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Biology

झिल्ली प्रोटीन की वास्तविक समय की माप: रिसेप्टर सहभागिता सतह plasmon अनुनाद का प्रयोग (एसपीआर)

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/51937
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, The Bruce and Ruth Rappaport Faculty of Medicine, The Technion-Israel Institute of Technology

Summary

सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) वास्तविक समय में जैव आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए एक लेबल से मुक्त तरीका है। इस के साथ साथ, एक झिल्ली प्रोटीन के लिए एक प्रोटोकॉल: तकनीक के पेशेवरों और विपक्ष पर चर्चा करते हुए रिसेप्टर बातचीत प्रयोग, वर्णित है।

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई); गठन और प्रोटीन परिसरों की हदबंदी, कई जैविक प्रक्रियाओं (जैसे, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, अनुवाद, सिगनल, सेल सेल संचार) में महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं। पल्स पोलियो टीकाकरण के अर्द्ध मात्रात्मक अध्ययन अक्सर पुल से नीचे या इम्युनो-वर्षा प्रयोगों का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इन (और) भी इसी तरह की तकनीक की वजह से इस तरह की तकनीक के लिए निहित हैं कि कपड़े धोने की सीढ़ियों को मापा जा सकता है कि समानताएं की सीमा (कम micromolar और उच्च आत्मीयता) में सीमित कर रहे हैं। इस तरह के "अंत बिंदु" तकनीक अक्सर महान जैविक परिणाम के हैं कि क्षणिक या कम आत्मीयता बातचीत की पहचान नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, इस तरह के दृष्टिकोण का अस्थायी समाधान अत्यंत, प्रतिक्रिया की दरों की तुलना में धीमी परिमाण के आम तौर पर आदेश के लिए सीमित है। एसपीआर इसकी वजह से बढ़ संवेदनशीलता और बेहतर अस्थायी समाधान 1,2 करने के लिए इन कमियों पर काबू। एसपीआर जैसे और, एक लेबल से मुक्त विधि है(मास परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में) आणविक बातचीत मापा जा सकता है। पल्स पोलियो टीकाकरण के अलावा, यह बड़े पैमाने पर प्रोटीन ligand, प्रोटीन-दवा (या छोटे अणु), प्रोटीन डीएनए और प्रोटीन-शाही सेना बातचीत 3-5 चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परिणाम दर्ज की गई और प्रयोगात्मक शर्तों और लचीला प्रयोगात्मक डिजाइन का तेजी से संशोधन सक्षम बनाता है जो वास्तविक समय में प्लॉट किए जाते हैं।

एसपीआर आधारित उपकरणों के पीछे भौतिक सिद्धांत बड़े पैमाने पर 2 परिवर्तन पर सेंसर की सतह पर अपवर्तक सूचकांक का एक परिवर्तन उपाय है कि एक ऑप्टिकल प्रणाली का उपयोग होता है। बातचीत भागीदारों (इसके बाद ligand) में से एक एक बहुलक मैट्रिक्स चिप और दूसरा अणु (इसके बाद विश्लेष्य) सतह पर प्रवाहित होती है पर स्थिर है। Analyte ligand के लिए बाध्य चिप सतह पर बड़े पैमाने बदल। यह बड़े पैमाने पर परिवर्तन सीधे और आनुपातिक सतह का अपवर्तनांक में परिवर्तन से संबंधित है। परिणामों को वास्तविक समय में प्लॉट किए जाते हैं औरसमय के एक समारोह के रूप में प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू) के रूप में प्रस्तुत किया। इस तरह के एक भूखंड एक sensogram में कहा जाता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 1)। एसपीआर बातचीत का पूरा समय पाठ्यक्रम इस प्रकार है के बाद से, पूर्व संतुलन गतिज दर स्थिरांक समानताएं संतुलन के अलावा, निकाली गई है। नीचे विस्तृत रूप में, एक दिया प्रणाली के पूर्व संतुलन व्यवहार ज्यादा जानकारी रखती है, और अकेले संतुलन की तुलना में एक बहुत अलग परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। प्रणाली calibrated है एक बार, प्रयोगों बहुत तेजी से कर रहे हैं और (मात्रा nanogram को माइक्रोग्राम) प्रोटीन सामग्री की ही छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है। एक दिया प्रणाली की पूरी गतिज जानकारी एकत्रित दिनों में प्राप्त किया जा सकता है। एसपीआर की उच्च संवेदनशीलता किसी भी अन्य तकनीक 6 का प्रयोग संभव नहीं है कि माप देता है। हालांकि, इस उच्च संवेदनशीलता यह झूठी सकारात्मक डेटा के लिए एक प्रमुख स्रोत हो सकता है के बाद से एक 'दोधारी तलवार' है। चिंतनशील सूचकांक को प्रभावित करता है कि किसी भी कारक दर्ज की गई और sensogram पर साजिश रची है। इस तरह, एपी के रूप मेंpropriate नियंत्रण झूठी सकारात्मक खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और पूरक दृष्टिकोण से समर्थन अत्यधिक की सलाह दी है।

चित्रा 1 एक NTA लेपित सेंसर चिप का उपयोग कर एक एसपीआर प्रयोग की प्रगति को दिखाता है। पैनल में sensogram NTA के मैट्रिक्स के ऊपर निकल आयनों (unsubtracted डेटा) के इंजेक्शन से पता चलता है, और पैनलों बी.डी. नकारात्मक नियंत्रण सेल से ली गई संकेत घटाने के बाद डेटा प्रदर्शित करते हैं। लाल और नीले तीर क्रमशः, इंजेक्शन शुरू और अंत दिखा। इंजेक्शन समाप्त होता है जब तक चिप पर ligand के स्थिरीकरण धीरे-धीरे बड़े पैमाने बदल। ligand के इंजेक्शन की समाप्ति के बाद मनाया स्थिर पठार सतह (चित्रा 1 बी, चक्र 2) के लिए ligand के स्थिर एसोसिएशन को दर्शाता है। एक स्थिर आधारभूत हासिल की है एक बार एक बफर ligand और है इस इंजेक्शन एक 'खाली नियंत्रण "के रूप में कार्य करता संदर्भ सेल (चक्र 3 चित्रा 1 बी,) पर इंजेक्ट किया जाता है, और हो जाएगाविश्लेषण के दौरान घटाया। इंजेक्शन पर, मामूली परिवर्तन चिप के माध्यम से बड़े पैमाने पर की एक प्रवाह को दर्शाती दर्ज हैं। तो एक अलग चक्र (चित्रा 1 बी, चक्र 4) में, विश्लेष्य इंजेक्ट किया जाता है; आरयू में क्रमिक वृद्धि ligand के लिए विश्लेष्य एसोसिएशन का प्रतिनिधित्व करता है। संतुलन तक पहुँच जाता है जब तक बाध्यकारी साइटों धीरे-धीरे कब्जा कर लिया हो। जैसे ही इंजेक्शन समाप्त हो जाती है, के रूप में रस में गिरावट जटिल की हदबंदी को दर्शाता है। पूर्व संतुलन और संतुलन दर स्थिरांक प्राप्त किया जा सकता है इस तरह के sensograms से। (बाद में देखें) एक ligand और विश्लेष्य के बीच एक क्षणिक बातचीत दर्शाया गया चित्र। बातचीत और अधिक स्थिर हो गया है, आरयू स्तर में गिरावट के लिए एक कम कश्मीर डी को दर्शाती है, धीमी है।

इस के साथ साथ, हम अपने आत्मीय सब्सट्रेट प्रोटीन 6,7 बाध्यकारी एक झिल्ली ट्रांसपोर्टर (डिटर्जेंट solubilized) और उसके कार्यात्मक साथी के बीच बातचीत निस्र्पक करने के उद्देश्य से एक एसपीआर प्रयोग का वर्णन है। चुना आधुनिक विपणनएल प्रणाली एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर, Archeaglobus fulgidus की ModBC-ए है। इस प्रणाली दरों '/ बंद', इसकी अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत चयनित है, और शास्त्रीय गया था। इसके अतिरिक्त, homologues एबीसी ट्रांसपोर्टरों के रूप में महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण की सेवा के लिए उपलब्ध हैं। ट्रांसपोर्टर, ModBC (ligand के ए) डिटर्जेंट, शुद्ध और चिप पर स्थिर का उपयोग कर झिल्ली से निकाला जाता है। इसके घुलनशील बातचीत साथी, मोडा, विश्लेष्य है। एक नकारात्मक नियंत्रण ligand के रूप में, एक अलग एबीसी ट्रांसपोर्टर RbsBC ("ligand के बी ') का इस्तेमाल किया जाता है।

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Protocol

1. प्रोटीन नमूना और बफर तैयारी

  1. नमूना तैयार: ब्याज की प्रोटीन शुद्ध और एक जेल निस्पंदन स्तंभ पर या ultracentrifugation द्वारा पूर्व प्रयोग करने के लिए प्रोटीन का इंजेक्शन लगाने से, सभी समुच्चय को हटा रहे हैं सुनिश्चित करें (100,000 XG पर्याप्त है आमतौर पर 10 मिनट पर)।
    नोट: वांछनीय, अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन की तैयारी एक चाहिए नहीं कर रहे हैं। एसपीआर सफलतापूर्वक कम से अधिक परिपूर्ण purifications साथ और भी कुल निकालने 8,9 के साथ इस्तेमाल किया गया है।
  2. बफर तैयारी:
    1. ("चल बफर" करार दिया, या आरबी) प्रयोग के बफर तैयार करें। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित के लिए, 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl और 0.05% (डब्ल्यू / वी) DDM (एन Dodecyl β-डी-maltoside) का उपयोग करें। बफर रचना का चुनाव आसानी से अध्ययन प्रणाली के अनुसार संशोधित किया जा सकता है कि मन में रखो।
    2. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग सभी buffers और प्रोटीन के नमूने फ़िल्टर। फिल्टर प्रोटीन हैं कि अग्रिम में सुनिश्चित करेंसंगत। सामान्य तौर पर, हाल ही में विपणन एसपीआर प्लेटफार्मों एक में लाइन डे-GASSER होते हैं; इस मामले में, डे-गैस नहीं है तो पूर्व बफ़र्स उपयोग करने के लिए।
    3. रातोंरात Dialyze या बफर बेमेल से बचने के लिए आरबी के खिलाफ नमूने पतला। उच्च चिपचिपाहट के रसायनों का उपयोग करते समय डायलिसिस (या बफर विनिमय के किसी अन्य विधि) विशेष रूप से सलाह दी जाती है (जैसे, सूक्रोज, ग्लिसरॉल, DMSO)। पंप प्रवेश करने आरबी बोतल को जोड़ने से पहले एक अलग ट्यूब में एक तरफ आरबी के 10 एमएल रहते हैं।
  3. 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / ~ की एक अंतिम एकाग्रता के लिए आरबी में केंद्रित ligand के शेयर पतला। उच्च सांद्रता, उच्च प्रवाह और कम इंजेक्शन के लिए विरोध के रूप में अंगूठे का एक नियम के रूप में, स्थिर ligand के स्थिरीकरण के लिए, कम प्रवाह में अब इंजेक्शन के साथ कम ligand सांद्रता का उपयोग करें।
  4. वांछित एकाग्रता के लिए आरबी में विश्लेष्य पतला। आमतौर पर, दस गुना dilutions में 10 एनएम के लिए 10 माइक्रोन से अज्ञात आत्मीयता की एक प्रणाली के लिए सांद्रता की सीमा का परीक्षण करें। हमेशा शुरूपहले कम सांद्रता के साथ।

2. सेंसर चिप

  1. चिप चयन: एक nitrilotriacetic एसिड (NTA) एक oligo-हिस्टडीन टैग के साथ प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त युग्मित चिप का प्रयोग करें।
  2. चिप उपयोग:
    1. एक नए चिप का उपयोग करते समय, म्यान से चिप बाहर ले दोहरा आसुत जल (DDW) के साथ धीरे कुल्ला, नाजुक wipers का उपयोग करते हुए सावधानी से शेष तरल पदार्थ बंद सूखी, और सोने की परत की सतह को छूने के लिए नहीं सुनिश्चित करें। (चिप ठीक से रखा जाता है जब प्रविष्टि चिकनी है) सही ओरिएंटेशन में वापस अपनी म्यान में चिप रखें।
    2. एक चिप पुन: उपयोग करते हैं, तो, बफर से संग्रहीत चिप बाहर ले जैसा कि ऊपर कहा धीरे DDW और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला, और इसकी मूल म्यान में रख दें।
      नोट: चिप पर गैर विशिष्ट कबाड़ सामग्री का संचय अपनी 'व्यवहार्यता' को प्रभावित कर सकते हैं। इस ligand के स्थिरीकरण और पोस्ट स्ट्रिपिंग करने से पहले रस की तुलना द्वारा नजर रखी जा सकती है। कई मापन किया जा सकता है, हालांकिएक ही NiNTA चिप का उपयोग किया जाता है, अपनी लंबी उम्र का मुद्दा एक 'स्पष्ट' नहीं है और अलग अलग चिप्स के बीच बहुत भिन्न होता है।
  3. चिप डॉकिंग: सेंसर चिप दरवाजा खुला है और अपनी म्यान में चिप जगह है। एक नए चिप का उपयोग करते समय, इनपुट चिप के सीरियल नंबर के उपयोग के रिकार्ड रखने के लिए। दरवाजा और प्रेस 'गोदी चिप' बंद करें।

3. तापमान जमाव

  1. 25 डिग्री सेल्सियस (या पसंदीदा प्रयोग तापमान) के लिए चिप सेल तापमान सेट करें।
  2. वैकल्पिक: प्रयोग भर में स्थिर प्रोटीन रखने के लिए सात डिग्री सेल्सियस के लिए नमूने डिब्बे निर्धारित किया है।

लोड हो रहा है और अलग करना के लिए 4. समाधान

एच 2 ओ में आरबी (आरबी में के रूप में एक अंतिम एकाग्रता EDTA समाधान करने के लिए डिटर्जेंट जोड़) में आरबी में 0.5 मिमी NICL 2, 350 मिमी EDTA, 0.25% एसडीएस, और एच में 100 मिमी एचसीएल: लोड हो रहा है और अलग करना के लिए निम्न समाधानों को तैयार 2 ओ सूक्ष्म अपकेंद्रित्र टब का उपयोग करते समयतों और न नामित ट्यूबों SPR, ट्यूब की टोपी नाश करने के लिए मत भूलना।

5. प्रधानमंत्री एसपीआर साधन आरबी साथ

6. एक नई दौड़ शुरू

  1. प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा कि प्रवाह की दर निर्धारित करें। यहाँ वर्णित परिणाम प्राप्त करने के लिए 50 μl / मिनट प्रवाह निर्धारित किया है।
    नोट: इस पैरामीटर प्रयोग के दौरान संशोधित किया जा सकता है।
  2. प्रवाह पथ और संदर्भ घटाव को परिभाषित करें। यहाँ वर्णित रास्तों एफसी = 1 और एफसी = 2, घटाव एफसी = 2-1 सेट के परिणाम प्राप्त करने के लिए।
    नोट: कार्यक्रम की वास्तविक समय में दो मापा कोशिकाओं के घटाव को प्रदर्शित करेगा। इस पैरामीटर प्रयोग के दौरान बदला नहीं जा सकता है कि मन में रखो।
  3. उपयुक्त नमूना रैक का चयन करें (यह नमूना मात्रा की खपत को प्रभावित कर सकते हैं)।
  4. परिणाम फ़ाइल सहेजें।

7. प्रयोग साइकिल

प्रत्येक प्रयोग चक्र से बना है, ईए में किया इंजेक्शन का स्पष्ट रिकार्ड रखनाचर्चा चक्र, और ligands 'लोड हो रहा है, बफर के खाली इंजेक्शन, और विभिन्न चक्रों में विश्लेष्य इंजेक्शन अलग।

  1. साइकिल 1: चिप तैयार करने और निकल लोड हो रहा है
    1. 6.1 और 6.2 कदम के अनुसार प्रवाह और रास्तों सेट कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
    2. 1 मिनट बचा दूर धोने के लिए के लिए 350 मिमी EDTA इंजेक्षन।
    3. 10 μl / मिनट के लिए सेट प्रवाह।
    4. 2 मिनट के लिए 0.5 मिमी NICL दो इंजेक्षन।
      नोट: अब चिप राल निकल आयनों द्वारा लेपित है।
  2. साइकिल 2: स्थिरीकरण ligands
    1. 15 μl / मिनट, प्रवाह पथ एफसी = 2 के लिए सेट प्रवाह।
    2. अपनी आणविक वजन का 10-20 गुना कर रहे हैं कि आरयू मूल्यों तक पहुँचने तक ligand के एक इंजेक्षन। उदाहरण के लिए, रस 500-1,000 50 केडीए के एक ligand लोड। हासिल आरयू मूल्य का एक रिकॉर्ड रखें।
    3. 15 μl / मिनट, प्रवाह पथ एफसी = 1 पर सेट प्रवाह।
    4. Ligand के ए की कि नियंत्रित करने में मदद करने के लिए ऑन लाइन घटाव sensogram (एफसी = 2-1) की निगरानी के रूप में एक ही आरयू मूल्य को ligand के बी (नियंत्रण) इंजेक्षनइंजेक्शन की लंबाई।
    5. 50 μl / मिनट, प्रवाह पथ एफसी = 1 और एफसी = 2 के लिए सेट प्रवाह, आधारभूत तक 5-20 मिनट के लिए प्रणाली धोने (एफसी = 2-1) स्थिर।
  3. चक्र 3: खाली इंजेक्शन। इस इंजेक्शन इसलिए विश्लेष्य खुद को छोड़कर, विश्लेष्य इंजेक्शन के साथ किया जाएगा कि सभी घटक शामिल हैं, रिक्त घटाव के लिए की सेवा करेंगे।
    नोट: इंजेक्शन लंबाई यह संतुलन (संकेत पठारों) तक पहुँचने के लिए लगने वाले समय के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    1. 15 μl / मिनट, प्रवाह पथ एफसी = 1 और एफसी = 2, एफसी = 2-1 घटाव करने के लिए सेट प्रवाह।
    2. 30 सेकंड के लिए ('प्रतीक्षा' के रूप में इसके बाद कहा गया है) 'प्रतीक्षा' कमांड डालें (एक स्थिर आधारभूत है करने के लिए)।
    3. 15 सेकंड आरबी इंजेक्षन।
      नोट: इंजेक्शन की अवधि के उनके पूर्व संतुलन गतिज स्थिरांक (ज्यादातर कश्मीर क) के आधार पर, विभिन्न प्रणालियों के बीच अलग अलग होंगे।
    4. हदबंदी चरण रिकॉर्ड करने के लिए 120-600 मिनट रुको।
      नोट: इस कदम की लंबाई के अनुसार बदलता रहता है डी: हदबंदी अब इस कदम की जरूरत है धीमी। बहुत धीमी गति से अलग कर परिसरों (कश्मीर डी <10 -4 सेकंड -1) के लिए, 10-15 मिनट प्रतीक्षा करें और फिर (जो बाद में देखें) उत्थान सतह के लिए आगे बढ़ें।
  4. साइकिल 4: analyte इंजेक्शन
    1. कॉपी / संदर्भ इंजेक्शन (चक्र 3) तो इन दो इंजेक्शनों बाद में घटाया जा सकता है में इस्तेमाल सटीक शर्तों पेस्ट करें। विश्लेष्य समाधान मानती है कि एक करने के लिए नियंत्रण समाधान पकड़े एक से रैक में स्लॉट के स्थान बदलें। उम्मीद है और कश्मीर डी से थोड़ा ऊपर है कि एक एकाग्रता चुनें। कोई पूर्व ज्ञान उपलब्ध है, तो एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के रूप में 1 माइक्रोन का चयन करें।
  5. साइकिल 5: बफर इंजेक्शन
    1. दोहराने चक्र 3।
  6. साइकिल 6: analyte इंजेक्शन
    1. दोहराने चक्र 4।
  7. साइकिल 7: चिप बंद पट्टी
    1. 50 μl / मिनट के लिए सेट प्रवाह। </ ली>
    2. एक मिनट के लिए 350 मिमी EDTA इंजेक्षन। इस कदम दो बार दोहराएँ। इस चिप को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में 3 मिनट की एक इंजेक्शन का प्रयोग न करें।
    3. एक मिनट के लिए 0.25% एसडीएस इंजेक्षन। इस कदम दो बार दोहराएँ। इस चिप को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में 3 मिनट की एक इंजेक्शन का प्रयोग न करें।
    4. आधारभूत स्तर पर पहुंच नहीं है, तो अतिरिक्त अलग करना कदम के रूप में 1 मिनट के लिए 100 मिमी एचसीएल इंजेक्षन।
    5. स्टैंडबाई मोड पर स्विच करता है 'अंत रन' कमांड डालें।
  8. चिप भंडारण
    1. सेंसर चिप अनडॉक और साधन से बाहर ले।
    2. अपने म्यान से संवेदक बाहर ले जाओ सतह को छूने से बचने के लिए, DDW से कुल्ला, और आरबी युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में जगह। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

8. डेटा विश्लेषण मूल्यांकन सॉफ्टवेयर मनोनीत का उपयोग

  1. गतिज मापदंडों की व्युत्पत्ति से पहले एसपीआर द्वारा प्राप्त कच्चे डेटा की प्रक्रिया के लिए निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    1. मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, खुलापरिणाम फ़ाइल का चयन करें, चक्र 3-6 एफसी = 2-1 (संदर्भ डेटा घटाया)।
    2. एक्सिस पारी:
      1. प्रदर्शन चक्र 3-6।
      2. जीरो सभी चार घटता के लिए आधारभूत (प्रत्येक चक्र में प्रारंभिक 30 सेकंड प्रतीक्षा समय) के वाई अक्ष मूल्य।
    3. चार घटता की एक्स अक्ष संरेखित करें। स्पष्ट सुविधाओं चुनें (जैसे, इंजेक्शन शुरू या खत्म के spikes) पूरी तरह से एक्स अक्ष के साथ चार घटता संरेखित करने के लिए। शून्य करने के लिए विश्लेष्य (या नियंत्रण बफर) की शुरुआत के समय निर्धारित करें।
  2. संदर्भ घटाव
    1. का प्रयोग करें वाई अक्ष में पाया जा सकता है कि वक्र घटाव आपरेशन मेनू परिवर्तन चक्र 6. की वक्र से चक्र चार और चक्र 5 की वक्र की वक्र से चक्र 3 की वक्र को घटाकर की पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया घटाना।
      नोट: यह है कि यह सतह अपवर्तनांक प्रभावित हो सकता है कि (विश्लेष्य के लिए असंबंधित) किसी भी अविशिष्ट घटकों annuls के रूप में इस कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
      1. टी में घटाया घटता सहेजेंवह एक अलग नाम के तहत परियोजना की चादर।
    2. "दोगुना घटाया घटता" के रूप में इन घटता करने के लिए देखें: पहली घटाव दोनों इंजेक्शन पर प्रदर्शन 2-1 घटाव है, और दूसरा एक से एक वक्र का घटाव है।
      नोट: इस तरह के दोहरे संदर्भित एसपीआर प्रयोगों में स्वर्ण मानक है।
    3. पहले के रूप में समझाया अक्ष पारी के प्रदर्शन से घटाया घटता ओवरले।
  3. कैनेटीक्स स्थिरांक और मॉडल फिटिंग का निर्धारण
    1. एक काइनेटिक प्रयोग का आयोजन
      1. गतिज स्थिरांक निर्धारण के लिए डेटा की एक विश्वसनीय है करने के लिए 6-7 विश्लेष्य सांद्रता की एक श्रृंखला इंजेक्षन। से विश्लेष्य सांद्रता चुनें 2-3 गुना dilutions में, अनुमान के अनुसार कश्मीर डी नीचे 10 गुना करने के लिए ऊपर 10 गुना। बाद में (ऊपर देखें) डबल संदर्भ घटाव के लिए इस्तेमाल किया "शून्य" एकाग्रता, शामिल हैं। Triplicates में और यादृच्छिक क्रम में इंजेक्शन के आचरण।
      2. संरेखितऔर मॉडल फिटिंग प्रयास करने से पहले वाई अक्ष और एक्स अक्ष के संबंध में सभी घटता घटाना।
    2. मॉडल फिटिंग
      1. एक उपयुक्त विश्लेषण प्रोग्राम का चयन करें।
        नोट: सबसे उपलब्ध ढाले कार्यक्रमों फिटिंग और गतिज स्थिरांक के निर्धारण के लिए लागू किया जा सकता है कि कई मॉडल पेश करते हैं।
      2. विश्लेष्य और फिटिंग के लिए ligand के बीच एक बातचीत: एक प्रतिवर्ती एक मानते हुए सरल मॉडल (Langmuir) लागू करें। डेटा को समझाने के लिए एक अधिक जटिल बातचीत के अस्तित्व के लिए अन्य प्रयोगात्मक विधियों से उपलब्ध है, जब तक कि हमेशा सरल Langmuir मॉडल का उपयोग करें।

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Representative Results

इस के साथ साथ वर्णित प्रणाली में, एक NiNTA चिप उनकी टैग झिल्ली ट्रांसपोर्टर 6,7 स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक होमो-डिमर होने के नाते, प्रत्येक ट्रांसपोर्टर दोगुना अपने NiNTA चिप के लिए बाध्य में सुधार, टैग है। निकल लोड हो रहा है, ligand के ए (ब्याज की ट्रांसपोर्टर) के बाद आरयू 3500 ~ अप करने के लिए, एफसी = 2 पर स्थिर है (प्रोटोकॉल चक्र 2, 2A चित्रा ब्लैक लेबल)। फिर, एक ही प्रवाह और इंजेक्शन अवधि, ligand के बी (नियंत्रण ligand) का उपयोग शुरू में ही एक ~ 3000 आरयू तक पहुँचने, एफसी = 1 पर इंजेक्ट किया जाता है। इसी तरह के प्रोटीन की मात्रा दोनों प्रवाह कोशिकाओं पर स्थिर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए; ligand के बी आगे ध्यान से 3,500 रस करने के लिए लोड हो रहा है जबकि निगरानी, ​​छोटे इंजेक्शन का उपयोग, भरी हुई है। 'सीढ़ियों' आकार प्रत्येक इंजेक्शन (2A चित्रा ग्रे लेबल) पर एफसी = 1 पर जन में क्रमिक वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है। एफसी के एक ऑन लाइन निगरानी = 2-1 बराबर ligand लोड हो रहा है को नियंत्रित करने में मदद करता है। चित्रा 2B एफसी = 2 दर्शाताएक घटाव, यानी, एफसी = 1 में आरयू मूल्य में कदम-वार वेतन वृद्धि से एफसी = 2 में अधिकतम आरयू मूल्य, घटाकर। यह जांच और नियंत्रण ligands के बराबर लोड हो रहा है प्राप्त करने के लिए ligands के 'इंजेक्शन की अवधि भिन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। विश्लेष्य इंजेक्शन लगाने जब ​​इसके विपरीत, इंजेक्शन की अवधि प्रयुक्त सभी सांद्रता के लिए स्थिर रखा जाना चाहिए। चित्रा 3 ए और 3 बी एक 'खाली विश्लेष्य' इंजेक्शन लगाने के द्वारा मापा प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन (यानी, आरबी केवल विश्लेष्य omitting) चक्र 3 में और 5, और विश्लेष्य इंजेक्शन (चक्र में 4 और 6)। दोनों sensograms एफसी = 2-1 घटाव का प्रतिनिधित्व करते हैं कि ध्यान दें। चक्र (6/3) (रिक्त या एक दिया एकाग्रता) एक समान विश्लेष्य इंजेक्शन से प्रत्येक में, दो प्रवाह कोशिकाओं पर लागू किया जाता है विभिन्न ligands के साथ स्थिर। दो दोहराता एसपीआर की उच्च reproducibility का प्रदर्शन बहुत अच्छी तरह से मिलाना। एक प्रतिक्रिया दोनों ही मामलों में दर्ज की गई है; ~ 3 बनाम रिक्त लिए आरयू ~ 4विश्लेष्य के लिए 0 आरयू। ये मान ~ 13 के शोर अनुपात करने के लिए एक संकेत का प्रतिनिधित्व करते हैं। केवल विशिष्ट बंधनकारी प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व डबल संदर्भित sensograms प्राप्त करने के लिए, खाली इंजेक्शन अब विश्लेष्य इंजेक्शन (~ 37 आरयू, चित्रा -3 सी) से घटाया जाता है। दर्ज sensogram एक क्षणिक बातचीत की विशेषता पैटर्न का पता चलता है। इंजेक्शन पर, संघ चरण ~ 7 सेकंड के बाद स्थिर अवस्था तक पहुँचने के लिए ligand बाध्य analyte की राशि में तेजी से वृद्धि की विशेषता है। स्थिर राज्य के रूप में लंबे समय विश्लेष्य इंजेक्ट किया जाता है के रूप में के लिए बनाए रखा है। इंजेक्शन समाप्त हो जाता है, जब कोशिकाओं आरबी हदबंदी चरण ट्रिगर से धोया जाता है। जटिल तेजी से विघटित, और विश्लेष्य के रूप में दूर लिगेंड से आधारभूत एसपीआर संकेत रिटर्न धोया जाता है।

मात्रात्मक डेटा (पूर्व संतुलन और संतुलन स्थिरांक) हासिल करने के लिए, विश्लेष्य सांद्रता की एक सीमा डुप्लिकेट या triplicates (प्रोटोकॉल में 8.3.1 देखें) में इंजेक्ट किया जाता है। चित्रा 4 में दिखाया गया ModBC-ए बातचीत के लिए गणना संतुलन हदबंदी लगातार (कश्मीर डी) है ~ 3 एक्स 10 -6 एम, एक मध्यम तेज (एक (~ 10 4 एम -1 सेकंड -1) और तेजी से कश्मीर घ कश्मीर के साथ ~ 0.1 सेकंड -1)।

चित्रा 1
एक नी NTA सेंसर चिप का उपयोग कर एक एसपीआर प्रयोग के चरणों की आकृति 1. चित्रण। (ए (बी - डी) एक एसपीआर प्रयोग के दौरान दर्ज की गई है एफसी = 2-1 sensogram का चित्रण। उसकी टैग ligand के रूप में चक्र 2 में नी का आरोप लगाया सतह पर इंजेक्ट किया जाता है, बड़े पैमाने पर धीरे-धीरे जम जाता है। (Ligand के मेगावाट के आधार पर) 1,000-5,000 आरयू के बीच लेकर एक अंतिम आरयू मूल्य तक पहुंच गया जब इंजेक्शन समाप्त होता है। एक आधारभूत चिप के लिए ligand के स्थिर बंधन को दर्शाती है, का गठन किया है। चक्र 3 में, एक खाली इंजेक्शन केवल विश्लेष्य छोड़कर विश्लेष्य नमूना के घटकों को इंजेक्शन लगाने, preformed है। इस इंजेक्शन में अक्सर एक कम प्रतिक्रिया (1-5 रस) दर्ज की गई है। चक्र 4 में विश्लेष्य खाली इंजेक्शन के रूप में ही शासन का उपयोग कर इंजेक्ट किया जाता है। बढ़ रही रस सतह, यानी, ligand के लिए विश्लेष्य के बंधन पर बड़े पैमाने पर परिवर्तन को प्रतिबिंबित। संकेत तेजी वें के रूप में तो पठारों बढ़ जाती है औरई प्रणाली संतुलन तक पहुँचता है। इंजेक्शन समाप्त होता है, विश्लेष्य संकेत में कमी के परिणामस्वरूप, ligand से विघटित और आधारभूत स्तर पर लौटने के लिए।

चित्रा 2
Ligand के लोडिंग की लाइन निगरानी पर चित्रा 2। (ए) ligand के लोडिंग के Unsubtracted घटता। ब्याज (ligand के 'ए') की ligand के वांछित आरयू स्तर (~ इस उदाहरण में 3500 आरयू) तक पहुँचने तक सेल 2 (एफसी = 2, काला) प्रवाह करने के लिए भरी हुई है। फिर, नकारात्मक नियंत्रण लिगेंड (ligand के "बी") चरण के लिहाज से भरी हुई एक समान आरयू स्तर तक प्रवाह सेल 1 (एफसी = 1, ग्रे) पर पहुंच गया है। एक एफसी = 2-1 घटाव के रूप में वास्तविक समय में निगरानी (बी) (ए) में प्रदर्शन के दो इंजेक्शन। इस निगरानी ब्याज और नियंत्रण के ligands के समान लोड हो रहा है की सुविधा।

"चित्रा 2-1 घटाव की चित्रा 3. डबल संदर्भित। (ए) डुप्लिकेट (यानी, एफसी = 2-1) खाली इंजेक्शन की। (ए) के रूप में (बी), केवल विश्लेष्य इंजेक्ट किया जाता है। (सी) (बी) में मापा प्रतिक्रिया से (ए) में दिखाया गया है पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया के घटाव के बाद अंतिम sensograms। इन घटता 'डबल खाली "या' डबल संदर्भित" के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। डुप्लिकेट अनुक्रमिक चक्र के हैं।

चित्रा 4
। एक Langmuir बातचीत मॉडल: चित्रा (डुप्लिकेट में) एकाधिक विश्लेष्य सांद्रता के इंजेक्शन से गतिज दर स्थिरांक 4. निर्धारण काली लाइनें एक सरल एक का उपयोग कर की गणना की गई है कि फिट बैठता है।

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Discussion

एसपीआर आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक बेहद संवेदनशील तरीका है, और क्षणिक (अभी तक) महत्वपूर्ण बातचीत की वास्तविक समय की निगरानी प्रदान करता है कि केवल दृष्टिकोण अक्सर है। एक उदाहरण किसी अन्य विधि (पुल से नीचे assays के, liposomes अवसादन assays के 6) से नहीं पाया जा सकता है कि यहां प्रस्तुत क्षणिक बातचीत है। अन्य तरीकों (मात्रात्मक या गुणात्मक चाहे) माप संतुलन करने के लिए सीमित कर रहे हैं, जबकि इसके अलावा, एसपीआर भी पूर्व संतुलन कैनेटीक्स उपाय है कि केवल तकनीकों में से एक है।

इसकी बढ़ संवेदनशीलता भी अपनी चेतावनी है। झूठी सकारात्मक sensograms आसानी से दर्ज हैं। इसलिए यह एसपीआर माप प्रयास करने से पहले अन्य तरीकों का उपयोग कर बातचीत के अस्तित्व को स्थापित करने के लिए सिफारिश की है। (क्षणिक बातचीत बनाम स्थिर कश्मीर डी के किसी न किसी आकलन,) प्रणाली की विशेषताओं के पूर्व ज्ञान एसपीआर experime स्थापित करने में बहुत मददगार हैएनटीएस और प्राप्त माप के कार्यात्मक प्रासंगिकता का मूल्यांकन। एसपीआर मापन शुरू करने प्रोटीन के नमूने की गुणवत्ता है से पहले एक महत्वपूर्ण मुद्दा मन में रखने के लिए। एसपीआर समुच्चय के लिए बेहद संवेदनशील है और इन ligand और (जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी या ultracentrifugation संभव है जब से) विश्लेष्य तैयारी दोनों से हटा दिया जाना चाहिए। शोर और झूठी संकेतों का एक अन्य स्रोत आरबी और विश्लेष्य के बफर के बीच बफर बेमेल से स्टेम सकता है। यह, आरबी के खिलाफ विश्लेष्य dialyzing द्वारा या आरबी में कई परतों पतला है जो विश्लेष्य (~ 100-1,000 गुना) के एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित तैयारी का उपयोग करके हल किया जा सकता है। झूठी सकारात्मक आंकड़े यह भी है चिप मैट्रिक्स के साथ या नकारात्मक नियंत्रण के साथ analyte की गैर विशिष्ट बातचीत से परिणाम कर सकते हैं। इन मुलाकातों तो कभी कभी कम विश्लेष्य सांद्रता का उपयोग करके बचा जा सकता है, कम आत्मीयता के हैं। इसके अलावा, कम बीएसए और / या डिटर्जेंट सांद्रता (0.1 मिलीग्राम / एमएल और / या 0.05 का समावेश) क्रमश: (w / v) आरबी करने और इंजेक्शन विश्लेष्य नमूना -0.1% अविशिष्ट बातचीत में कमी कर सकते हैं। नकारात्मक नियंत्रण सेल (विभिन्न नकारात्मक नियंत्रण) में सामग्री को बदलने अविशिष्ट बंधन मुद्दों से निपटने के लिए एक और तरीका है। वैकल्पिक रूप से, चिप की एक अन्य प्रकार का उपयोग कर भी डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। संवेदक चिप्स के विभिन्न प्रकार के विभिन्न chemistries के आधार पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेंसर चिप (मुख्यमंत्री -5 चिप) carboxymethylated dextran में covalently एक सोने की सतह से जुड़ी है। प्रोटीन covalently बहुत सरल सतह chemistries की एक किस्म (सबसे अधिक amine या thiol युग्मन) का उपयोग संवेदक सतह के लिए युग्मित किया जा सकता है। झिल्ली प्रोटीन सहसंयोजक स्थिरीकरण के साथ काम हालांकि, जब हमारे हाथ में, अक्सर कलाकृतियों पैदावार और इस तरह पसंद की विधि नहीं है। एक झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन कर के संदर्भ में, यह lipophilic अणुओं के साथ लेपित हैं कि वाणिज्यिक चिप्स है कि वहाँ उल्लेखनीय है। ये immob सक्षमएक देशी की तरह पर्यावरण पर झिल्ली प्रोटीन के ilization। इसी प्रकार के सेंसर चिप्स भी 'घर में' तैयार किया जा सकता है। अन्य युग्मन के तरीकों की एक विवरण के लिए 10,11 देखते हैं। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल एक उनकी टैग किया, डिटर्जेंट solubilized ट्रांसपोर्टर के स्थिरीकरण के लिए नी NTA चिप के उपयोग पर आधारित है (विश्लेष्य चिप सतह के लिए बाध्य विश्लेष्य से बचने के लिए उनकी टैग नहीं है)। हमारे अनुभव 6,12 में, नी NTA चिप्स के साथ किए गए प्रयोगों से प्राप्त होता गतिज स्थिरांक देशी-तरह के वातावरण में निर्धारित उन लोगों के साथ अच्छा समझौते में हैं। नी NTA चिप्स अपेक्षाकृत महंगे हैं, उनके प्राथमिक लाभ वे ligand की छीन लिया और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। माप के सैकड़ों चिप प्रति किया जा सकता है। इसके अलावा, चिप पर ligand के उन्मुखीकरण अपने-टैग की स्थिति से निर्धारित होता है और इस तरह काफी सजातीय है।

एक बातचीत सफलतापूर्वक एसपीआर, नियंत्रण और repe की एक श्रृंखला के द्वारा दर्ज किया गया है एक बारएटीएस एसपीआर संकेत की वैधता सत्यापित करने के लिए आवश्यक हैं। निम्नलिखित मानकों के सत्यापन एसआरपी डेटा को मान्य करने के लिए सहायता कर सकते हैं:

एसपीआर संकेत 1. विशिष्टता: एसपीआर की उच्च संवेदनशीलता की वजह से, उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के उपयोग के लिए विशेष महत्व का है। एसआरपी द्वारा दर्ज की गैर विशिष्ट बातचीत मैट्रिक्स के लिए एक analyte की सोखना के कारण हो सकता है। प्रोटीन (ligand के) के साथ भरी हुई एक प्रवाह सेल रासायनिक एक खाली प्रवाह सेल के बराबर नहीं है क्योंकि इसलिए, एक खाली प्रवाह सेल अक्सर सबसे अच्छा विकल्प नहीं है। एक बेहतर विकल्प ligand के एक निष्क्रिय उत्परिवर्ती संस्करण, विश्लेष्य बाध्य करने के लिए नहीं जाना जाता है कि एक का उपयोग करने के लिए है। वैकल्पिक रूप से, एक एक इसी तरह उत्परिवर्तित विश्लेष्य उपयोग कर सकते हैं। ऐसे म्यूटेंट उपलब्ध नहीं हैं, तो एक मुताबिक़ प्रोटीन (लेकिन अलग बंधन विशिष्टता के) 12 का इस्तेमाल किया जा सकता है। अच्छा नकारात्मक नियंत्रण के उदाहरण (यहाँ वर्णित के रूप में) एक मुताबिक़ ligand के हैं, या करने के लिए जाना जाता है कि बातचीत के भागीदारों में से एक में एक बिंदु उत्परिवर्तनएसोसिएशन को समाप्त। एक और नकारात्मक नियंत्रण बातचीत के लिए आवश्यक है कि एक बाद translational संशोधन (जैसे, फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, thiol व्युत्पत्ति) का परिवर्तन है की सिफारिश की। उदाहरण के लिए, SH2 डोमेन बातचीत के लिए आवश्यक है कि एक टाइरोसीन की डे-फास्फारिलीकरण। अन्य नकारात्मक नियंत्रण प्रणाली विशिष्ट हो सकता है। एसपीआर का उपयोग करते समय, सख्त नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर के महत्व को अतिरंजित नहीं किया जा सकता है।

एसपीआर संकेत 2. Reproducibility: एसपीआर एक बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है। बराबर लिगेंड मात्रा biosensor चिप पर लोड कर रहे हैं और विश्लेष्य के बराबर सांद्रता दोहराता पूरी तरह से तालमेल होना चाहिए इंजेक्ट कर रहे हैं जब (चित्रा 3 देखें)।

प्रणाली 3. पुनर्जनन: ला के कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता बनाए रखने, जबकि एक धीमी हदबंदी दर (कश्मीर घ) के साथ बातचीत में, विश्लेष्य लिगेंड से छीन लिया जाना चाहिएtter है। हदबंदी और / या उत्थान अधूरे हैं, तो एसपीआर संकेत धीरे-धीरे विश्लेष्य के बाद इंजेक्शन पर क्षय होगा। परीक्षण किया जा सकता है कि ठेठ Regenerating शर्तों मिलीग्राम की उच्च सांद्रता 2 + (2 मीटर तक), अम्लीय या बुनियादी शर्तों (जैसे, 10 मिमी ग्लाइसिन पीएच 2.5, 10 मिमी NaOH के), उच्च नमक (4 एम NaCl के लिए), या कर रहे हैं उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता (जैसे, 1% DDM)। हालांकि, इन अभिकर्मकों और (अन्य) की regenerating प्रभावशीलता अत्यधिक सिस्टम विशिष्ट और इस तरह regenerations शर्तों परीक्षण किया जाना चाहिए है। कुछ मामलों में, बातचीत के उत्थान ई के मामले में के रूप में, कभी नहीं पूरा हो गया है, इसलिए है कि स्थिर और मजबूत है कोलाई विटामिन बी 12 परिवहन प्रणाली (BtuCD-एफ) 7। ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, एकमात्र विकल्प biosensor चिप से ligand के पट्टी और प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एक ताजा बैच को फिर से लोड करने के लिए है। Ligand से analyte की हदबंदी मामलों में जहां तेजी से और पूरी सतह उत्थान अनावश्यक है(प्रोटोकॉल देख सकते हैं और 2-3 आंकड़े)।

4. झिल्ली प्रोटीन हमेशा एसपीआर संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया दरों को प्रभावित कर सकते हैं, जो डिटर्जेंट की मौजूदगी में शुद्ध कर रहे हैं। हालांकि, BtuCD के साथ हमारे अनुभव में, मापा दरों में बहुत समान हैं। एक हमेशा इस तरह के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के रूप में मानार्थ दृष्टिकोण (एसईसी) का उपयोग कर समर्थन सबूत प्राप्त करने की जरूरत है, एसपीआर और अन्य तकनीकों के बीच एक संबंध है methionine के लिए दिखाया गया है उदाहरण के लिए पुल से नीचे assays के, Liposome अवसादन परख, आदि, विटामिन बी 12, और दो ​​molybdate सिस्टम 6,12।

गतिज दर स्थिरांक के गलत दृढ़ संकल्प अक्सर फिटिंग प्रक्रिया के दौरान पैदा होती है। विश्लेषण गतिज प्रयोगों के लिए एक बातचीत मॉडल: अंगूठे का एक नियम के रूप में, हमेशा सरल Langmuir एक लागू होते हैं। अधिक जटिल मॉडल गठनात्मक परिवर्तन, बीवालेन्त विश्लेष्य, या नमूना विविधता के अतिरिक्त मान्यताओं बनाते हैं। इन मान्यताओं होना चाहिएअन्य प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से सबूत द्वारा समर्थित अगर केवल बनाया है। इन मॉडलों को लागू करने से बेहतर फिटिंग और कम ची 2 मूल्यों में सबसे अधिक संभावना परिणाम है, लेकिन यह उनकी विश्वसनीयता के लिए एक गवाही के रूप में नहीं देखा जाना चाहिए होगा कि ध्यान दें। अधिक जटिल मॉडल द्वारा afforded स्वतंत्रता के उच्च डिग्री बल्कि उनके यंत्रवत प्रासंगिकता, की तुलना में आम तौर पर बेहतर फिटिंग के लिए जिम्मेदार हैं।

एसपीआर के फायदों में से एक विशेष रूप से solubilize और झिल्ली प्रोटीन शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है कि डिटर्जेंट के लिए सम्मान के साथ, इसकी व्यापक रासायनिक संगतता है। हालांकि, कई बार झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि की प्रक्रिया के दौरान जोड़ रहे हैं कि sucrose और ग्लिसरॉल (और अन्य चिपचिपा समाधान) आरयू पर नाटकीय प्रभाव है। यह इसलिए संभव हो तो इन से बचने के लिए, या कम से कम उनकी एकाग्रता कम करने के लिए सिफारिश की है। चिपचिपा समाधान का उपयोग करते हैं, बफर बेमेल से बचने के लिए आवश्यक हो जाता है। आरबी युक्त एक साबुन के लिए लिपिड जोड़ना बाध्यकारी साइन बढ़ाना कर सकते हैंके रूप में ज्यादा के रूप में दस गुना से अल। हालांकि, इस तरह के एक प्रयास (सबसे लिपिड के लिए) महंगा है और biosensor चिप्स की जीवन अवधि को छोटा करने के लिए जाता है।

एक नई प्रणाली के औजार, जबकि ऊपर सूचीबद्ध सुझावों और समस्या निवारण हो सकता है। हालांकि, किसी प्रणाली अक्सर इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए (जैसे, साबुन, नमक, पीएच की पसंद) विशिष्ट tweaking की आवश्यकता है।

एसपीआर लंबे आणविक बातचीत को मापने के लिए एक शक्तिशाली और अद्वितीय दृष्टिकोण के रूप में पहचाना गया है। हाल के वर्षों में विभिन्न एसपीआर प्लेटफार्मों और उनकी कीमतों में गिरावट की उपलब्धता एसपीआर अधिक approachable बना दिया है। यह तेजी से, और सीसा छोटे अणु अवरोधकों की खोज में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, लक्ष्य प्रोटीन-दवा बातचीत का अध्ययन करने के लिए सोने के मानक दृष्टिकोण होता जा रहा है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01
Sensor Chip NTA  GE Healthcare 14100532
BIAevaluation GE Healthcare
Biacore T200 Software  GE Healthcare
Nickel chloride Sigma N6136
Sodium tungstate dihydrate Sigma T2629
Sodium Chloride  Bio-Lab LTD. 19030591
Trizma base Sigma T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) Affymetrix D310
Sodium dodecyl sulfate solution  Sigma 05030
Kimwipes KIMTECH Kimberly-Clark 34120
Hydrochloric acid GADOT 7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter Sartorius 25007--47------N
ModBC ABC transporter Lewinson lab
RbsBC ABC transporter Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein Lewinson lab

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References

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स्ट्रक्चरल बायोलॉजी अंक 93 एबीसी ट्रांसपोर्टर सब्सट्रेट बाध्यकारी प्रोटीन जैव आणविक बातचीत कैनेटीक्स लेबल से मुक्त प्रोटीन प्रोटीन बातचीत सतह plasmon अनुनाद Biacore (एसपीआर),
झिल्ली प्रोटीन की वास्तविक समय की माप: रिसेप्टर सहभागिता सतह plasmon अनुनाद का प्रयोग (एसपीआर)
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Livnat Levanon, N., Vigonsky, E.,… More

Livnat Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR). J. Vis. Exp. (93), e51937, doi:10.3791/51937 (2014).

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