Summary
Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (ÜFE); oluşumu ve protein kompleksleri ayrışma, birçok biyolojik süreçler (örneğin, replikasyon, transkripsiyon, çeviri, sinyal, hücre-hücre iletişim) anahtar olaylardır. ÜFE Yarı kantitatif çalışmalar genellikle çekme-aşağı veya immün-yağış deneyleri kullanılarak yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu (ve benzeri) teknikleri nedeniyle bu tür teknikler doğasında olan yıkama adımları için ölçülebilir afinite aralığında (düşük mikromolar ve daha yüksek afinite) sınırlıdır. Bu tür "son nokta" teknikleri genellikle büyük biyolojik sonuçları vardır geçici veya düşük afinite etkileşimleri tespit edemez. Buna ek olarak, bu yaklaşımların zamansal çözünürlüğü derece, reaksiyon oranlarının daha yavaş büyüklük genellikle sipariş sınırlıdır. SPR nedeniyle artan hassasiyet ve üst temporal çözünürlük 1,2 bu eksikliklerin üstesinden gelir. SPR gibi ve bir etiket içermeyen bir yöntemdir(kütle değişiklikleri tespit edilebilir olduğu sürece) moleküler etkileşim ölçülebilir. PPI ek olarak, geniş bir protein-ligand ve protein-ilaç (veya küçük molekülü) ve protein-DNA ve protein-RNA etkileşimi 3-5 karakterize etmek için kullanılmaktadır. Sonuçlar kaydedildi ve deneysel koşullar ve esnek deneysel tasarım hızlı değiştirilmesini sağlar gerçek zamanlı, çizilir.
SPR temelli araçların arkasında fiziksel prensibi kütle 2 değiştirir üzerine sensör yüzeyinde kırılma endeksi bir değişiklik ölçen bir optik sistemin kullanılmasıdır. Etkileşim ortakları (bundan sonra ligand) biri polimer matris çip ve ikinci molekülün (bundan sonra analit) yüzey üzerinde aktı üzerine immobilize edilir. Analit, liganda çip yüzeyi üzerinde kitle değiştirir. Bu kütle değişim, doğrudan ve oransal yüzeyin kırılma indeksi değişikliklerle ilgilidir. Sonuçlar, gerçek zamanlı olarak çizilir vezamanın bir fonksiyonu olarak cevap birimleri (RU) olarak sunulmuştur. Böyle bir komplo, bir sensogram olarak adlandırılır (örneğin, Şekil 1). SPR etkileşimi tamamen zaman sürecini takip ettiğinden ön denge kinetik hız sabitleri afinitelere denge ek olarak elde edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak, belirli bir sistemin ön denge davranışı çok bilgi tutar ve yalnız denge çok farklı bir bakış açısı sağlar. Sistem kalibre sonra, deneyler çok hızlı ve (tutarlar nanogram için mikrogram) protein malzemesinin sadece küçük miktarlarda gerektirir. Verilen bir sistemin kinetik bilgi toplanması gün içinde elde edilebilir. SPR yüksek hassasiyet başka bir teknik kullanılarak 6 mümkün değildir ölçümleri tanıyor. Ancak, bu yüksek hassasiyet yanlış pozitif veriler için önemli bir kaynak olabilir çünkü bir 'iki ucu keskin bir kılıç "dir. Yansıtıcı endeksi etkileyen herhangi bir faktör kaydedildi ve sensogram üzerine çizilir. Örneğin, ap Adıpropriate kontrolleri yanlış pozitif ortadan kaldırmak için kullanılması gerekir, ve tamamlayıcı yaklaşımlar destek son derece tavsiye edilir.
Şekil 1, bir NTA-kaplı sensör çipi kullanan bir SPR deney ilerlemesini göstermektedir. Panel A sensogram NTA matris üzerinden nikel iyonlarının (çıkartılmamış veri) enjeksiyonu gösterir ve paneller BD negatif kontrol hücresinden elde edilen sinyal çıkarıldıktan sonra verileri görüntüler. Kırmızı ve mavi oklar sırasıyla, enjeksiyon başlangıç ve bitiş göstermektedir. Enjeksiyon sona kadar çip üzerine ligand İmmobilizasyonu yavaş yavaş kitle değiştirir. ligandın enjeksiyon sona ermesinden sonra gözlenen istikrarlı plato yüzeyi (Şekil 1B, çevrim 2) ligand istikrarlı bir ilişki yansıtır. Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra bir tampon ligand ve .Bu enjeksiyon bir 'boş kontrolü "olarak hizmet vermektedir referans hücresi (döngüsü 3 Şekil 1B) üzerine enjekte edilir, ve olacaktırAnaliz sırasında çıkarılır. Enjeksiyon üzerine, küçük değişiklikler çip sayesinde kitle akışını yansıtan, kaydedilir. Daha sonra, ayrı bir döngü (Şekil 1B, program 4) içinde, analit, enjekte edilir; RU kademeli artış bağına Analitin dernek temsil eder. dengeye ulaşana kadar, bağlanma yerleri yavaş yavaş işgal hale gelir. En kısa sürede enjeksiyon biter gibi, RUs bir düşüş Kompleksin ayrışma yansıtır. Ön denge ve denge hız sabitleri elde edilebilir tür öz sensogramlar itibaren. (Daha sonra bakın) 1 ligand ve analit arasındaki geçici etkileşim tasvir Şekil. Etkileşim daha stabil olduğunda, RU düzeyinde düşüş daha düşük bir k d yansıtan, yavaştır.
Bu yazıda, aynı kökten gelen substrat proteini 6,7 bağlayıcı bir membran taşıyıcısı (deterjan çözülebilir) ve fonksiyonel ortağı arasındaki etkileşimi karakterize amaçlayan bir SPR deney tarif. seçilen model sistem, bir ATP bağlama kaseti (ABC), taşıyıcı, Archeaglobus fulgidus arasında ModBC-A'dır. Bu sistem oranları 'on / off', onun yüksek tekrarlanabilir sonuçlar için gürültü oranı yüksek sinyal seçilir ve klasik oldu. Ayrıca, homologları ABC taşıyıcıları olarak önemli negatif kontroller hizmet etmek vardır. taşıyıcı, ModBC (ligant A) deterjan saflaştırılmış ve çip üzerinde hareketsiz kılınmış kullanılarak membran elde edilir. Onun çözünebilir etkileşim ortağı, Moda, analit olduğunu. Negatif kontrol ligand olarak, farklı bir ABC transportör RbsBC ("bağ B") kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein Numune Hazırlama ve Tampon
- Numune hazırlama: ilgi konusu proteinleri saflaştırmak ve bir jel filtrasyon kolonu üzerine ya da ultra-santrifüj ile deney öncesinde proteini enjekte edilerek, tüm gruplar kaldırılır emin olun (100,000 x g yeterlidir genellikle 10 dak).
NOT: arzu edilen, yüksek ölçüde saf protein preparatları bir zorunluluk olmamakla birlikte,. SPR başarıyla az-daha-mükemmel arındırmalardan ve hatta toplam özü 8,9 ile kullanılmıştır. - Tampon hazırlama:
- ("Tampon çalışan" olarak adlandırılan, veya RB) deney tampon hazırlayın. Protokol, burada açıklandığı için, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl ve% 0.05 (ağırlık / hacim) DDM (n-Dodesil β-D-maltozit) kullanın. Tampon bileşiminin seçimi kolayca çalışılan sisteme göre modifiye edilebilir unutmayın.
- 0.22 mikron filtreleri kullanarak tüm tamponları ve protein örnekleri Filtre. Filtreler protein olduğundan önceden emin olunUyumlu. Genel olarak, son zamanlarda pazara SPR platformlar bir in-line de-gasser ihtiva eder; Bu durumda, de-gaz değilse önce tamponlar kullanın.
- Gecede Dialyze veya tampon uyuşmazlıklarını önlemek için RB karşı örnekleri sulandırmak. Yüksek viskozite kimyasal kullanıldığında Diyaliz (ya da tampon alışverişi başka bir yöntemle), özellikle tavsiye edilmektedir (örneğin, sükroz, gliserol, DMSO). Pompa girişine RB şişe bağlamadan önce ayrı bir tüp içinde bir kenara RB 10 ml tutmak.
- 20 ug / ml olan bir son konsantrasyona kadar RB içine konsantre bağ stokunu. Yüksek konsantrasyonlarda, yüksek akış ve kısa enjeksiyon aksine kural olarak, istikrarlı ligand Hareketsizleştirmesi için, düşük debide daha uzun enjeksiyonları ile düşük ligand konsantrasyonları kullanın.
- Istenen konsantrasyona RB içine analit sulandırmak. Tipik haliyle, on misli seyreltmeler 10 nM ile 10 uM bilinmeyen afinite bir sistem için konsantrasyonlarının aralığı test edin. Her zaman başlayacakbirinci alt konsantrasyonlar mevcut olabilir.
2. Sensör Çip
- Çip seçme a nitrilotriasetik asit (NTA), bir oligo-histidin etiketi olan proteinleri tutulması için müsait bağlanmış çip kullanın.
- Çip kullanımı:
- Yeni bir çip kullanırken, kılıfından çipi çıkarmak çift distile su (DDW) ile hafifçe yıkayın, hassas silecekler kullanılarak dikkatlice kalan sıvıları kapalı kuru ve altın tabakası yüzeyine dokunmamaya dikkat edin. (Çip düzgün yerleştirildiğinde ekleme pürüzsüz) doğru yönde geri kılıf içine çip yerleştirin.
- Bir çip yeniden yaparken, tampon saklanan çip almak, yukarıda belirtildiği gibi yavaşça DDW ve kuru ile iyice durulayın ve orijinal kılıf içine yerleştirin.
NOT: çip üzerinde spesifik olmayan önemsiz malzeme birikimi onun 'canlılığı' etkileyebilir. Bu ligand hareketsizleştirme ve sonrası sıyırma önce RUs karşılaştırarak izlenebilir. Birçok ölçümler olabilir rağmenAynı Ninta çip kullanılarak yapılır, onun uzun ömürlü sorunu 'kesin' değildir ve farklı yongaları arasında büyük ölçüde değişir.
- Çip yerleştirme: sensör çipi kapağını açın ve kılıf içinde çip yerleştirmek. Yeni bir çip kullanırken, giriş çipin seri numarası kullanım kaydını tutmak için. Kapı ve basın 'dok çip' kapatın.
3. Sıcaklık Ayarları
- 25 ° C (ya da tercih deney sıcaklığı) çip hücre sıcaklığını ayarlayın.
- İsteğe bağlı: deney boyunca sabit proteinleri tutmak için 7 ° C örnekleri bölme ayarlayın.
Yükleme ve Sıyırma 4. Çözümler
H2O RB (RB gibi nihai bir konsantrasyona kadar EDTA çözeltisi deterjan ekleme) RB 0.5 mM NiCl2, 350 mM EDTA,% 0.25 SDS ve H 100 mM HCI: yükleme ve sıyırma için aşağıdaki çözümleri hazırlanması 2 O. Mikro santrifüj küvet kullanıldığındaes ve belirlenen tüpler SPR, tüplerin kapaklarını kesmek unutmayın.
5. Başbakan SPR Enstrüman RB ile
6. Yeni Run Başlat
- Deney sırasında kullanılacak akış hızını ayarlayın. Burada anlatılan sonuçları elde etmek için 50 ul / dk akış ayarlayın.
NOT: Bu parametre deney sırasında değiştirilebilir. - Akış yolları ve referans çıkarma tanımlayın. Burada açıklanan yolları Fc = 1 ve Fc = 2, çıkarma Fc = 2-1 set sonuçlar elde etmek için.
NOT: Program gerçek zamanlı olarak ölçülen iki hücre çıkarma gösterecektir. Bu parametre deney sırasında değiştirilemez unutmayın. - Uygun numune raf seçin (örnek hacmi tüketimini etkileyebilir).
- Sonuçlar dosyayı kaydedin.
7. Deney döngüleri
Her deney döngüleri oluşur, ea yapılan enjeksiyonlar net bir kaydını tutmakch döngüsü ve ligandlar 'yükleme, tamponunun boş enjeksiyon, ve farklı döngüleri içine analit enjeksiyonu ayrı.
- Döngü 1: Chip hazırlama ve nikel yükleme
- 6.1 ve 6.2 adıma göre akış ve yolları ayarlanmış olduğundan emin olun.
- 1 dk kalanlar yıkayacak için 350 mM EDTA enjekte.
- 10 ul / dk akış ayarlayın.
- 2 dakika boyunca 0.5 mM NiCl2 enjekte edilir.
NOT: Şimdi çip reçine nikel iyonlarının tarafından kaplanır.
- Döngü 2: immobilizasyonunu ligandlar
- 15 ul / dk, akış yolu Fc = 2 Set akışı.
- Moleküler ağırlığının 10-20 misli olan RU değerleri elde edilene kadar bir ligand enjekte edilir. Örneğin, RU 500-1,000 kadar 50 kDa'lık bir ligand yükleyin. Elde RU değer bir kaydını tutun.
- 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 Set akışı.
- Ligand A. bu kontrol yardımcı on-line çıkarma sensogram (Fc = 2-1) Monitör aynı RU değerine kadar ligand B (kontrol) enjekteEnjeksiyon uzunluğu.
- 50 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2 Set akışı, başlangıçta kadar 5-20 dakika yıkayın sistemi (Fc = 2-1) stabilize.
- Döngü 3: Boş enjeksiyonu. Bu enjeksiyon, bu nedenle analitin kendi dışında bir analit ile birlikte enjekte edilecek olan tüm bileşenleri içeren boş çıkarma hizmet edecektir.
NOT: Enjeksiyon uzunluğu denge (sinyal yaylalar) ulaşmak için gereken süre bağlı olarak değişebilir.- 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2, Fc = 2-1 çıkarma Set akışı.
- 30 saniye ('bekle' olarak bundan sonra anılacaktır) 'bekle' komutunu yerleştirin (istikrarlı bir temel sağlamak için).
- 15 sn RB enjekte.
Not: enjeksiyon süresi öncesi denge kinetik sabitler (çoğunlukla k) bağlı olarak, farklı sistemleri arasında değişir. - Ayrışma safhasının kaydetmek için 120-600 saniye.
NOT: Bu adım uzunluğu göre değişir
- Döngü 4: analit enjeksiyon
- Kopya / referans enjeksiyonu (döngüsü 3) bu yüzden bu iki enjeksiyonları sonra çıkartılabilir kullanılan tam koşullar yapıştırın. Analit çözümü tutan bir kontrol çözümü tutan birinden rafa yuvanın yerini değiştirin. Beklenen K D biraz üzerinde bir konsantrasyon seçin. Hiçbir ön bilgi varsa, iyi bir başlangıç noktası olarak 1 mcM seçin.
- Döngü 5: Tampon enjeksiyon
- Tekrar döngüsü 3.
- Döngü 6: analit enjeksiyon
- Tekrar döngüsü 4.
- Döngü 7: Chip kapalı şerit
- 50 ul / dk akış ayarlayın. </ Li>
- 1 dakika için 350 mM EDTA enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın.
- 1 dakika boyunca% 0.25 SDS enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın.
- Taban çizgisi seviyesi ulaşılamaması halinde, ilave sıyırma aşaması olarak 1 dakika için 100 mM HCI enjekte edilir.
- Bekleme moduna geçer 'uç koşmak' komutunu yerleştirin.
- Çip depolama
- Sensör çip çıkarın ve cihazın dışarı almak.
- Kendi kılıfından sensörü çıkartın yüzeyine dokunmaktan kaçının, DDW ile durulayın ve RB içeren 50 ml'lik bir tüp içinde yer. 4 ° C'de saklayın.
8. Veri Analizi Değerlendirme Yazılımı Belirlenmiş kullanma
- Kinetik parametrelerin türetme önce SPR tarafından elde edilen ham verilerin işlenmesi için aşağıdaki adımları uygulayın.
- Değerlendirme yazılımını kullanarak, açıksonuç dosyası seçin döngüleri 3-6 Fc = 2-1 (referans verilerini çıkarılır).
- Eksen kayması:
- Ekran döngüleri 3-6.
- Sıfır dört eğriler için taban (her döngüsünde ilk 30 sn bekleme süresi) Y-ekseni değeri.
- Dört Eğrilerin X eksenini hizalayın. Belirgin özellikleri seçin (örneğin, enjeksiyon başlangıç veya bitiş zamanları) mükemmel X-ekseni boyunca dört eğrileri hizalamak için. Sıfıra analit (veya kontrol tamponu) başladığı zamanı ayarlayın.
- Referans çıkarma
- Kullan Y-ekseninde bulunabilir eğri çıkarma işlemi menüsünü kaydırır döngüsü 6. eğriden döngüsü 4 ve döngüsü 5 eğrisinin gelen döngüsü 3 eğrisini çıkarılarak arka plan yanıtı çıkartın.
NOT: Bu yüzey kırılma indeksi etkilemiş olabilir (analit ilgisiz) herhangi bir spesifik olmayan bileşenleri iptal etti bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir.- T çıkarılır eğrileri kaydetO farklı bir isim altında projenin sac.
- "Çifte çıkarılır eğriler" olarak bu eğrilerin bakın: İlk çıkarma hem enjeksiyonlar gerçekleştirilir 2-1 çıkarma ve ikinci diğerinden eğrinin çıkarma olduğunu.
NOT: Bu tür çift referans SPR deneyler altın standarttır. - Daha önce açıklandığı gibi eksen kayması gerçekleştirerek çıkarılır eğrileri Yerleşimi.
- Kullan Y-ekseninde bulunabilir eğri çıkarma işlemi menüsünü kaydırır döngüsü 6. eğriden döngüsü 4 ve döngüsü 5 eğrisinin gelen döngüsü 3 eğrisini çıkarılarak arka plan yanıtı çıkartın.
- Kinetik sabitler ve model montaj belirlenmesi
- Bir kinetik deney yapılması
- Kinetik sabitlerin belirlenmesi için güvenilir bir veri için 6-7 analit konsantrasyonları bir dizi enjekte edilir. Dan analit konsantrasyonunu seçin 2-3 kat seyreltilerde, tahmin K D altında 10 kat yukarıda 10 kat. Daha sonra (yukarıya bakınız) çift referans çıkarma için kullanılan "sıfır" konsantrasyonu, ekleyin. Üçlü ve rastgele sırayla enjeksiyonları Davranış.
- Hizalamave model uydurma denemeden önce Y-ekseni ve X-eksenine göre tüm eğrileri çıkarma.
- Model uydurma
- Uygun analiz programı seçin.
NOT: Çoğu mevcut montaj programları uydurma ve kinetik sabitleri tayini için uygulanabilir çeşitli modeller sunuyoruz. - Analit ve montaj için ligand arasındaki etkileşimi 1: geri dönüşümlü bir 1 varsayarak basit modeli (Langmuir) uygulayın. Veri ikna daha karmaşık bir etkileşim varlığı için diğer deneysel yöntemler kullanılabilir sürece, her zaman basit, Langmuir modeli kullanın.
- Uygun analiz programı seçin.
- Bir kinetik deney yapılması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen bir sistemde, Ninta çip His ile etiketlenmiş zar taşıyıcı 6,7 hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bir homo-dimer olmak, her taşıyıcı iki kat onun Ninta çip bağlanması iyileştirilmesi, etiketlenir. Nikel yükleme, ligand A (faiz taşıyıcı) ardından RU 3,500 ~ kadar, Fc = 2 üzerine immobilize edilir (protokol döngüsü 2, Şekil 2A siyah etiket). Ardından, aynı akışı ve enjeksiyon süresi, ligand B (kontrol ligandı) kullanarak başlangıçta sadece kadar ~ 3.000 RU ulaşan, Fc = 1 üzerine enjekte edilir. Içindeki protein miktarlarının her iki akış hücreleri üzerinde hareketsiz olduğundan emin olmak için; Ligand B daha dikkatli 3.500 RUs için yükleme kadar izlerken, kısa enjeksiyon kullanılarak, yüklenir. 'Merdivenlerde' şekil her enjeksiyon (Şekil 2A gri etiket) üzerine Fc = 1 kitle kademeli artışı ifade etmektedir. Fc bir on-line izleme = 2-1 eşit ligand yükleme kontrol yardımcı olur. Şekil 2B Fc = 2- gösteriyor1 çıkarma, yani, Fc = 1 RU değer adım adım artışlarla gelen Fc = 2 maksimum RU değeri, çıkarılmasıyla. Bu incelenmiş ve kontrol ligandların eşit bir yük elde etmek için ligandlar "enjeksiyon süresini değiştirmek için önemlidir. Analiti enjekte Bunun tersine, enjeksiyon süresi kullanılan bütün konsantrasyonlarda sabit tutulmalıdır. Şekil 3A ve 3B, bir "boş analiti 'enjekte edilmesi ile ölçülen yanıtlar gösterdiğini belirtmiştik (yani, RB sadece analiti çıkarılır) döngüsü 3 ve 5, ve, analit, enjeksiyonlar (döngüsü 4 ve 6). Her iki öz sensogramlar Fc = 2-1 çıkarma temsil ettiğini unutmayın. Döngüleri (3-6) (boşluk veya belirli bir konsantrasyon) özdeş bir analit enjeksiyon her iki akış hücreleri üzerine uygulanır Farklı ligandlar ile hareketsiz kılınmış. İki tekrarlar SPR yüksek tekrarlanabilirlik gösteren, çok iyi üst üste. Bir yanıt her iki durumda da kaydedilir; ~ 3 karşı boş RU ~ 4Analit için 0 RU. Bu değerler, ~ 13 gürültü oranına bir sinyal gösterir. Sadece spesifik bağlanma yanıtı temsil çift referans öz sensogramlar, elde edilmesi için, boş enjeksiyon hemen analit enjeksiyon (~ 37 RU, Şekil 3C) çıkartılmaktadır. Kaydedilen sensogram geçici etkileşim paternlerini göstermektedir. Enjeksiyon sırasında, bağlanma fazı yaklaşık 7 saniye sonra sabit duruma ulaşıldıktan, ligand-bağlı reseptör analit miktarında hızlı bir artış ile karakterize edilmektedir. kararlı durum sürece analit enjekte olarak muhafaza edilir. Enjeksiyon sonlandığında, hücreler RB ayrılma fazı tetikleme ile yıkanır. Karmaşık hızla ayrışarak, ve analit gibi uzak ligandından başlangıca SPR sinyali döner yıkanır.
Nicel verileri (ön-denge ve denge sabitleri) kazanmak için, analit konsantrasyonlarının bir dizi çiftleri veya üçlü (protokolünde 8.3.1 bakınız) enjekte edilir.
Bir Ni-NTA sensör çipini kullanan bir SPR deney aşamalarının Şekil 1. Çizim. (A (B - D) bir SPR deney sırasında kaydedilen Fc = 2-1 sensogram çizimi. His-etiketli ligand olarak çevrim 2, Ni yüklü bir yüzey üzerine enjekte edilir kütlesi tedrici birikir. (Ligandın MW bağlı) 1000-5000 RU arasında değişen bir nihai RU değeri ulaşıldığında Enjeksiyon sonlandırılır. Bir taban çizgisi çip ligandın kararlı bağlanma yansıtan oluşturulur. Döngüsü 3, boş enjeksiyon, analit dışındaki analiti numune bileşenleri enjekte öncede oluşturulur. Bu enjeksiyon sıklıkla düşük tepki (1-5 RUs) kaydedilir. Döngü 4'te analit boş enjeksiyonla aynı rejimi kullanılarak enjekte edilir. artan RUs yüzeyi, yani, ligand analtik bağlanma kütle değişimi yansıtmaktadır. Sinyal hızla inci gibi daha sonra yaylaları artırır vee sistemi dengeye ulaşır. Enjeksiyon sonlandığında, analit sinyalinde bir azalmaya yol açan, bağ ayrıdır ve başlangıç seviyelerine geri döner.
Ligand yüklemelerinde hattı izlenmesi Şekil 2. (A). Ligandı yükleme çıkartılmamış eğrileri. Çevrede (ligand "A") ligand istenen RU seviyesine (~ bu örnekte 3500 RU) ulaşana kadar hücre 2 (Fc = 2, siyah) akmasına yüklenir. Daha sonra, negatif kontrol ligandı (Ligand "B") adım adım yüklenmiş aynı RU seviyesine kadar akış hücresi 1 (Fc = 1, gri) üzerine yakalanır. Bir Fc = 2-1 çıkarma gibi, gerçek zamanlı olarak izlenir (B), (A) 'da yapılan iki enjeksiyonu yapıldı. Bu izleme ilgi ve kontrol ligandların aynı yüklemeyi kolaylaştırır.
2-1 çıkarma Şekil 3. Çift referans. (A) çoğaltır (yani, Fc = 2-1) boş enjeksiyon. (A) 'daki gibi, (B) yalnızca analit enjekte edilir. (C) (B) 'de ölçülen yanıtından (A)' da gösterilen, zemin yanıtı çıkarıldıktan sonra Nihai öz sensogramlar. Bu eğriler 'çift boşluklu "veya" çift başvurulan "olarak adlandırılır. Çoğaltır ardışık döngü vardır.
. 1 Langmuir etkileşim modeli: Şekil (çiftleri olarak) birden fazla analit konsantrasyonlarının enjeksiyonları ile kinetik hız sabitleri 4. belirlenmesi siyah çizgiler basit 1 kullanılarak hesaplanmıştır uyuyor vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR moleküler etkileşimleri incelemek için son derece hassas bir yöntemdir ve geçici (henüz önemli) etkileşimlerin gerçek zamanlı izleme sağlar tek yaklaşım genellikle. Bir örnek başka bir yöntemle (açılan deneyleri, lipozomlar sedimantasyon tahlilleri 6) tarafından tespit edilememiştir burada sunulan geçici etkileşim vardır. Diğer yöntemler (nicel veya nitel olsun) ölçümleri denge sınırlıdır Dahası, SPR da ön denge kinetiği ölçmek tek tekniklerden biridir.
Onun artan duyarlılık aynı zamanda ihtar olduğunu. Yanlış pozitif öz sensogramlar kolayca kaydedilir. Bu nedenle, SPR ölçümleri başlamadan önce başka yöntemler kullanılarak etkileşim varlığını oluşturulması önerilir. (Geçici etkileşim vs istikrarlı K D kaba değerlendirme) sistemin özellikleri ön bilgi SPR experime kurma çok yararlıNTS ve elde edilen ölçümlerin fonksiyonel alaka değerlendirmek. SPR ölçümleri başlangıç protein örneklerinin kalitesi önce önemli bir konu akılda tutmak. SPR agrega son derece duyarlı olup, bu ligand ve (jel filtrasyon kromatografisi veya ultra-santrifüj mümkün göre) analit preparatlar hem de çıkarılması gerekir. Gürültü ve yanlış sinyallerin başka kaynak RB ve analitin tampon arasındaki tampon uyumsuzlukları kaynaklanıyor olabilir. Bu, RB karşı analit diyaliz veya RB içine birçok kıvrımlar sulandırılır analit (~ 100-1,000 kat) bir derece konsantre hazırlık kullanılarak çözülebilir. Yanlış pozitif veriler çipin matris ile veya negatif kontrol analitin spesifik olmayan etkileşimleri sonucu olabilir. Bu etkileşimler bazen düşük analit konsantrasyonları kullanılarak önlenebilir düşük afinite bulunmaktadır. Buna ek olarak, düşük BSA ve / veya deterjan konsantrasyonları (0.1 mg / ml ve / veya 0,05 dahil), Sırasıyla (a / h) RB ve enjekte analit örnek% 0.1 spesifik olmayan etkileşimleri azaltabilir. Negatif kontrol hücresi (farklı negatif kontrol) içeriği değiştirme spesifik olmayan bağlanma sorunları ile başa çıkmak için başka bir yaklaşımdır. Alternatif olarak, yonga başka türünü kullanarak da veri kalitesini etkileyebilir. Sensör çipinin Çeşitli farklı kimyalar göre, ticari olarak temin edilebilir. En sık kullanılan sensör çipine (CM-5 çip) karboksimetile dekstran kovalent bir altın yüzeye bağlanır. Proteinler kovalent çok basit bir yüzey kimyası, çeşitli (en yaygın olarak bir amin veya tiyol birleştirme) ile sensor yüzeyi ile birleştirilebilir. Membran proteinleri kovalent immobilizasyon ile çalışırken Ancak, bizim ellerde, genellikle eserler verir ve böylece seçilecek yöntem değildir. Bir zar proteini okuyan bağlamında, lipofilik moleküller ile kaplanır, ticari fiş olduğu dikkat çekicidir. Bu IMMOB etkinleştirmekBir yerli-benzeri bir ortamda üzerine membran proteinlerinin yonu. Benzer sensör yongaları da 'evde' hazırlanabilir. Diğer bağlantı yöntemlerinin açıklaması için 10,11 bakın. Burada tarif edilen protokol, His etiketli, deterjan içerisinde çözünebilen taşıyıcı hareketsizleştirilmesi için Ni-NTA yonganın kullanımına dayanmaktadır (analit yonga yüzeyi bağlanma analiti bilmek His ile etiketlenmiş değildir). Bizim deneyim 6,12 Ni-NTA çipleri ile yapılan deneylerde elde edilen kinetik sabitler anadili gibi ortamlarda tespit edilenlerle iyi bir uyum içindedir. Ni-NTA yongaları nispeten pahalı olmasına rağmen, birincil avantajı, ligandın sıyrılmış ve yeniden kullanılabilir olmasıdır. Ölçümlerin yüzlerce çip başına yapılabilir. Ayrıca, çip üzerindeki ligant oryantasyon his-etiketi konumu tarafından belirlenir ve bu nedenle oldukça homojendir.
Bir etkileşim başarıyla SPR, kontrol ve REPE bir dizi kaydedildiğindeats SPR sinyali geçerliliğini doğrulamak için gereklidir. Aşağıdaki parametrelerin Doğrulama SRP verileri doğrulamak için yardımcı olabilir:
SPR sinyalindeki 1. Özelliği: SPR hassasiyeti nedeniyle, uygun negatif kontrollerin kullanımı özel önem taşımaktadır. SRP tarafından kaydedilen Spesifik olmayan etkileşim matrisine bir analitin adsorpsiyonuna bağlı olabilir. Protein (ligant) ile yüklü bir akış hücresi kimyasal bir boş akış hücresinden eşdeğer olmadığı Bu nedenle, bir boş akış hücresi, genellikle en iyi seçenek değildir. Daha iyi bir seçenek ligandın bir inaktif mutan varyantı analiti bağlamak için bilinen bir kullanmaktır. Seçenek olarak ise, bir benzer mutasyona uğramış analiti kullanabilir. Bu tür mutantlar mevcut değilse, bir homolog protein (ama farklı bağlama spesifikliği) 12 kullanılabilir. İyi Negatif kontrol örnekleri, (burada açıklandığı gibi), bir homolog ligandı, ya da bilinen etkileşim ortaklarından biri bir nokta mutasyonudernek ortadan kaldırmak. Başka bir negatif kontrol etkileşim için gerekli olan bir post-translasyonel modifikasyon (örneğin, fosforilasyon, metilasyon, tiol türev) bir değişiklik olduğunu önermiştir. Örneğin, SH2 etki etkileşimi için elzem olan bir tirozin de-fosforilasyonu. Diğer negatif kontroller sistemine özgü olabilir. SPR kullanırken, sıkı olumsuz denetimleri kullanarak önemi göz ardı edilemez.
SPR sinyali 2. tekrarlanabilirliği: SPR son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Eşit ligand miktarları biyosensör çipi üzerine yüklenir ve analitin eşit konsantrasyonları tekrarlar mükemmel hizada olmalıdır enjekte edildiğinde (Şekil 3).
Sistemin 3. rejenerasyonu: la fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü korurken, yavaş bir ayrışma hızı (Kd) ile etkileşim içinde, analit, liganddan sıyrıldı olmalıdırtter. Ayrışma ve / veya yenilenmesi eksik ise, SPR sinyali yavaş yavaş analitin sonraki enjeksiyonlar üzerine çürümeye olacaktır. Test edilebilir tipik yenileyici koşulları Mg yüksek konsantrasyonlarda 2 + (2 M kadar), asidik ya da bazik şartlar (örneğin, 10 mM glisin, pH 2.5, 10 mM NaOH), tuz (en fazla 4 M NaCI), ya da vardır yüksek deterjan konsantrasyonu (örneğin,% 1 DDM). Ancak, bu reaktif (ve diğerleri) rejenere etkinliği yüksek sistem özel ve böylece Rejenerasyonlarını koşulları test edilmelidir olduğunu. Bazı durumlarda, etkileşim yenilenmesi E. durumunda olduğu gibi hiçbir zaman tam bir şekilde, kararlı ve kuvvetli coli B 12 vitamini taşıma sistemi (BtuCD-F) 7. Bu koşullar altında, tek seçenek biyosensör çip ligand şerit ve her enjeksiyon için yeni bir toplu yeniden etmektir. Ligand Analitin ayrışma durumlarda hızlı ve eksiksiz yüzey yenilenmesi gereksiz(Protokolü görmek ve 2-3 Şekil).
4. Zar proteinleri, her zaman SPR duyarlılık ve reaksiyon hızlarını etkileyebilen deterjanın varlığında, arıtılmaktadır. Ancak, BtuCD ile bizim deneyim, ölçülen oranlar çok benzer. Bir her zaman böyle boyut dışlama kromatografisi gibi ücretsiz yaklaşımlar (SEC) kullanarak destekleyici kanıt elde etmek gerekiyor, SPR ve diğer teknikler arasında bir korelasyon metiyonin için gösterilmiştir Örneğin açılan deneyleri, lipozom sedimantasyon tayini, vb, vitamin B 12, ve iki molibdat sistem 6,12.
Kinetik hız sabitlerinin belirlenmesi Hatalı genellikle uydurma sürecinde ortaya çıkar. Analiz kinetik deneyler için 1 etkileşim modeli: bir kural olarak, her zaman basit Langmuir 1 geçerlidir. daha karmaşık modeller yapısal değişiklikler, iki değerlikli analit, veya örnek heterojenite ek varsayımlar yapmak. Bu varsayımlar olmalıdırdiğer deneysel yaklaşımlardan kanıtlarla desteklenen yalnızca yaptı. Bu modelleri uygulayarak daha iyi montaj ve düşük Ki 2 değerleri en muhtemel sonuç, ama bu onların güvenilirliği için bir tanıklık olarak görülmemelidir unutmayın. daha karmaşık modeller sağladığı özgürlük yüksek derece ziyade onların mekanik alaka daha genellikle iyi uydurma sorumludur.
SPR avantajlarından biri de, özellikle çözündürülmesi ve zar proteinlerini saflaştırmak için kullanılan deterjan ile ilgili olarak, geniş bir kimyasal uyum sağlamasıdır. Bununla birlikte, çoğu zaman zar proteinlerinin saflaştırılması işlemi esnasında ilave edilir sükroz ve gliserol (ve diğer viskoz çözeltiler) RU üzerinde dramatik etkileri vardır. Bu nedenle, eğer mümkünse, bu önlemek ya da en azından bunların konsantrasyonunun düşürülmesi tavsiye edilir. Viskoz çözümleri kullanırken, tampon uyuşmazlığı kaçınarak gerekli olur. RB içeren bir deterjan lipidler ekleme bağlama işareti büyütebilirolduğu kadar, on kat tarafından diğ. Bununla birlikte, böyle bir girişim (çoğu lipidler için) pahalı ve biyosensör yongaları ömrünü kısaltır eğilimindedir.
Yeni bir sistem kalibre ederken yukarıda listelenen ipuçları ve sorun giderme yardımcı olabilir. Ancak, herhangi bir sistem, genellikle en iyi sonucu elde etmek için (örneğin, deterjan, tuz, pH seçimi) belirli bir ince ayar gerektirir.
SPR uzun moleküler etkileşimleri ölçmek için güçlü ve benzersiz bir yaklaşım olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda çeşitli SPR platformlarda ve onların fiyatlarındaki düşüşlerin kullanılabilirliği SPR daha yaklaşılabilir yaptı. Hızla ve kurşun küçük molekül inhibitörleri keşfetmek protein-protein etkileşimleri, hedef protein-ilaç etkileşimleri incelemek için altın standart yaklaşım haline geliyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
