Summary
Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.
Introduction
Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas "ponto final" não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são de grandes consequências biológicas. Além disso, a resolução temporal de tais abordagens é extremamente limitada, geralmente ordens de grandeza mais lento do que as taxas de reacção. SPR supera essas deficiências devido à sua sensibilidade e resolução temporal superior a 1,2. SPR é um método livre de marcador, e como talinteracção molecular pode ser medida (desde que as mudanças de massa pode ser detectado). Em adição a PPI, que tem sido extensamente usado para a caracterização da proteína-ligando, proteína-fármaco (ou molécula pequena), de ADN-proteína, e interacções proteína-RNA 3-5. Os resultados são registados e representados graficamente em tempo real, que permite a modificação rápida das condições experimentais e desenho experimental flexível.
O princípio por trás física instrumentos baseados SPR é a utilização de um sistema óptico que mede uma alteração do índice de refracção na superfície do sensor sobre a massa muda 2. Um dos parceiros de interacção ligando (daqui em diante) é imobilizada num chip de matriz de polímero e a segunda molécula (a seguir analito) é feito fluir através da superfície. Ligação do analito ao ligando altera a massa na superfície do chip. Essa mudança de massa é direta e proporcionalmente relacionada a mudanças no índice de refração da superfície. Os resultados são representados graficamente em tempo real eapresentadas como unidades de resposta (RU) como uma função do tempo. Uma tal trama é denominado um sensogram (por exemplo, Figura 1). Desde SPR segue o curso completo do tempo de interacção, pré-equilíbrio constantes de velocidade são derivados, em adição ao equilíbrio afinidades. Tal como pormenorizado abaixo, o comportamento de pré-equilíbrio de um dado sistema mantém muita informação, e fornece uma perspectiva muito diferente do que o equilíbrio sozinho. Uma vez que o sistema é calibrado, as experiências são muito rápidos e exigem apenas pequenas quantidades de material de proteína (microgramas de quantidades de nanogramas). A recolha de informação cinética completa de um dado sistema pode ser conseguida em dia. A elevada sensibilidade da SPR proporciona medições que não são possíveis usando qualquer outra técnica de 6. No entanto, essa alta sensibilidade é uma "faca de dois gumes", pois pode ser uma importante fonte de dados falsos positivos. Qualquer fator que afeta o índice de reflexão é gravado e plotados no sensogram. Como tal, apcontroles ade- deve ser usado para eliminar falsos positivos, e apoio de abordagens complementares é altamente recomendado.
A Figura 1 ilustra a progressão de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor revestido-NTA. O sensogram no painel A mostra a injecção dos iões de níquel sobre a matriz de NTA (dados unsubtracted), e painéis BD exibir os dados depois de subtrair o sinal obtido a partir da célula de controlo negativo. Setas vermelhas e azuis mostram início de injeção e final, respectivamente. A imobilização do ligando para o chip altera gradualmente até que a massa de injecção é terminada. O patamar estável observada após o término da injecção do ligando reflecte a associação estável do ligando à superfície (Figura 1B, ciclo 2). Uma vez que uma linha de base estável é conseguido um tampão é injectado sobre o ligando e a célula de referência (Figura 1B, ciclo 3) .Este injecção serve como um "controlo em branco", e serásubtraída durante a análise. Após a injecção, pequenas alterações são registadas, reflectindo um fluxo de massa através do chip. Em seguida, num ciclo separado (Figura 1B, ciclo 4), o analito é injectado; o aumento gradual no RU representa associação da substância ao ligando. Os sítios de ligação tornar-se gradualmente ocupada até que o equilíbrio seja atingido. Assim que termina a injeção, um declínio nos RUs reflete dissociação do complexo. A partir de tais sensograms constantes da taxa de pré-equilíbrio e equilíbrio podem ser derivadas (ver mais adiante). A Figura 1 representa uma interacção transiente entre o ligando e o analito. Quando a interação é mais estável, a queda no nível de RU é mais lento, refletindo uma menor k d.
Relata-se um experimento SPR teve como objetivo caracterizar a interação entre um transportador de membrana (detergente solubilizado) e seu parceiro funcional proteína 6,7, ligando o seu substrato cognato. O mod escolhidosistema el é um transportador de ATP cassete de ligação (ABC), ModBC-A da Archeaglobus fulgidus. Este sistema foi escolhido por seus resultados altamente reprodutíveis, alta relação sinal-ruído, e clássica "on / off" taxas. Além disso, os transportadores homólogos ABC estão disponíveis para servir como controlos negativos importantes. O transportador, ModBC (ligante A) é extraído a partir da membrana usando detergentes, purificada e imobilizada sobre o chip. Seu parceiro interagindo solúvel, moda, está a analisar. Como um ligando de controlo negativo, um transportador ABC RbsBC diferente é usado ("ligando B").
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Protocol
1. A amostra de proteína e tampão de preparação de
- Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente).
Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-perfeito e mesmo com 8,9 total de extrato. - Tampão de preparação:
- Preparar o tampão do experimento (chamado de "tampão de corrida", ou RB). Para o protocolo descrito aqui, utilizar 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenha em atenção que a escolha da composição do tampão pode ser facilmente modificada de acordo com o sistema estudado.
- Filtre todos os tampões e amostras de proteína utilizando filtros de 0,22 um. Certifique-se de antemão que os filtros estão em proteínascompatível. Em geral, as plataformas SPR recentemente comercializados contêm um de-Gasser in-line; Se este não for o caso, de-gás buffers antes da utilização.
- Dialisar durante a noite ou diluir as amostras contra o RB evitar descasamentos de buffer. A diálise (ou qualquer outro método de troca de tampão) é especialmente aconselhável quando se utiliza produtos químicos de alta viscosidade (por exemplo, sacarose, glicerol, DMSO). Antes de ligar o frasco RB para a entrada da bomba 10 ml manter afastados do RB em um tubo separado.
- Dilui-se o concentrado em estoque ligando RB para uma concentração final de ~ 20 ug / ml. Como regra geral, para a imobilização do ligando estável, use baixas concentrações ligando com injeções mais longos a baixo fluxo, ao contrário de altas concentrações, alto fluxo e injeções mais curtos.
- Dilui-se o analito para o RB para a concentração desejada. Normalmente, testar a gama de concentrações para um sistema de afinidade desconhecida a partir de 10 mM a 10 nM em diluições de dez vezes. Comece semprecom as concentrações mais baixas primeiros.
2. Sensor Chip
- Seleção Chip: Use um ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adequada para captar as proteínas com uma tag oligo-histidina.
- Uso Chip:
- Ao usar um novo chip, tomar o chip fora da bainha, lavar cuidadosamente com água bidestilada (DDW), secar cuidadosamente líquidos remanescentes usando limpadores delicados, e certifique-se de não tocar a superfície da camada de ouro. Coloque o chip na bainha na orientação correta (a inserção é suave quando o chip é colocado corretamente).
- Ao reutilizar um chip, tirar o chip armazenado a partir do buffer, lavar abundantemente com DDW e seque delicadamente como dito acima, e coloque em sua bainha de origem.
NOTA: O acúmulo de material de sucata não específico no chip pode afetar a sua "viabilidade". Isto pode ser monitorizado através da comparação do EF antes da imobilização do ligando e pós-extracção. Embora muitas medições podem serfeito usando o mesmo chip NiNTA, a questão da sua longevidade não é uma 'clara' e varia muito entre as diferentes fichas.
- Chip de ancoragem: Abra a porta do chip sensor e colocar o chip na bainha. Ao usar um novo chip, número de série de entrada do chip para manter registro de uso. Feche a porta e pressione "chip doca '.
3. Ajustes de Temperatura
- Definir a temperatura da célula de chip para 25 ° C (ou a temperatura preferida experimento).
- Opcional: definir o compartimento de amostras de 7 ° C para manter as proteínas estáveis ao longo da experiência.
4. Soluções para carga e decapagem
Preparar as seguintes soluções de carregamento e extracção: 0,5 mM de NiCl2 em RB, EDTA 350 mM em RB (adicionar detergente para solução de EDTA a uma concentração final como em RB), SDS a 0,25% em H 2 O, e HCl 100 mM em H 2 O. Ao utilizar banheira micro-centrífugaes e não SPR tubos designados, não se esqueça de cortar as tampas dos tubos.
5. Prime do Instrumento SPR com RB
6. Iniciar um novo Run
- Definir o caudal que irá ser utilizado durante a experiência. Para obter os resultados descritos aqui definir o fluxo para 50 mL / min.
NOTA: Este parâmetro pode ser modificado durante o experimento. - Definir os caminhos de fluxo e referência subtração. Para obter os resultados descritos aqui definidos os caminhos Fc = 1 e Fc = 2, subtração Fc = 2-1.
Nota: O programa irá exibir em tempo real a subtração de duas células medidos. Tenha em mente que este parâmetro não pode ser alterado durante o experimento. - Selecione o suporte de amostras adequado (que pode influenciar o consumo de volume da amostra).
- Salve o arquivo de resultados.
7. Experimento Cycles
Cada experiência é composto de ciclos, manter um registro claro das injeções feitas em eAciclo de ch, e separar o carregamento dos ligantes, injeção em branco do buffer, ea injeção analito em ciclos diferentes.
- Ciclo 1: preparação Chip e níquel carregamento
- Certifique-se que o fluxo de caminhos e são definidas de acordo com a etapa 6.1 e 6.2.
- Injectar EDTA 350 mM para 1 min para lavar as sobras.
- Definir fluxo de 10 ul / min.
- Injectar 0,5 mM de NiCl2 durante 2 min.
NOTA: Agora, a resina de chip é revestido por iões de níquel.
- Ciclo 2: Ligantes imobilização
- Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 2.
- Injectar Um ligando até atingir valores UC que são 10-20 vezes do seu peso molecular. Por exemplo, carregar um ligante de 50 kDa para 500-1.000 RUs. Mantenha um registro do valor RU alcançado.
- Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 1.
- Injectar ligando B (controlo) até ao mesmo valor de EF enquanto que ligando o monitor A. sensogram subtracção (Fc = 2-1) em linha para ajudar a controlar acomprimento injecção.
- Conjunto de fluxo de 50 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, lavar o sistema para 5-20 min, até a linha de base (Fc = 2-1) estabiliza.
- Ciclo 3: injeção em branco. Esta injecção irá servir para subtracção do branco, por conseguinte, incluir todos os componentes que vão ser injectados com a substância a analisar, com excepção do próprio analito.
NOTA: Injecção comprimento pode variar dependendo do tempo que demora a atingir o equilíbrio (planaltos sinal).- Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, Fc = 2-1 subtracção.
- Insira o comando 'esperar' (referido a seguir como "esperar") durante 30 segundos (para ter uma linha de base estável).
- Injectar 15 seg RB.
NOTA: A duração da injecção variará entre sistemas diferentes, dependendo de suas pré-equilíbrio constantes cinéticas (principalmente o k a). - Espere 120-600 sec para gravar a fase de dissociação.
NOTA: A duração deste passo varia de acordo com o
- Ciclo 4: Injeção Analyte
- Copiar / colar as condições exatas usadas na injeção de referência (ciclo 3), de modo que essas duas injeções podem ser depois subtraído. Alterar a localização do slot no rack da que contém a solução de controle para aquele que detém a solução analisar. Escolha uma concentração que é um pouco acima do K D esperado. Se nenhum conhecimento prévio está disponível, escolher um? M como um bom ponto de partida.
- Ciclo 5: injeção de tampão
- Repita ciclo 3.
- Ciclo 6: injeção Analyte
- Repita o ciclo de 4.
- Ciclo 7: Chip despir
- Definir fluxo de 50 ul / min. </ Li>
- Injectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
- Injectar SDS a 0,25% durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
- Se o nível da linha de base não for atingido, injetar HCl 100 mM durante 1 min como da fase de extracção adicional.
- Insira o comando 'run final' que muda para o modo de espera.
- Armazenamento Chip
- Desencaixar o chip sensor e levá-la para fora do instrumento.
- Leve o sensor fora da bainha, evite tocar a superfície, enxagúe com DDW, e coloque em um tubo de 50 ml contendo RB. Armazenar a 4 ° C.
8. análise de dados usando o software designado Avaliação
- Execute as seguintes etapas para processar os dados brutos obtidos por SPR antes derivação dos parâmetros cinéticos.
- Usando o software de avaliação, abertao arquivo de resultados, selecione ciclos 3-6 Fc = 2-1 (referência de dados subtraídos).
- Axis mudança:
- Ciclos de Exibição 3-6.
- Zero o valor do eixo Y da linha de base (o tempo de espera de 30 segundos em cada ciclo inicial) para todos os quatro curvas.
- Alinhamento do eixo X- das quatro curvas. Escolha recursos pronunciados (por exemplo, pontos de início de injeção ou acabamento) para alinhar perfeitamente os quatro curvas ao longo do eixo-X. Definir a hora de início de objecto de análise (ou tampão de controlo) a zero.
- Subtração de Referência
- Subtrair a resposta de base por subtracção da curva do ciclo 3 a partir da curva de ciclo curva 4 e 5 do ciclo a partir da curva de ciclo 6. Utilização da operação de subtracção curva que pode ser encontrado no eixo Y desloca menu.
ATENÇÃO: É importante realizar esta etapa em que anula quaisquer componentes inespecíficos (não relacionados à substância) que podem ter influenciado o índice de refração superfície.- Salve as curvas subtraídos em tele folha do projeto com um nome diferente.
- Referem-se a estas curvas como "duplamente curvas subtraídos": o primeiro é a subtracção 2-1 subtracção realizada em ambas as injecções, e o segundo é a subtracção de uma curva de outro.
NOTA: Essa referência dupla é o padrão ouro em experimentos SPR. - Sobrepor as curvas subtraídos realizando mudança de eixo, como explicado antes.
- Subtrair a resposta de base por subtracção da curva do ciclo 3 a partir da curva de ciclo curva 4 e 5 do ciclo a partir da curva de ciclo 6. Utilização da operação de subtracção curva que pode ser encontrado no eixo Y desloca menu.
- Determinação de constantes cinéticas e os ajustes do modelo
- Realização de uma experiência cinética
- Injectar uma série de concentrações de analito 6-7 para ter um confiável de dados para determinação de constantes cinéticas. Escolha concentrações de analito a partir de 10 vezes superior a 10 vezes inferior à estimativa K D, em diluições 2-3-dobra. Incluir o "zero" a concentração, mais tarde utilizado para subtração dupla referência (ver acima). Realizar injeções em triplicata e em ordem aleatória.
- Alinhare subtrair todas as curvas em relação ao eixo Y e eixo-X antes de tentar modelo de ajustamento.
- Montagem Modelo
- Selecione um programa de análise adequado.
NOTA: A maioria dos programas de adaptação disponíveis oferecem vários modelos que podem ser aplicadas para a montagem e determinação das constantes cinéticas. - Aplicar o modelo mais simples (Langmuir) assumindo uma reversível 1: 1 a interação entre o analito e o ligando para o encaixe. A menos que convencer os dados estão disponíveis a partir de outros métodos experimentais para a existência de uma interação mais complexa, use sempre o modelo de Langmuir simples.
- Selecione um programa de análise adequado.
- Realização de uma experiência cinética
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Representative Results
No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His 6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se Fc = 1, inicialmente, atingindo apenas até um ~ 3000 RU. Para certificar-se que os valores de proteína similares são imobilizados em ambas as células de fluxo; ligando B é ainda mais carregado, usando injeção de mais curto, enquanto monitora cuidadosamente a carga até 3.500 RUs. A forma 'escadas' representa o aumento gradual da massa em Fc = 1, em cada injecção (etiqueta cinza Figura 2A). Um monitoramento on-line de Fc = 2-1 ajuda a controlar o carregamento igual ligando. Figura 2B demonstra o Fc = 2-1 subtração, ou seja, subtraindo o valor máximo RU em Fc = 2, a partir dos incrementos-wise no valor RU em Fc = 1. É importante variar a duração de injecções dos ligandos para atingir igual carregamento dos ligandos investigados e de controlo. Em contraste, quando se injecta o analito, a duração da injecção deve ser mantido constante para todas as concentrações usadas. A Figura 3A e 3B mostram as respostas medidas por injecção de um "analito em branco" (isto é, RB, omitindo apenas o analito) e nos ciclos 3 5, e as injecções de analito (em ciclos de 4 e 6). Note-se que ambos os sensograms representam Fc = 2-1 subtracção. Em cada um dos ciclos (3-6) de uma injecção analito idêntica (em branco ou uma determinada concentração) é aplicada sobre as duas células de fluxo, com diferentes ligandos imobilizados. As duas repetições sobrepor muito bem, demonstrando a alta reprodutibilidade da SPR. Uma resposta é gravada em ambos os casos; ~ 3 RU para o espaço em branco contra ~ 40 EF para o analito. Estes valores representam a relação sinal-ruído de ~ 13. Para obter os sensograms dupla referenciada, que representam apenas a resposta de ligação específico, a injecção em branco agora é subtraído a partir do analito injecção (~ 37 RU, Figura 3C). O sensogram gravado revela o padrão característico de uma interacção transiente. Após a injecção, a fase de associação é caracterizada por um rápido aumento da quantidade de analito ligado ao ligando, depois de atingir o estado estacionário ~ 7 segundos. O estado estacionário é mantida durante o tempo que o analito é injectado. Quando termina a injecção, as células são lavadas com RB desencadeando a fase de dissociação. O complexo se dissocia-se rapidamente, e como o analito é lavado a partir do ligando do sinal de SPR retorna à linha de base.
Para obter dados quantitativos (pré-equilíbrio e constantes de equilíbrio), uma gama de concentrações de analitos é injetado em duplicata ou triplicata (ver 8.3.1 no protocolo).
Figura 1. Ilustração dos passos de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor de Ni-NTA. (A (B - D) Ilustração do Fc = 2-1 sensogram gravado durante um experimento SPR. No ciclo 2, como o ligando marcado com His é injectado sobre a superfície de Ni carregada, massa acumula gradualmente. Injeção é terminada quando se atinge um valor final RU variando entre 1,000-5,000 RU (dependendo MW do ligando). Uma linha de base é formado, o que reflecte a ligação estável do ligando para o chip. No ciclo 3, a injeção em branco é pré-formado, injetando os componentes da amostra analito excluindo apenas a analisar. Neste injeção muitas vezes uma baixa resposta é registrado (1-5 RUs). No ciclo de 4 a substância é injetada usando o mesmo regime que a injeção em branco. O aumento EF reflectir a variação da massa na superfície, ou seja, a ligação do analito ao ligando. O sinal aumenta rapidamente e, em seguida, planaltos como the sistema atinge o equilíbrio. Quando termina a injecção, o analito se dissocia do ligando, o que resulta em uma diminuição do sinal e voltar aos níveis da linha de base.
Figura 2. No monitoramento de linha de cargas ligando. (A) curvas Unsubtracted de carga ligando. O ligando de interesse (Ligando "A") é carregado a célula de fluxo 2 (FC = 2, preto) até atingir o nível desejado RU (~ 3500 RU, neste exemplo). Em seguida, o ligando de controlo negativo (ligando "B") é passo a passo, carregou-se uma célula de fluxo (Fc = 1, cinzento), até um nível idêntico RU é atingido. (B) As duas injecções realizadas em (A) monitorado em tempo real como um Fc = 2-1 subtracção. Este acompanhamento facilita carga idêntica de ligantes de interesse e controle.
Figura 3. referenciamento duplo. (A) Os duplicados de uma subtracção de 2-1 (ou seja, Fc = 2-1) da injecção em branco. (B) Como em (A), apenas analito é injectado. (C) sensograms finais após a subtracção da resposta de base mostrado em (A) a partir da resposta medida em (B). Estas curvas são referidos como 'double inibida "ou" duplo referenciado ". As duplicatas são de ciclos sequenciais.
. Figura 4. Determinação das constantes de velocidade por injeções de várias concentrações de analitos (em duplicatas) As linhas pretas são os ajustes que foram calculados usando um simples 1: 1 modelo de interação Langmuir.
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Discussion
SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação 6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é uma das únicas técnicas que medem também a cinética de pré-equilíbrio.
Sua sensibilidade é também a sua ressalva. Sensograms falso-positivos são facilmente gravado. Portanto, é recomendável para estabelecer a existência da interação com outros métodos antes de tentar medições SPR. O conhecimento prévio das características do sistema (análise grosseira da K D, estável vs. interação transitória) é muito útil na criação de SPR experimeNTS e avaliar a relevância funcional das medidas obtidas. Uma questão importante a ter em mente antes de iniciar as medições SPR é a qualidade das amostras de proteína. SPR é altamente sensível aos agregados e estes devem ser removidas tanto o ligando e as preparações de analito (por cromatografia de filtração em gel ou ultracentrifugação quando possível). Outra fonte de ruído e sinais falsos pode decorrer de descasamentos tampão entre a RB e o tampão do analito. Isto pode ser resolvido através da diálise contra o analito a RB, ou usando uma preparação altamente concentrada da substância a analisar que é diluída muitas dobras (~ 100-1.000 vezes) no RB. Dados falsos positivos também podem resultar de interacções não específicas da substância a analisar com matriz do chip ou com o controlo negativo. Estas interacções são de baixa afinidade, de modo que, por vezes, pode ser evitado pelo uso de baixas concentrações de analito. Além disso, a inclusão de BSA baixo e / ou concentrações de detergente (0,1 mg / ml e / ou 0,05-0.1% (W / v), respectivamente) para o RB e o analito da amostra injectada pode diminuir as interacções não específicas. Alterar o conteúdo da célula de controle negativo (diferente controle negativo) é uma outra abordagem para lidar com problemas de ligação não específica. Em alternativa, utilizando outro tipo de chip também pode afetar a qualidade dos dados. Vários tipos de chips sensores estão disponíveis comercialmente, com base em diferentes químicas. No chip mais comumente utilizado sensor (chip CM-5) dextrano carboximetilada está covalentemente ligado a uma superfície de ouro. As proteínas podem ser acoplados de forma covalente à superfície do detector utilizando uma variedade de químicas de superfície muito simples (mais comumente amina ou tiol de acoplamento). No entanto, em nossas mãos, quando se trabalha com proteínas de membrana imobilização covalente frequentemente produz artefatos e, portanto, não é o método de escolha. No contexto do estudo de uma proteína de membrana, é de notar que há fichas comerciais que são revestidas com moléculas lipofílicas. Estes permitem a IMMOBilization de proteínas da membrana para um ambiente semelhante à nativa. Similar sensores chips também podem ser preparados 'em casa'. Para uma descrição de outros métodos de acoplamento ver 10,11. O protocolo aqui descrito baseia-se na utilização de chip de Ni-NTA para a imobilização de um His, detergente transportador solubilizado (o analito não é marcada com His para evitar a ligação à superfície do chip analito). Em nossa experiência 6,12, constantes cinéticas derivados de experimentos realizados com chips de Ni-NTA estão em boa concordância com os valores determinados em ambientes nativo-like. Embora chips de Ni-NTA são relativamente caro, a sua principal vantagem é que eles podem ser retirados do ligando e re-utilizado. Centenas de medições pode ser feito por chip. Além disso, a orientação do ligando no chip é determinado pela posição da cauda de His e é, portanto, bastante homogénea.
Uma vez que uma interacção foi registada com sucesso por SPR, uma série de controlos e repeats são necessários para verificar a validade do sinal de SPR. Verificação dos parâmetros a seguir podem ajudar a validar os dados SRP:
1. Especificidade do sinal SPR: devido à alta sensibilidade da SPR, o uso de controles negativos apropriadas é de especial importância. Interacção não-específica gravado por SRP pode ser devido à adsorção de um analito para a matriz. Portanto, uma célula de fluxo vazio muitas vezes não é a melhor opção uma vez que uma célula de fluxo carregado com proteína (o ligando) não é quimicamente equivalente a uma célula de fluxo vazio. A melhor opção é usar uma variante mutante inativo do ligando, um que não é conhecida a vincular a analisar. Alternativamente, pode-se utilizar um analito mutado de forma semelhante. Se esses mutantes não estão disponíveis uma proteína homóloga (mas de diferente especificidade de ligação) pode ser usado 12. Os exemplos de bons controlos negativos são um ligando homóloga (tal como descrito aqui), ou uma mutação pontual de um dos parceiros interactuantes que é conhecida aabolir a associação. Outro recomendado controlo negativo é a alteração de uma modificação pós-tradução (por exemplo, fosforilação, metilação, derivação tiol), que é essencial para a interacção. Por exemplo, de-fosforilação de tirosina que é essencial para a interacção do domínio SH2. Outros controles negativos pode ser específica do sistema. Ao usar SPR, a importância de usar controles estritos negativos não pode ser exagerada.
2. A reprodutibilidade do sinal de SPR: SPR é um método extremamente reprodutível. Quando quantidades iguais de ligando são carregados no chip biossensor e concentrações iguais de substância a analisar são injectadas as repetições deve alinhar perfeitamente (ver Figura 3).
3. Regeneração do sistema: em interacções com uma taxa de dissociação lenta (k d), o analito tem que ser removido a partir do ligando, preservando a integridade estrutural e funcional do latter. Se a dissociação e / ou regeneração são incompletos, o sinal de SPR irá decair gradualmente mediante injecções subsequentes do analito. Regeneradores condições típicas que podem ser testadas são concentrações elevadas de Mg 2+ (até 2 M), as condições ácidas ou básicas (por exemplo, 10 mM de glicina de pH 2,5, 10 mM de NaOH), elevado teor de sal (até 4 M de NaCl), ou alta concentração de detergente (por exemplo, 1% DDM). No entanto, a eficácia destes reagentes de regeneração (e outros) e assim é altamente condições regenerações deve ser testado específicas do sistema. Em alguns casos, a interacção é muito forte e estável que a regeneração nunca é completa, como no caso do E. coli vitamina B 12 sistema de transporte (BtuCD-F) 7. Sob tais condições, a única opção é para retirar o ligando a partir do chip biossensor e recarregar um lote fresco para cada injecção. Nos casos em que a dissociação do analito a partir do ligando é a regeneração da superfície rápida e completa é desnecessário(Ver protocolo e as Figuras 2-3).
4. As proteínas da membrana são sempre purificado na presença de detergente, o que pode afectar a sensibilidade ea reacção SPR. No entanto, em nossa experiência com BtuCD, as taxas medidas são muito semelhantes. A gente sempre precisa de obter provas que sustentam o uso de abordagens complementares, tais como cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), ensaios suspensos, ensaio de sedimentação de lipossomas, etc. Por exemplo, uma correlação entre SPR e outras técnicas tem sido mostrados para a metionina, vitamina B 12, e dois sistemas de molibdato 6,12.
Determinação errada dos constantes cinéticas surge muitas vezes durante o processo de montagem. Como regra geral, aplicar sempre o simples Langmuir 1: modelo de interação 1 para análise de experimentos cinéticos. Os modelos mais complexos fazer suposições adicionais de mudanças de conformação, analito bivalente, ou heterogeneidade da amostra. Estes pressupostos deve serfeita apenas se suportado por evidências de outras abordagens experimentais. Note-se que a aplicação destes modelos provavelmente resultará em Chi 2 valores melhor montagem e inferiores, mas isso não deve ser visto como um testemunho para a sua fiabilidade. Os maiores graus de liberdade oferecidas pelos modelos mais complexos são geralmente responsáveis pela melhor montagem, melhor que a sua relevância mecanicista.
Uma das vantagens do SPR é a sua ampla compatibilidade química, especialmente no que diz respeito aos detergentes que são usados para solubilizar e purificar proteínas de membrana. No entanto, sacarose e glicerol (e outras soluções viscosas) que são muitas vezes adicionados durante o processo de purificação de proteínas da membrana ter efeitos dramáticos sobre o RU. Assim, recomenda-se que seja possível evitar estes se, ou pelo menos reduzir a sua concentração. Ao usar soluções viscosas, evitando incompatibilidade tampão torna-se essencial. Adição de lipídios a um detergente contendo RB pode amplificar o sinal de ligaçãoal em até dez vezes. No entanto, um tal esforço é caro (para a maioria dos lípidos) e tende a diminuir a vida útil dos chips biossensores.
As dicas e resolução de problemas listados acima podem ajudar durante a calibragem de um novo sistema. No entanto, um dado sistema, muitas vezes requer configuração específica (por exemplo, escolha do detergente, sal, pH) para conseguir resultados óptimos.
SPR tem sido reconhecida como uma abordagem exclusiva e poderosa para medir as interações moleculares. Nos últimos anos, a disponibilidade de várias plataformas da SPR e seus preços em declínio fez SPR mais acessível. Ele está rapidamente se tornando o método padrão ouro para estudar as interações proteína-proteína, alvo interações proteína-drogas, e na descoberta de inibidores pequena vantagem molécula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
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- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
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