Summary
משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI); ההיווצרות והניתוק של קומפלקסי חלבונים, הם אירועי מפתח בתהליכים ביולוגיים רבים (למשל, שכפול, שעתוק, תרגום, איתות, תקשורת תאי תאים). מחקרים חצי כמותית של PPI לעתים קרובות מתבצעים באמצעות נפתחים או ניסויים חיסוניים ממטרים. עם זאת, בטכניקות אלה (ודומים) מוגבלים בטווח של זיקות שניתן למדוד (מייקרו הנמוך וזיקה גבוהה יותר) בשל צעדי הכביסה כי הם טבועים בטכניקות כאלה. טכניקות "נקודת סיום" כזה לא יכול לזהות אינטראקציות זיקה חולפות או נמוכות, כי הם לעתים קרובות השלכות ביולוגיות גדולות. בנוסף, ההחלטה הזמנית של גישות כגון מוגבלת מאוד, בדרך כלל בסדרי גודל איטי יותר מאשר שיעורי התגובה. SPR מתגבר חסרונות אלה בשל רגישותו והחלטה זמנית מעולה 1,2. SPR הוא שיטה ללא תווית, ובתור שכזואינטראקציה מולקולרית ניתן למדוד (כל עוד ניתן לאתר את שינויי המסה). בנוסף למדד המחירים ליצרן, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין חלבון ליגנד, חלבון תרופתי (או מולקולה קטנה), חלבון ה- DNA, ואינטראקציות החלבון-RNA 3-5. תוצאות נרשמות וזממו בזמן אמת, המאפשר שינוי מהיר של תנאי ניסוי ועיצוב ניסיוני גמיש.
העיקרון הפיזי מאחורי מכשירים מבוססים SPR הוא הניצול של מערכת אופטית המודדת שינוי של מקדם השבירה על פני השטח החיישן על המסה משתנה 2. אחד מהשותפים באינטראקציה (ליגנד להלן) הוא משותק על גבי שבב מטריצת פולימר והמולקולה השנייה (אנליטי להלן) הוא זרם על פני השטח. אנליטי מחייב ליגנד משנה את המסה על פני השטח השבב. שינוי מסה זו באופן ישיר ויחסי הקשורים לשינויים במדד השבירה של פני השטח. התוצאות נרשמות בזמן אמת ומוצג כיחידות תגובה (RU) כפונקציה של זמן. כגון עלילה נקראת sensogram (למשל, איור 1). מאז SPR עוקב אחרי מסלול הזמן השלם של האינטראקציה, קבועי קצב הקינטית מראש שיווי משקל נגזרים, בנוסף לשיווי משקל זיקות. כפי שיפורט להלן, מראש שיווי משקל התנהגותה של מערכת נתונה מחזיקה הרבה מידע, ומספקת נקודת מבט שונה מאוד משיווי המשקל לבד. ברגע שהמערכת מכוילת, ניסויים הם מהירים מאוד ודורשים רק כמויות קטנות של חומר חלבונים (מיקרוגרם לננוגרם כמויות). איסוף המידע הקינטית המלא של מערכת נתונה ניתן להשיג בימים. הרגישות הגבוהה של SPR מאפשרת מדידות שאינן אפשריים באמצעות כל טכניקה אחרת 6. עם זאת, רגישות גבוהה זה היא "חרב פיפיות" שכן הוא יכול להיות מקור עיקרי לנתונים חיוביים כוזבים. כל גורם המשפיע על המדד רעיוני נרשם וזמם על sensogram. ככזה, apבקרות propriate יש להשתמש כדי לחסל שווא-תוצאות חיוביות, ותמיכה מגישות משלימות מומלצת מאוד.
איור 1 מדגים את ההתקדמות של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן מצופה נת"ע. Sensogram בפנל מראה את הזריקה של יוני ניקל על מטריצת נת"ע (נתונים unsubtracted), וBD לוחות להציג את הנתונים לאחר הפחתת האות נגזרת מתא הבקרה השלילי. אדום וחצים כחולים מראים תחילת הזרקה וסופו של דבר, בהתאמה. קיבוע של יגנד על השבב משנה בהדרגה את המסה עד ההזרקה מסתיימת. הרמה היציבה נצפתה לאחר סיום ההזרקה של יגנד משקפת את העמותה היציבה של יגנד אל פני השטח (איור 1, מחזור 2). ברגע שבסיס יציב מושגת חיץ מוזרק מעל ליגנד ותא ההתייחסות (איור 1, מחזור 3) הזרקת .זה משמש כ'ביקורת ריקה ", ויהיהנגרע במהלך ניתוח. על הזריקה, שינויים קלים נרשמים, המשקפים זרימת המונית דרך השבב. לאחר מכן, במחזור נפרד (איור 1 ב, מחזור 4), אנליטי מוזרק; העלייה ההדרגתית בRU מייצגת עמותה של אנליטי ליגנד. אתרי הקישור הופכים בהדרגה הכבושה עד שיגיע לשיווי המשקל. ברגע שההזרקה מסתיימת, ירידה בRUS משקפת ניתוק של המתחם. מsensograms כזה ניתן לגזור קבוע שיעור ריבית לפני שיווי משקל ושיווי המשקל (ראה בהמשך). איור 1 מתאר אינטראקציה בין חולפת יגנד ואנליטי. כאשר האינטראקציה היא יציבה יותר, הירידה ברמת RU היא איטית יותר, המשקף ד k נמוך יותר.
במסמך זה, אנו מתארים ניסוי SPR שנועד לאפיין את האינטראקציה בין טרנספורטר קרום (חומר ניקוי solubilized) והשותף הפונקציונלי שלה, מצעו המקור שלה מחייב חלבון 6,7. Mod נבחרמערכת אל היא טרנספורטר קלטת מחייבת ATP (ABC), ModBC-של fulgidus Archeaglobus. מערכת זו נבחרה לתוצאות מאוד לשחזורה, גבוהה יחס אות לרעש, וקלאסי "on / off" שיעורים. בנוסף, מובילי homologues ABC זמינים לשרת בקרות שליליות חשובות. טרנספורטר, ModBC (ליגנד) מופק מקרום שימוש בחומרי ניקוי, מטוהר ומשותק על השבב. שותפו המסיס באינטראקציה, Moda, הוא אנליטי. כיגנד שליטה שלילי, RbsBC טרנספורטר ABC שונה משמש ("ליגנד B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לדוגמא חלבון והצפת הכנה
- לדוגמא הכנה: לטהר את החלבונים של עניין ולוודא שכל אגרגטים יוסרו, על ידי הזרקת החלבון לפני הניסוי על עמודת ג'ל סינון או על ידי ultracentrifugation (בדרך כלל 10 דקות ב 100,000 XG הוא מספיק).
הערה: למרות הכנות רצויות, טהורות מאוד חלבון אינן חובה. SPR שמש בהצלחה עם purifications פחות מ-מושלם ואפילו עם סך 8,9 תמצית. - הכנת חיץ:
- הכן את החיץ של הניסוי (שמכונה "חיץ ריצה", או RB). לפרוטוקול מתואר כאן, להשתמש 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ"מ NaCl ו 0.05% (w / v) DDM (β-D-maltoside n-Dodecyl). זכור כי הבחירה של הרכב חיץ ניתן לשנות בקלות על פי השיטה למדה.
- לסנן את כל המאגרים ודגימות חלבון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. ודא מראש כי מסנני חלבוניםתואם. באופן כללי, פלטפורמות SPR שווקו לאחרונה להכיל דה-גאסר באונליין; אם זה לא המקרה, דה-גז המאגרים לפני שימוש.
- Dialyze הלילה או לדלל את הדגימות נגד RB, כדי למנוע חוסר התאמה חיץ. דיאליזה (או כל שיטה אחרת של חילופי חיץ) מומלצת במיוחד בעת שימוש בכימיקלים של צמיגות גבוהה (למשל, סוכרוז, גליצרול, DMSO). לפני חיבור בקבוק RB לכניסת המשאבה לשמור בצד 10 מיליליטר של RB בצינור נפרד.
- לדלל את מניות יגנד מרוכזות לRB לריכוז סופי של ~ 20 מיקרוגרם / מיליליטר. ככלל אצבע, לקיבוע יגנד יציב, להשתמש בריכוזים נמוכים יגנד עם זריקות כבר בזרימה נמוכה, בניגוד לריכוזים גבוהים, תזרים גבוה וזריקות קצרות יותר.
- לדלל את אנליטי לRB לריכוז הרצוי. בדרך כלל, לבדוק את הטווח של ריכוזים למערכת של זיקה לא ידועה מ10 מיקרומטר עד 10 ננומטר בדילולים של פי עשרה. תמיד להתחילעם הריכוזים הנמוכים הראשון.
2. שבב חיישן
- בחירת שבב: השתמש בחומצת nitrilotriacetic (נת"ע) שבב בשילוב מתאים ללכידת חלבונים עם תג אוליגו-היסטידין.
- שימוש בשבב:
- בעת השימוש בשבב חדש, לקחת את השבב החוצה מהנדן, לשטוף בעדינות עם מים מזוקקים כפולים (DDW), לייבש את הנוזלים שנותרו בזהירות באמצעות מגבים עדינים, ולוודא שלא לגעת במשטח שכבת זהב. מניחים את השבב בחזרה לנדנה בכיוון הנכון (ההכנסה היא חלק כאשר השבב ממוקם כראוי).
- כאשר שימוש חוזר שבב, להוציא את השבב מאוחסן מהחיץ, לשטוף היטב עם DDW ויבש בעדינות כאמור לעיל, והנח לנדנה המקורי.
הערה: ההצטברות של זבל חומר שאינו ספציפי על השבב יכולה להשפיע על "הכדאיות" שלה. זה יכול להיות במעקב על ידי השוואת RUS לפני קיבוע יגנד ופוסט הפשטה. למרות מדידות רבות יכולות להיותנעשה שימוש באותו השבב NiNTA, הנושא של אריכות הימים שלו הוא לא "ברור" ומשתנה מאוד בין שבבים שונים.
- עגינה שבב: פתח את דלת שבב חיישן ולמקם את השבב בנדנה. בעת שימוש בשבב חדש, המספר הסידורי של קלט השבב לשמור תיעוד שימוש. סגור את הדלת ולחץ על 'שבב מזח ".
3. הגדרות טמפרטורה
- הגדר את טמפרטורת תא שבב 25 ° C (או בטמפרטורת הניסוי המועדפת).
- אופציונאלי: להגדיר את תא הדגימות עד 7 מעלות צלזיוס כדי לשמור על החלבונים יציבים לאורך כל הניסוי.
4. פתרונות לטעינה ושלילה
הכן את הפתרונות לטעינה וההפשטה הבאים: 0.5 מ"מ NiCl 2 בRB, 350 mM EDTA בRB (להוסיף חומר ניקוי לפתרון EDTA לריכוז סופי כמו בRB), 0.25% SDS בH 2 O, ו -100 מ"מ HCl בH 2 O. בעת שימוש באמבטית מיקרו צנטריפוגותes ולא SPR צינורות מיועדים, אל תשכח לנתק את הכובעים של הצינורות.
5. ראש Instrument SPR עם RB
6. התחל ניו הפעלה
- הגדר את קצב הזרימה שישמש במהלך הניסוי. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הזרימה 50 μl / min.
הערה: פרמטר זה יכול להיות שונה במהלך הניסוי. - הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור התייחסות. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הנתיבים Fc = 1 וFc = 2, Fc חיסור = 2-1.
הערה: התכנית תציג בזמן אמת החיסור של שני תאים נמדדו. זכור כי פרמטר זה לא ניתן לשנות במהלך הניסוי. - בחר את מדף המדגם המתאים (זה יכול להשפיע על מדגם צריכת הנפח).
- שמור את קובץ התוצאות.
7. מחזורי ניסוי
כל ניסוי מורכב ממחזורים, לשמור תיעוד ברור של הזריקות נעשו בeaמחזור ch, ולהפריד בין הטעינה 'ligands, ההזרקה ריקה של החיץ, וההזרקה אנליטי למחזורים שונים.
- טעינת הכנת צ'יפ וניקל: מחזור 1
- ודא את הזרימה והנתיבים נקבעים בהתאם לצעד 6.1 ו -6.2.
- להזריק 350 mM EDTA ל1 דקות כדי לשטוף את השאריות.
- זרימה להגדיר עד 10 μl / min.
- הזרק 0.5 מ"מ NiCl 2 למשך 2 דקות.
הערה: עכשיו שרף השבב מצופה על ידי יוני ניקל.
- מחזור 2: ligands קיבוע
- זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 2.
- הזרק יגנד עד שמגיעים ערכי RU כי הם 10-20 קפל של המשקל המולקולרי שלה. לדוגמא, טען יגנד של 50 kDa ל500-1,000 RUS. שמור תיעוד של ערך RU הושג.
- זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1.
- הזרק יגנד B (שליטה) עד אותו ערך RU לזה של א 'יגנד צג sensogram החיסור (Fc = 2-1) על השורה כדי לעזור לשלוט באורך הזרקה.
- זרימת סט 50 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, לשטוף את המערכת ל5-20 דקות, עד שהבסיס (Fc = 2-1) מייצב.
- מחזור 3: הזרקה בלנק. הזרקה זה תשמש לחיסור ריק, ולכן כולל את כל המרכיבים שניתן להזריק עם אנליטי, למעט אנליטי עצמו.
הערה: אורך הזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שנדרש כדי להגיע לשיווי משקל (מישורי אות).- זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, Fc = 2-1 חיסור.
- הכנס את הפקודה "לחכות" (להלן כ 'לחכות') במשך 30 שניות (יש בסיס יציב).
- הזרק 15 שניות RB.
הערה: משך ההזרקה ינוע בין מערכות שונות, בהתאם להקבועים מראש שיווי המשקל הקינטית (בעיקר k). - חכה 120-600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק.
הערה: אורכו של שלב זה משתנה בהתאם לd: איטי דיסוציאציה עוד צעד זה צריך להיות. למתחמי dissociating איטיים מאוד (ד k <10 -4 שניות -1), לחכות 10-15 דקות ולאחר מכן להמשיך אל פני השטח התחדשות (ראה בהמשך).
- מחזור 4: הזרקה אנליטי
- העתק / דבק התנאים המדויקים המשמשים בהזרקת ההתייחסות (מחזור 3) ולכן שתי זריקות אלה יכולים להיות מופחתים מאוחר יותר. לשנות את המיקום של החריץ במעמד מהאחד מחזיק את פתרון שליטה לאחד שמחזיק את הפתרון אנליטי. בחר ריכוז שהוא מעט מעל D K הצפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, לבחור 1 מיקרומטר כנקודת התחלה טובה.
- מחזור 5: הזרקת מאגר
- מחזור חזור על 3.
- מחזור 6: הזרקה אנליטי
- מחזור חזור על 4.
- מחזור 7: צ'יפ לערטל
- זרימה להגדיר עד 50 μl / min. </ Li>
- להזריק 350 mM EDTA דקות 1. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב.
- להזריק 0.25% SDS 1 דקות. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב.
- אם הוא לא הגיע לרמה בסיסית, להזריק 100 מ"מ HCl דקות 1 כצעד הפשטה נוסף.
- הכנס את הפקודה "לרוץ סוף 'שעוברת למצב המתנה.
- אחסון שבב
- הפרד את שבב החיישן ומוציא אותו מהמכשיר זה.
- קח את החיישן החוצה מנדנה, להימנע מנגיעה במשטח, לשטוף עם DDW, ומקום בצינור 50 מיליליטר מכיל RB. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה יעודיים להערכה
- בצע את השלבים הבאים כדי לעבד את הנתונים הגולמיים שהושגו על ידי SPR לפני הגזירה של הפרמטרים קינטית.
- שימוש בתוכנת ההערכה, פתוחקובץ התוצאות, מחזורים בחרו 3-6 Fc = 2-1 (התייחסות מופחתים נתונים).
- משמרת ציר:
- מחזורי תצוגה 3-6.
- אפס ערך ציר ה- Y של נקודת ההתחלה (זמן ההמתנה 30 שניות הראשוניות בכל מחזור) לכל ארבעת העקומות.
- יישר את ציר X- של ארבע עקומות. בחרו תכונות בולטות (לדוגמא, קוצים של תחילת הזרקה או לסיים) כדי ליישר מושלם ארבע עקומות לאורך ציר ה- X. קבע את הזמן של תחילת אנליטי (או חיץ שליטה) לאפס.
- חיסור התייחסות
- הפחת את תגובת רקע על ידי הפחתת עקומה של מחזור 3 מעקום של מחזור 4 ועקומה של מחזור 5 מעקום של מחזור 6. השתמש בפעולת חיסור עקומה שניתן למצוא בציר ה- Y משמרות תפריט.
הערה: חשוב לבצע שלב זה כפי שהוא מבטל את כל רכיבים ספציפיים (שאינם קשורים לאנליטי) שאולי השפיעו על מקדם שבירת פני השטח.- שמור את העקומות מופחתים בtהוא גיליון של הפרויקט תחת שם אחר.
- עיין בעקומות אלה כאל "עקומות מופחתים כפליים": החיסור הראשון הוא החיסור 2-1 מבוצע בשני הזריקות, והשני הוא החיסור של עקומה אחד למשנהו.
הערה: התייחסות כפולה כזה היא סטנדרטי בניסויי SPR זהב. - כיסוי העקומות מופחתים על ידי ביצוע שינוי ציר כפי שהוסבר קודם לכן.
- הפחת את תגובת רקע על ידי הפחתת עקומה של מחזור 3 מעקום של מחזור 4 ועקומה של מחזור 5 מעקום של מחזור 6. השתמש בפעולת חיסור עקומה שניתן למצוא בציר ה- Y משמרות תפריט.
- קביעת קבועי קינטיקה ומתאימה מודל
- ביצוע ניסוי הקינטית
- הזרק סדרה של 6-7 ריכוזים אנליטי ליש לי אמין של נתונים לקביעת קבועים קינטית. בחר ריכוזים אנליטי מ10-לקפל מעל לפי 10 מתחת לאומדן K D, בדילולי 2-3 פי. כולל ריכוז "אפס", מאוחר יותר המשמש לחיסור כפול התייחסות (ראה לעיל). לנהל זריקות בtriplicates ובסדר אקראיים.
- יישרולחסר כל העקומות ביחס לציר Y וציר ה- X לפני שתנסה מודל מתאים.
- מתאים מודל
- בחר תכנית ניתוח מתאימה.
הערה: רוב התוכניות מתאימות הזמינות מציעות מספר דגמים שניתן להחיל על הולם ונחישות של קבועים קינטית. - ליישם את המודל הפשוט ביותר (אנגמיור) בהנחת 1 הפיכה: אינטראקציה בין 1 אנליטי ויגנד למתאים. אלא אם כן לשכנע את הנתונים זמינים משיטות ניסיוניות אחרות לקיומה של אינטראקציה מורכבת יותר, תמיד להשתמש במודל אנגמיור פשוט.
- בחר תכנית ניתוח מתאימה.
- ביצוע ניסוי הקינטית
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במערכת המתוארת במסמך זה, שבב NiNTA משמש כדי לשתק את טרנספורטר הקרום מתויג 6,7. להיות הומו-דימר, כל טרנספורטר מתויג כפליים, שיפור שלה מחייב את שבב NiNTA. בעקבות טעינת ניקל, יגנד (טרנספורטר של עניין) הוא משותק על Fc = 2, עד ~ 3500 RU (מחזור 2 פרוטוקול, איור 2 א תווית שחורה). ואז, תוך שימוש באותה הזרימה ומשך הזרקה, יגנד B (ליגנד השליטה) מוזרק על Fc = 1, בתחילה להגיע רק עד ~ 3000 RU. כדי לוודא שסכומי חלבון דומים הם משותקים בשני תאי הזרימה; יגנד B נטען עוד, באמצעות הזרקה קצרה יותר, תוך מעקב הטעינה בזהירות עד 3,500 RUS. הצורה 'המדרגות' מייצגת עלייה ההדרגתית במסה על Fc = 1 על כל זריקה (תווית אפורה איור 2 א). ניטור של Fc = על שורת 2-1 מסייע שליטה טעינת יגנד שווה. איור 2 מדגים את Fc = 2חיסור 1, כלומר, הפחתת הערך המקסימאלי RU בFc = 2, ממרווחי הצעד חכם בשווי RU בFc = 1. חשוב לגוון את משך הזריקות 'ligands להשיג טעינה שווה של ligands חקר ושליטה. ולעומת זאת, כאשר הזרקת אנליטי, משך ההזרקה חייב להישמר קבוע לכל הריכוזים המשמשים. איור 3 א ו3B להדגים את התגובות נמדדות על ידי הזרקת 'אנליטי ריק "(כלומר, RB ההשמטה רק אנליטי) במחזורים 3 5, וזריקות אנליטי (במחזורים 4 ו -6). שים לב ששני sensograms מייצג את Fc = 2-1 החיסור. בכל אחד ממחזורי הזרקה זהה אנליטי (ריקה או ריכוז נתון) (3-6) מוחל על שני תאי הזרימה, משותק עם ligands שונה. שתי החזרות להרכיב טובה מאוד, הממחישות את שחזור הגבוה של SPR. תגובה נרשמה בשני המקרים; ~ 3 RU לריק לעומת ~ 40 RU לאנליטי. ערכים אלה מייצגים יחס אות לרעש של 13 ~. כדי להשיג את sensograms הפניה הכפולה, המייצג את התגובה מחייבת הספציפית בלבד, ההזרקה ריקה עכשיו יורדת מהזרקת אנליטי (~ 37 RU, איור 3 ג). Sensogram נרשם מגלה דפוס האופייני של אינטראקציה חולפת. על הזריקה, שלב העמותה מתאפיין בגידול מהיר בכמות אנליטי-מחויב ליגנד, להגיע למצב יציב לאחר ~ 7 שניות. המצב היציב נשמר במשך זמן רב ככל אנליטי מוזרק. כאשר ההזרקה מסתיימת, התאים נשטפים עם RB מפעילה את שלב הניתוק. המורכב במהירות dissociates, וכאנליטי הוא נשטף מיגנד חוזר אות SPR לנקודת התחלה.
כדי לקבל נתונים כמותיים (pre-שיווי משקל וקבועים שיווי משקל), טווח ריכוזי אנליטי מוזרק בכפילויות או triplicates (ראה 8.3.1 בפרוטוקול).
איור איור 1. מהצעדים של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן Ni-נת"ע. ( (B - D) איור של = 2-1 sensogram Fc שנרשם במהלך ניסוי SPR. במחזור 2 כיגנד מתויג מוזרק על פני השטח טעון-Ni, מסה מצטברת בהדרגה. הזרקה מסתיימת כאשר מגיע ערך RU סופי הנע בין 1,000-5,000 RU (תלוי בMW של יגנד). נקודת התחלה נוצר, המשקפת את היציבות מחייבת של יגנד לשבב. במחזור 3, הזרקה ריקה הופיעה, הזרקת הרכיבים של מדגם אנליטי לא כולל רק את אנליטי. בהזרקה זה לעתים קרובות תגובה נמוכה נרשמה (1-5 Rus). במחזור 4 אנליטי מוזרק באמצעות אותו המשטר שההזרקה ריקה. RUS הגדלת לשקף את שינוי המסה על פני השטח, כלומר, המחייב של אנליטי ליגנד. האות מגדילה במהירות ולאחר מכן מישורים כהמערכת דואר מגיעה לשיווי משקל. כאשר ההזרקה מסתיימת, אנליטי dissociates מיגנד, וכתוצאה מכך לירידה באות ולחזור לרמות בסיס.
איור 2. בניטור קו של מקדמי יגנד. (א) עקומות Unsubtracted של טעינת יגנד. יגנד של עניין (ליגנד "") נטען לזרום תא 2 (Fc = 2, שחור) עד שמגיע לרמה הרצויה RU (~ 3500 RU בדוגמא זו). ואז, ליגנד הבקרה השלילי ("B" ליגנד) הוא צעד חכם הועמס על תא זרימת 1 (Fc = 1, אפור) עד רמת RU זהה הוא הגיע. (ב) שתי הזריקות מבוצעות ב() מעקב בזמן אמת כפי Fc = 2-1 חיסור. מעקב זה מאפשר טעינה זהה של ligands של עניין ושליטה.
איור 3. התייחסות זוגית. () כפילויות של חיסור 2-1 (כלומר, Fc = 2-1) של ההזרקה ריקה. (ב) כב (א), רק אנליטי מוזרק. (C) sensograms הסופי לאחר הפחתת תגובת הרקע שמוצגת ב( א ') מהתגובה המדודה ב( B). עקומות אלה המכונים 'כפולים נמחק "או" כפולים בהפניה ". כפילויות הן מחזורים עוקבים.
. איור 4. קביעת קבועי קצב הקינטית על ידי זריקות של ריכוזי אנליטי מרובים (בכפילויות) הקווים השחורים הם המתאימים שחושבו באמצעות פשוט 1: מודל אינטראקציה 1 אנגמיור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR הוא שיטה רגישה מאוד ללמוד אינטראקציות מולקולריות, ולעתים קרובות היא הגישה היחידה שמספקת ניטור של אינטראקציות חולפות (עדיין חשובות) בזמן אמת. דוגמה לכך היא האינטראקציה החולפת המוצגת כאן, שלא ניתן הייתה לזהות בכל דרך אחרת (מבחני נפתחים, מבחני שקיעת יפוזומים 6). יתר על כן, בעוד ששיטות אחרות מוגבלות לשיווי משקל מדידות (אם כמותי או איכותי), SPR הוא אחת הטכניקות רק המודדות גם קינטיקה מראש שיווי המשקל.
הרגישות שלה היא גם האזהרה שלה. sensograms החיובי שגוי נרשם בקלות. לכן מומלץ להקים את קיומה של האינטראקציה בשיטות אחרות לפני שתנסו מדידות SPR. ידע מוקדם של המאפיינים של המערכת (הערכה גסה של K D, יציב לעומת אינטראקציה חולפת) היא מועיל מאוד בהקמת experime SPRNTS והערכה רלוונטי התפקודית של המדידות שהושגו. נושא חשוב שכדאי לזכור לפני שמתחיל מדידות SPR היא איכות דגימות החלבון. SPR הוא רגיש מאוד לאגרגטים ואלה יש להסיר מן שניהם יגנד והכנות אנליטי (על ידי כרומטוגרפיה סינון ג'ל או ultracentrifugation במידת האפשר). מקור נוסף לרעש ואותות שווא יכול לנבוע חוסר התאמה חיץ בין RB והחיץ של אנליטי. זה עשוי להיפתר על ידי dialyzing אנליטי נגד RB, או על ידי שימוש בהכנה מרוכזת מאוד של אנליטי המדולל קפלים רבים (~ 100-1,000 פי) לRB. נתונים חיוביים כוזבים יכולים לנבוע גם מאינטראקציות הלא ספציפיות של אנליטי עם המטריצה של השבב או עם הביקורת השלילית. אינטראקציות אלה זיקה נמוכה, אז לפעמים יכול להימנע על ידי שימוש בריכוזים נמוכים אנליטי. בנוסף, הכללת BSA הנמוך ו / או ריכוזי חומרי ניקוי (0.1 מ"ג / מיליליטר ו / או 0.05-0.1% (W נ /), בהתאמה) לRB ולמדגם אנליטי המוזרק יכולים להקטין אינטראקציות ספציפיות. שינוי התוכן בתא השלילי השליטה (שליטה שלילית שונה) הוא גישה אחרת להתמודדות עם סוגיות מחייבות ספציפיות. לחלופין, באמצעות סוג אחר של שבב יכול להשפיע גם על איכות הנתונים. סוגים שונים של שבבי חיישן זמינים מסחרי, המבוססים על chemistries שונה. בשבב הנפוץ ביותר חיישן (שבב CM-5) carboxymethylated dextran מצורף קוולנטית למשטח זהב. חלבונים יכולים להיות בשילוב קוולנטית אל פני השטח החיישן תוך שימוש במגוון של chemistries משטח פשוט מאוד (רוב אמין או צימוד תיאול נפוץ). עם זאת, בידיים שלנו, בעבודה עם קיבוע קוולנטיים חלבוני קרום לעתים קרובות מניב חפצים ולכן לא מדוברת בשיטה של בחירה. בהקשר של לימוד חלבון קרום, ראוי לציין כי יש שבבים מסחריים שמצופים במולקולות lipophilic. אלה מאפשרים immobilization של חלבונים בממברנה על סביבה כמו-ילידים. יכולים גם להיות מוכנים שבבי חיישן דומים 'בבית'. לתיאור שיטות צימוד אחרים רואה 10,11. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתבסס על השימוש בשבב Ni-נ.ת.ע לקיבוע של המשאית שלו מתויגת, חומרי הניקוי solubilized (אנליטי הוא לא מתויג כדי למנוע אנליטי מחייב את משטח השבב). מניסיוננו 6,12, קבועים הקינטית נובעים מניסויים שנערכו עם שבבי Ni-נ.ת.ע הם בהסכם טוב עם אלה שנקבעו בסביבות כמו-ילידים. למרות שבבי Ni-נ.ת.ע יקרים יחסית, היתרון העיקרי שלהם הוא שהם יכולים להיות חשוף ליגנד ושימוש חוזר. מאות מדידות ניתן לעשות לכל שבב. יתר על כן, הנטייה של יגנד על השבב נקבעה על ידי המיקום של התג שלו ולכן די הומוגנית.
ברגע אינטראקציה נרשמה בהצלחה על ידי SPR, סדרה של בקרות וrepeיש צורך ATS כדי לוודא את תוקפו של אות SPR. אימות של הפרמטרים הבאים עשויה לסייע כדי לאמת את נתוני SRP:
1. ספציפי של אות SPR: בשל הרגישות הגבוהה של SPR, השימוש בפקדים שליליים המתאימים הוא בעלת חשיבות מיוחדת. אינטראקציה שאינה ספציפית נרשמה על ידי SRP יכולה להיות בגלל הספיחה של אנליטי למטריצה. לכן, תא זרימה ריק הוא לעתים קרובות לא האופציה הטובה ביותר מאז תא זרימה עמוס חלבון (ליגנד) הוא לא כימי שווה ערך לתא זרימה ריק. אפשרות טובה יותר היא להשתמש בגרסה לא פעילה מוטציה של יגנד, אחד שידוע שלא יחייבו את אנליטי. לחלופין, אפשר להשתמש אנליטי מוטציה דומה. אם מוטציות אמורות לא תהיינה זמינות חלבון הומולוגי (אך ייחוד מחייב שונה) יכול לשמש 12. דוגמאות לבקרות שליליות טובות ליגנד הומולוגי (כפי שמתוארים כאן), או מוטציה נקודתית באחד מהשותפים באינטראקציה שידועהלבטל את העמותה. מומלץ נוסף ביקורת שלילית היא שינוי של שינוי לאחר translational (למשל, זרחון, מתילציה, גזירת תיאול) כי הוא חיוני לאינטראקציה. לדוגמא, דה-זירחון של טירוזין שהוא חיוני לאינטראקציה תחום SH2. בקרות שליליות אחרות עשויות להיות מערכת ספציפית. בעת שימוש SPR, את החשיבות של שימוש בבקרה שלילית קפדנית לא יכולה להיות מוגזמת.
2. שחזור של אות SPR: SPR הוא שיטה מאוד לשחזור. כאשר כמויות יגנד שווים מועמסות על שבב biosensor וריכוזים שווים של אנליטי מוזרקים החזרות צריכים ליישר בצורה מושלמת (ראה איור 3).
3. התחדשות של המערכת: באינטראקציות עם שיעור ניתוק איטי (ד יא), אנליטי חייבת להיות חשוף מיגנד תוך שמירה על השלמות הפונקציונלית ומבנית של latter. אם ניתוק ו / או התחדשות אינה שלמים, אות SPR תתפרק בהדרגה על הזריקות הבאות של אנליטי. תנאי התחדשות אופייניים שניתן לבדוק הם ריכוזים גבוהים של Mg 2 + (עד 2 מ '), תנאים (לדוגמא, 10 מ"מ pH 2.5 גליצין, 10 מ"מ NaOH), מלח גבוה (עד 4 M NaCl), או חומצי או בסיסיים ריכוז חומר ניקוי גבוה (למשל, 1% DDM). עם זאת, יעילות ההתחדשות של חומרים כימיים אלה (ואחרים) היא מאוד ספציפית למערכת ובכך תנאי regenerations חייבים להיבדק. במקרים מסוימים, האינטראקציה היא כל כך יציבה וחזקה שההתחדשות היא לא שלמה, כמו במקרה של א ' מערכת תחבורת coli ויטמין B 12 (BtuCD-F) 7. בתנאים כאלה, האפשרות היחידה היא להתפשט ליגנד משבב biosensor וטען מחדש אצווה טרי לכל זריקה. במקרים שבהם הניתוק של אנליטי מיגנד הוא התחדשות משטח מהירה ושלמה היא מיותרת(ראה פרוטוקול ואיורים 2-3).
4. חלבוני ממברנה תמיד הם מטוהרים בנוכחות של חומר ניקוי, אשר יכול להשפיע על שיעורי רגישות ותגובת SPR. עם זאת, בניסיון שלנו עם BtuCD, השיעורים הנמדדים הם דומים מאוד. אחד תמיד צריך להשיג ראיות התומכות תוך שימוש בגישות חינם כגון כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC), מבחני נפתחים, assay שקיעת liposome, וכו 'לדוגמא מתאם בין SPR וטכניקות אחרות הוכח למתיונין, ויטמין B 12, ושתי מערכות molybdate 6,12.
קביעה שגויה של קבועי קצב הקינטית לעתים קרובות מתעוררת בתהליך הראוי. ככלל אצבע, תמיד להחיל את אנגמיור 1 הפשוט: מודל האינטראקציה 1 לניסויים הקינטית ניתוח. מודלים מורכבים יותר להניח הנחות נוספות של שינויי קונפורמציה, אנליטי דו ערכי, או הטרוגניות מדגם. הנחות אלה צריכה להיותעשה רק אם היא נתמכת על ידי ראיות מגישות ניסיוניות אחרות. שימו לב שיישום מודלים אלה יהיו ככל הנראה תוצאה בצ'י 2 ערכים טובים יותר הולמים ונמוכים, אבל זה לא צריך להיתפס כעדות על האמינות שלהם. מעלות גבוהות יותר של חופש הניתנות על ידי המודלים מורכבים יותר הן בדרך כלל אחראים לטובה יותר הולם, ולא רלוונטי מכניסטית שלהם.
אחד היתרונות של SPR הוא התאימות הכימית הרחבה שלה, במיוחד בכל קשורים לחומרי ניקוי המשמשים לsolubilize ולטהר חלבוני קרום. עם זאת, יש לי סוכרוז וגליצרול (ופתרונות צמיגים אחרים) שמתווספים לעתים קרובות במהלך תהליך הטיהור של חלבונים בממברנה השפעות דרמטיות על RU. לכן מומלץ להימנע מאלה במידת האפשר, או לפחות להפחית את הריכוז שלהם. בעת השימוש בפתרונות צמיגים, הימנעות חוסר התאמת חיץ הופכת להיות חיונית. הוספת שומנים לחומר ניקוי המכיל RB יכולה להגביר את האות המחייבתאל ידי ככל פי עשרה. עם זאת, מאמץ כזה הוא יקר (עבור רוב השומנים) ונוטה לקצר את אורך החיים של שבבי biosensor.
העצות ופתרון הבעיות שצוינו לעיל עשויות לעזור בעת כיול מערכת חדשה. עם זאת, מערכת נתונה לעתים קרובות דורשת tweaking הספציפי (למשל, בחירה של חומר ניקוי, מלח, pH) על מנת להשיג תוצאות אופטימליות.
SPR כבר זמן רב מוכר כגישה רבת עוצמה וייחודית למדידת אינטראקציות מולקולריות. בשנים האחרונות את הזמינות של פלטפורמות שונות SPR וירידת המחירים שלהם הפכה SPR נגיש יותר. זה הופך במהירות את הגישה סטנדרטית הזהב ללמוד אינטראקציות בין חלבונים, אינטראקציות חלבון-סמים יעד, ולגלות מעכבי מולקולה קטנים עופרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
