un programma di analisi adatto.
NOTA: La maggior parte dei programmi di montaggio disponibili offrono diversi modelli che possono essere applicati per il montaggio e la determinazione delle costanti cinetiche. - Applicare il modello più semplice (Langmuir) assumendo una reversibili 1: 1 interazione tra l'analita ed il legante per il montaggio. A meno convincente dati sono disponibili da altri metodi sperimentali per l'esistenza di una interazione più complessa, utilizzare sempre il semplice modello Langmuir.
- Selezionare un programma di analisi adatto.
- Condurre un esperimento cinetica
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Representative Results
Nel sistema descritto, un chip NiNTA viene usato per immobilizzare il trasportatore di membrana His-tag 6,7. Essendo un homo-dimero, ogni trasportatore è doppiamente marcato, migliorando il suo legame al chip NiNTA. A seguito di nichel carico, ligando A (il trasportatore di interesse) è immobilizzato su Fc = 2, fino a ~ 3.500 RU (ciclo di protocollo 2, figura 2A etichetta nera). Quindi, utilizzando la stessa portata e durata dell'iniezione, ligando B (il ligando di controllo) viene iniettato in Fc = 1, inizialmente raggiungendo solo fino ad un ~ 3000 RU. Per assicurarsi che simili quantità di proteine sono immobilizzati su entrambe le celle di flusso; ligando B viene ulteriormente caricato, utilizzando l'iniezione più breve, mentre un attento monitoraggio del carico fino a 3.500 IF. La forma 'scale' rappresenta il graduale aumento della massa su Fc = 1 su ogni iniezione (etichetta grigio Figura 2A). Un monitoraggio di Fc on-line = 2-1 aiuta il controllo della parità ligando di carico. Figura 2B mostra la Fc = 2-1 sottrazione, cioè, sottraendo il valore massimo in RU Fc = 2, dalle incrementi graduale del valore RU in Fc = 1. È importante variare la durata di iniezioni leganti, di avere uguali caricamento dei ligandi studiati e di controllo. Al contrario, quando si inietta l'analita, la durata dell'iniezione deve essere mantenuto costante per tutte le concentrazioni utilizzate. Figura 3A e 3B mostrano le risposte misurate iniettando un 'analita blank' (cioè, RB omettendo unicamente l'analita) in cicli 3 e 5, e le iniezioni analiti (in cicli 4 e 6). Si noti che entrambi sensograms rappresentano la Fc = 2-1 sottrazione. In ciascuno dei cicli (3-6) un'iniezione analita identica (vuoto o una data concentrazione) viene applicato sulle due celle di flusso, immobilizzato con differenti ligandi. I due ripetizioni sovrappongono molto bene, dimostrando l'elevata riproducibilità di SPR. Una risposta è registrato in entrambi i casi; ~ 3 RU per il bianco contro il ~ 40 RU per l'analita. Questi valori rappresentano un rapporto segnale-rumore di ~ 13. Per ottenere i sensograms doppio riferimento, che rappresentano solo la risposta vincolante specifico, l'iniezione vuoto è ormai sottratta dalla iniezione analiti (~ 37 RU, Figura 3C). Il Sensogramma registrata rivela il modello caratteristico di un'interazione transitoria. Dopo l'iniezione, la fase di associazione è caratterizzata da un rapido aumento della quantità di analita ligando-bound, raggiungendo stato stazionario dopo ~ 7 secondi. Lo stato stazionario viene mantenuto finché l'analita viene iniettato. Quando termina l'iniezione, le cellule vengono lavate con RB innescando la fase di dissociazione. Il complesso si dissocia rapidamente, e come l'analita viene lavato via dal legante il segnale SPR ritorna basale.
Per ottenere dati quantitativi (pre-equilibrio e costanti di equilibrio), una serie di concentrazioni di analiti viene iniettato in duplicati o triplicato (vedi 8.3.1 in protocollo).
Figura 1. Illustrazione delle fasi di un esperimento SPR utilizzando un chip sensore Ni-NTA. (A (B - D) Illustrazione del Fc = 2-1 Sensogramma registrato durante un esperimento SPR. Nel ciclo di 2 come legante suo-tag viene iniettato sulla superficie Ni-carica, massa accumula gradualmente. Iniezione è terminata quando raggiunge un valore finale compreso tra 1.000-5.000 RU RU (MW a seconda del ligando). Una linea di base è formato, che riflette il legame stabile del ligando al chip. Nel ciclo di 3, una iniezione di vuoto è preformato, iniettando i componenti del campione da analizzare escludendo solo l'analita. In questa iniezione spesso una risposta bassa viene registrata (1-5 RU). Nel ciclo di 4 dell'analita viene iniettato con lo stesso regime, come l'iniezione vuoto. La crescente IF riflette la variazione di massa sulla superficie, cioè, il legame dell'analita al ligando. Il segnale aumenta rapidamente e quindi altipiani come the sistema raggiunge l'equilibrio. Quando termina l'iniezione, l'analita dissocia dal ligando, con una conseguente diminuzione del segnale e tornare ai livelli basali.
Figura 2. monitoraggio linea di carichi ligando. (A) curve Unsubtracted di ligando carico. Il ligando di interesse (ligando "A") è caricato a scorrere cella 2 (Fc = 2, nero) fino a raggiungere il livello desiderato RU (~ 3500 RU in questo esempio). Poi, il ligando controllo negativo (ligando "B") è graduale caricato su cella di flusso 1 (Fc = 1, grigio) finché un livello di IF identica è raggiunto. (B) Le due iniezioni attuate in (A) monitorati in tempo reale come Fc = 2-1 sottrazione. Tale monitoraggio facilita il carico identica di ligandi di interesse e di controllo.
Figura 3. Doppio riferimento. (A) duplicati di un 2-1 sottrazione (cioè, Fc = 2-1) dell'iniezione vuoto. (B) Come in (A), solo analita viene iniettato. (C) sensograms finale dopo la sottrazione della risposta di fondo mostrato in (A) dalla risposta misurata in (B). Queste curve sono indicati come 'doppio oscurata "o' doppio riferimento". I duplicati sono dei cicli sequenziali.
. Figura 4. Determinazione di costanti di velocità cinetiche con iniezioni di più concentrazioni di analiti (in doppio) Le linee nere sono gli attacchi che sono stati calcolati utilizzando un semplice 1: 1 Langmuir modello di interazione.
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Discussion
SPR è un metodo altamente sensibile per studiare le interazioni molecolari, ed è spesso l'unico approccio che fornisce il monitoraggio in tempo reale di transitori (ma importanti) interazioni. Un esempio è l'interazione transitoria qui presentata, che non poteva essere rilevata da un altro metodo (saggi di pull-down, saggi liposomi sedimentazione 6). Inoltre, mentre altri metodi sono limitati all'equilibrio misurazioni (sia quantitativa o qualitativa), SPR è uno dei pochi tecniche che misurano anche la cinetica pre-equilibrio.
La sua sensibilità è anche il suo avvertimento. Sensograms falsi-positivi sono prontamente registrati. Si raccomanda pertanto di stabilire l'esistenza di interazione con altri metodi prima di tentare misurazioni SPR. Prima conoscenza delle caratteristiche del sistema (valutazione approssimativa della K D, stabile rispetto interazione transitoria) è molto utile nella creazione di SPR experimeNTS e valutare la rilevanza funzionale delle misure ottenute. Una questione importante da tenere a mente prima di iniziare le misurazioni SPR è la qualità dei campioni di proteine. SPR è molto sensibile agli aggregati e questi deve essere rimosso sia dal ligando e le preparazioni di analiti (mediante cromatografia per gel filtrazione o ultracentrifugazione quando possibile). Un'altra fonte di rumore e falsi segnali possono derivare da disallineamenti cuscinetto tra la RB e il buffer dell'analita. Questo può essere risolto dialisi dell'analita contro la RB, oppure utilizzando un preparato ad alta concentrazione dell'analita che è diluito molte pieghe (~ 100-1.000 volte) nella RB. Dati falsi positivi possono anche derivare da interazioni non specifiche dell'analita con matrici del chip o con il controllo negativo. Queste interazioni sono di bassa affinità, così a volte può essere evitato utilizzando basse concentrazioni di analiti. Inoltre, l'inclusione di bassa BSA e / o detergenti concentrazioni (0,1 mg / ml e / o 0,05-0.1% (W / v), rispettivamente) ai RB e al campione analita iniettato può ridurre le interazioni non specifiche. Cambiare il contenuto della cella di controllo negativo (controllo negativo diversa) è un altro approccio per affrontare le questioni di legame non specifici. In alternativa, utilizzando un altro tipo di chip può anche influenzare la qualità dei dati. Vari tipi di chip del sensore sono disponibili in commercio, in base a diverse sostanze chimiche. In il chip più comunemente usato sensore (chip CM-5) carbossimetilata destrano è covalentemente attaccato ad una superficie d'oro. Le proteine possono essere covalentemente accoppiati alla superficie del sensore usando una varietà di molto semplici chimiche superficiali (più comunemente ammina o giunto tiolo). Tuttavia, nelle nostre mani, quando si lavora con proteine di membrana immobilizzazione covalente spesso produce manufatti e non è quindi il metodo di scelta. Nel contesto di studiare una proteina di membrana, è da notare che esistono chip commerciali che sono rivestite con molecole lipofile. Questi consentono immobSterilizza- di proteine di membrana su un ambiente nativo-like. Chip sensori simili possono anche essere preparati 'in casa'. Per una descrizione di altri metodi di attacco vedi 10,11. Il protocollo qui descritto è basato sull'uso di chip di Ni-NTA per l'immobilizzazione di un suo tag, detergente transporter solubilizzato (dell'analita non è His-tag per evitare legame alla superficie del chip analita). Nella nostra esperienza 6,12, costanti cinetiche derivati da esperimenti condotti con chip Ni-NTA sono in buon accordo con quelli determinati in ambienti nativo-come. Sebbene chip Ni-NTA sono relativamente costosi, il loro vantaggio principale è che possono essere privati del ligando e riutilizzate. Centinaia di misurazioni possono essere effettuate per chip. Inoltre, l'orientamento del ligando sul chip viene determinata dalla posizione del suo-tag e quindi è abbastanza omogenea.
Una volta che una interazione è stato registrato con successo da SPR, una serie di controlli e repeATS sono necessari per verificare la validità del segnale SPR. Verifica dei seguenti parametri può aiutare per convalidare i dati SRP:
1. Specificità del segnale SPR: a causa della elevata sensibilità della SPR, l'uso di appropriati controlli negativi è di particolare importanza. Interazione aspecifica registrato da SRP può essere dovuta all'adsorbimento di un analita alla matrice. Pertanto, una cella di flusso vuoto spesso non è la migliore opzione poiché una cella di flusso caricato con proteina (il ligando) non è chimicamente equivalente ad una cella di flusso vuoto. Una soluzione migliore è quella di utilizzare una variante mutante inattiva del ligando, quello che è noto non per legare l'analita. In alternativa, si può usare un analita simile mutato. Se tali mutanti non sono disponibili una proteina omologa (ma di differente specificità di legame) può essere utilizzato 12. Esempi di controlli negativi sono buoni un ligando omologhi (come descritto qui), o una mutazione puntiforme in una delle parti interagenti che è notoriamenteabolire l'associazione. Un'altra raccomandato controllo negativo è alterazione di una modificazione post-traduzionale (per esempio, fosforilazione, metilazione, tiolo derivazione) che è essenziale per l'interazione. Ad esempio, de-fosforilazione di una tirosina che è essenziale per l'interazione del dominio SH2. Altri controlli negativi possono essere di sistema specifico. Quando si utilizza SPR, l'importanza di utilizzare rigorosi controlli negativi non può essere sopravvalutata.
2. Riproducibilità del segnale SPR: SPR è un metodo estremamente riproducibile. Quando uguali quantità ligando vengono caricati sul chip biosensore e uguali concentrazioni dell'analita vengono iniettate le ripetizioni dovrebbero allineare perfettamente (vedi Figura 3).
3. La rigenerazione del sistema: in interazioni con un tasso di dissociazione lenta (k d), l'analita deve essere rimosso dal legante preservando l'integrità funzionale e strutturale latter. Se dissociazione e / o la rigenerazione sono incompleti, il segnale SPR gradualmente decadere su successive iniezioni di dell'analita. Condizioni rigeneranti tipiche che possono essere testati sono alte concentrazioni di Mg 2+ (fino a 2 m), le condizioni di acidi o basici (ad esempio, 10 mM glicina pH 2,5, NaOH 10 mM), di sale (fino a 4 M NaCl), o concentrazione di detersivo alta (ad esempio 1% DDM). Tuttavia, l'efficacia rigenerante di questi reagenti (e altri) è, e quindi le condizioni di rigenerazioni devono essere testati altamente specifico sistema. In alcuni casi, l'interazione è così stabile e forte che la rigenerazione è mai completa, come nel caso della E. coli sistema di trasporto di vitamina B 12 (BtuCD-F) 7. In tali condizioni, l'unica opzione è quella di togliere il ligando dal chip biosensore e ricaricare un lotto fresco per ogni iniezione. Nei casi in cui la dissociazione dell'analita dal ligando è la rigenerazione superficiale veloce e completa è inutile(Vedi protocollo e figure 2-3).
4. Le proteine di membrana sono sempre purificati in presenza di detersivo, che può influenzare i tassi di sensibilità e di reazione SPR. Tuttavia, nella nostra esperienza con BtuCD, i tassi misurati sono molto simili. Bisogna sempre avere prove utilizzando approcci complementari quali la cromatografia di esclusione dimensione (SEC), saggi di pull-down, liposomi sedimentazione test, etc. Per esempio una correlazione tra SPR e altre tecniche è stato mostrato per la metionina, vitamina B 12, e due sistemi molibdato 6,12.
Erronea determinazione delle costanti di velocità cinetiche nasce spesso durante il processo di adattamento. Come regola generale, applicare sempre il semplice Langmuir 1: 1 modello di interazione per gli esperimenti cinetici di analisi. I modelli più complessi fanno ulteriori ipotesi di cambiamenti conformazionali, analita bivalente, o campione eterogeneità. Queste ipotesi devono esserefatta solo se suffragate da prove da altri approcci sperimentali. Si noti che l'applicazione di questi modelli sarà molto probabilmente in una migliore montaggio e inferiore Chi 2 valori, ma questo non dovrebbe essere vista come una testimonianza per la loro affidabilità. I gradi più elevati di libertà offerte dai modelli più complessi di solito sono responsabili per il migliore adattamento, piuttosto che la loro pertinenza meccanicistica.
Uno dei vantaggi di SPR è la sua ampia compatibilità chimica, in particolare per quanto riguarda i detergenti che sono usati per solubilizzare e purificare proteine di membrana. Tuttavia, saccarosio e glicerolo (e altre soluzioni viscose) che vengono spesso aggiunti durante il processo di purificazione di proteine di membrana hanno effetti drammatici sul RU. Si raccomanda pertanto di evitare questi se possibile, o almeno ridurre la loro concentrazione. Quando si utilizzano soluzioni viscose, evitando tampone mancata corrispondenza diventa essenziale. Aggiunta di lipidi ad un detergente contenente RB può amplificare il segno vincolanteal di ben dieci volte. Tuttavia, un tale sforzo è costoso (per la maggior parte lipidi) e tende a ridurre la durata dei chip biosensore.
I consigli e risoluzione dei problemi di cui sopra possono aiutare durante la calibrazione di un nuovo sistema. Tuttavia, un dato sistema spesso richiede specifici aggiustamenti (ad esempio, la scelta del detersivo, sale, pH) per ottenere risultati ottimali.
SPR è da tempo riconosciuta come un approccio unico e potente per misurare le interazioni molecolari. Negli ultimi anni la disponibilità di varie piattaforme SPR e dei loro prezzi in calo ha SPR più accessibile. Si sta rapidamente diventando il metodo gold standard per studiare le interazioni proteina-proteina, bersaglio interazioni proteina-droga, e nella scoperta di molecole inibitrici piombo piccoli.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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