Summary
Поверхностного плазмонного резонанса (SPR) представляет собой метод, свободной от этикетки для обнаружения био-молекулярных взаимодействий в реальном времени. При этом протокол для мембранного белка: эксперименте взаимодействие с рецептором описана, обсуждая плюсы и минусы этого метода.
Introduction
Белок-белковых взаимодействий (PPI); Образование и диссоциация белковых комплексов, являются ключевые события во многих биологических процессах (например, репликация, транскрипция, трансляция, сигнализация, клетка-клетка связи). Полу-количественные исследования ИПП часто выполняются с использованием выпадающее меню или иммуно-осадков эксперименты. Тем не менее, эти (и подобные) методы ограничены в диапазоне от сродства, которые могут быть измерены (низкий микромолей и более высоким сродством) в связи с этапов промывки, которые присущи таких методов. Такие методы "конечной точки" не может определить переходные или низким сродством взаимодействия, которые часто больших биологических последствий. Кроме того, временное разрешение таких подходов является крайне ограниченным, как правило, порядков медленнее, чем темпы реакции. SPR преодолевает эти недостатки из-за его повышенной чувствительностью и превосходной временным разрешением 1,2. SPR представляет собой способ, свободной от этикетки, и, таким образоммолекулярное взаимодействие может быть измерена (при условии, что изменения массы могут быть обнаружены). В дополнение к ИПП, он широко используется для характеристики белка-лиганд, белок-лекарство (или малую молекулу), белок-ДНК и белок-РНК взаимодействий 3-5. Результаты записываются и нанесены в реальном времени, что позволяет быстрое изменение условий эксперимента и гибкой эксперимента.
Физический принцип позади инструментов, основанных SPR является использование оптической системы, которая измеряет изменение показателя преломления на поверхности датчика при изменении массы 2. Один из взаимодействующих партнеров (далее лиганд) иммобилизуют на чипе полимерной матрицы и второй молекулы (далее аналита) протекает по поверхности. Аналит связывания с лигандом изменяет массу на поверхности чипа. Это изменение массы непосредственно и пропорционально связан с изменением показателя преломления поверхности. Результаты приведены в реальном времени ипредставлены в виде единиц отклика (RU) как функции времени. Такой участок называется Сенсограмма (например, Рисунок 1). Поскольку SPR следующим полный временной ход взаимодействия, предварительно равновесные константы кинетической скорости получены, в дополнение к равновесию аффинности. Как подробно описано ниже, предварительно равновесное поведение данной системы имеет много информации, и обеспечивает очень различные точки зрения, чем только равновесия. После того, как система калибруется, эксперименты очень быстро и требуют только небольших количеств белкового материала (мкг на нг количество). Сбор полную кинетическую информацию о данной системе может быть достигнуто в дни. Высокая чувствительность SPR обеспечивает измерения, которые невозможно с помощью любого другого способа 6. Тем не менее, это высокая чувствительность является "палка о двух концах", поскольку это может быть основным источником ложных положительных данных. Любой фактор, который влияет на отражающую индекс записывается и отображается на Сенсограмма. В качестве такого, APуправления щих образовательных должны быть использованы для устранения ложных срабатываний и поддержки со стороны взаимодополняющих подходов Настоятельно рекомендуется.
Рисунок 1 иллюстрирует развитие ППР эксперимента с использованием НТА-покрытием сенсорного чипа. Сенсограмма в панели А показан инъекции ионов никеля по матрице NTA (безвычитательных данных), и панели BD отображать данные после вычитания сигнала, извлеченного из отрицательного клетки управления. Красные и синие стрелки показывают начало и конец впрыска, соответственно. Иммобилизация лиганда на чипе постепенно изменяет массу до инъекции не будет прекращено. Стабильный плато наблюдается после прекращения введения лиганда отражает стабильную ассоциацию лиганда к поверхности (фиг 1B, цикл 2). После того, как стабильный базовый достигается буфер вводят в течение лиганда и опорной ячейки (рис 1B, цикл 3) .Этот инъекции служит в качестве "пустой" контроль, и будетвычитается при анализе. После инъекции, незначительные изменения записываются, отражающие поток массы через чип. Затем в отдельном цикле (Фиг.1В, цикл 4), аналит вводится; Постепенное увеличение RU представляет собой объединение анализируемого вещества в с лигандом. Сайты связывания становятся постепенно заняли пока равновесие не будет достигнуто. Как только заканчивается инъекции, снижение на Руси отражает диссоциацию комплекса. Из таких sensograms константы скорости предравновесных и равновесные могут быть получены (см ниже). Рисунок 1 изображает кратковременное взаимодействие между лигандом и анализируемым веществом. Когда взаимодействие является более стабильным, снижение уровня RU медленнее, отражая более низкую Уб.
Здесь мы опишем ППР эксперимент по характеризующие взаимодействие между мембраной транспортера (моющее средство растворяют) и его функциональная партнера, его родственным субстрат-связывающий белок 6,7. Выбран модСистема Эл ATP связывающего кассетного (ABC) транспортер, ModBC-из Archeaglobus fulgidus. Эта система была выбрана для его высокую воспроизводимость результатов, высокое отношение сигнал-шум, и классический "вкл / выкл" ставок. Кроме того, гомологи ABC транспортеры доступны в качестве важных отрицательных контролей. Транспортер, ModBC (лиганд) извлекают из мембраны с использованием моющего средства, очищают и иммобилизованного на чипе. Его растворим взаимодействия партнер Moda, является анализируемого вещества. В качестве отрицательного лиганда управления, отличается ABC Transporter RbsBC используется ("лиганд B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Белок выборки и подготовки буфера
- Подготовка образца: очистить белки, представляющие интерес, и убедиться, что все агрегаты будут удалены, путем инъекции белка до эксперимента на колонку для гель-фильтрации или центрифугирования (обычно 10 мин при 100000 мкг достаточно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, желательно, очень чистые белковые препараты не обязательным. SPR успешно используется с менее чем совершенный очищения и даже с общей экстракта 8,9. - Подготовка буфера:
- Подготовка буфера эксперимента (называемая "работает буфер", или Rb). Для протокол, описанный здесь, используют 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 0,05% (вес / объем) DDM (н-додецил β-D-maltoside). Имейте в виду, что выбор буфера композиции может быть легко изменены в соответствии с исследуемой системы.
- Фильтровать все буферы и образцы белка с использованием 0,22 мкм фильтры. Убедитесь, что заранее, что фильтры белково-совместимы. В общем, последнее время на рынке платформ SPR содержать в линию де-Gasser; если это не так, то де-газа буферы перед использованием.
- Диализировать ночь или разбавления проб против РБ, чтобы избежать буферных несоответствия. Диализ (или любой другой метод замены буфера) особенно целесообразно при использовании химических веществ с высокой вязкостью (например, сахароза, глицерин, ДМСО). Перед подсоединением бутылку RB на входе в насос сохранить сторону 10 мл РБ в отдельную пробирку.
- Развести концентрированного состава лиганда в РБ до конечной концентрации ~ 20 мкг / мл. Как правило, для стабильного лиганда иммобилизации, использовать низкие концентрации лиганда с более длинными инъекций при низком расходе, в отличие от высоких концентрациях, высокого потока и более коротких инъекций.
- Развести аналита в РБ до желаемой концентрации. Как правило, проверить диапазон концентраций для системы неизвестной близости от 10 мкм до 10 нм в десять-кратные разведения. Всегда начинайтес более низких концентрациях первого.
2. Sensor Chip
- Выбор Чип: Используйте нитрилацетатом (НТА) в сочетании чип подходит для фиксации белки с олиго-гистидин тег.
- Использование чипа:
- При использовании нового чипа, взять чип из футляра, промойте аккуратно с двойным дистиллированной воде (DDW), высушить тщательно оставшиеся жидкости, при деликатных дворники, и убедитесь, что не прикасаться к поверхности слоя золота. Поместите чип обратно в ножны в правильной ориентации (вставка гладкая, когда чип должным образом размещены).
- При повторном чип, вынуть хранится обломок из буфера, тщательно промыть DDW и сухой мягко, как указано выше, и поместите в исходное оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: накопление неспецифической нежелательной материала на чипе может повлиять на его "жизнеспособности". Это можно контролировать путем сравнения РУС перед лиганда иммобилизации и после отгонки. Хотя многие измерения могут бытьсделано, используя тот же чип NiNTA, вопрос о его долговечности не "ясна", и сильно зависит от различных чипов.
- Чип док: Откройте дверь сенсорного чипа и поместите чип в ножны. При использовании нового чипа, ввода серийного номера чипа вести учет использования. Закройте дверь и нажмите 'док чип.
3. Температурные режимы
- Установка температуры чипа клеток до 25 ° С (или в предпочтительном температуре эксперимента).
- Дополнительно: установлен отсек образцы в 7 ° C, чтобы белки стабильны в течение всего эксперимента.
4. Решения для погрузки и разгрузки
Подготовьте следующие решения для погрузки и зачистки: 0,5 мМ NiCl 2 в РБ, 350 мМ ЭДТА в РБ (добавить моющее средство в растворе EDTA до конечной концентрации, что и в РБ), 0,25% ДСН, в H 2 O и 100 мМ HCl в Н 2 O. При использовании микро-центрифуги ваннах годов, и не SPR назначенных трубы, не забудьте отрезать крышки трубок.
5. Премьер-SPR прибор с РБ
6. запуск нового
- Указан расход, который будет использоваться в ходе эксперимента. Для получения результатов, описанных здесь, установить поток в 50 мкл / мин.
Примечание: Этот параметр может быть изменен во время эксперимента. - Определить пути потока и справочную вычитание. Для получения результатов, описанных здесь, поставленных пути Fc = 1 и FC = 2, вычитание FC = 2-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа будет отображать в режиме реального времени вычитание двух измеренных клеток. Имейте в виду, что этот параметр не может быть изменен во время эксперимента. - Выберите подходящий образец стойку (это может повлиять на образец объемного расхода).
- Сохраните файл с результатами.
Циклы 7. Эксперимент
Каждый эксперимент состоит из циклов, сохранить ясную запись инъекций, сделанных в EAч цикл, и отделить лигандов "Загрузка пустой инъекции буфера, и анализируемый инъекции в разных циклах.
- Цикл 1: подготовка Чип и никель загрузки
- Убедитесь, что поток и пути установлены согласно шагу 6.1 и 6.2.
- Вводите 350 мМ ЭДТА в течение 1 мин, чтобы смыть остатки.
- Установите поток до 10 мкл / мин.
- Внедрить 0,5 мМ NiCl 2 в течение 2 мин.
Примечание: В настоящее время чип смолы покрыт ионов никеля.
- Цикл 2: лиганды иммобилизации
- Набор потока до 15 мкл / мин, направление потока FC = 2.
- впрыскивает лиганда A до достижения RU значения, которые в 10-20 раз от его молекулярной массы. Например, можно загрузить лиганд 50 кДа до 500-1000 Руси. Записывайте значения RU достигнута.
- Набор потока до 15 мкл / мин, направление потока FC = 1.
- Вводите лиганда B (контроль) до того же значения RU, как лиганда A. Монитор вычитание Сенсограмма (FC = 2-1) он-лайн, чтобы помочь управлятьДлина инъекции.
- Набор потока до 50 мкл / мин, направление потока Fc = 1 и FC = 2, не мыть системы 5-20 мин до исходного уровня (Fc = 2-1) стабилизируется.
- Цикл 3: Blank инъекции. Это инъекции будет служить для заготовки вычитания, следовательно, включают все компоненты, которые будут введены с анализируемым веществом, за исключением самого аналита.
Примечание: длина впрыска может изменяться в зависимости от времени, необходимого для достижения равновесия (плато) сигнала.- Набор потока до 15 мкл / мин, направление потока Fc = 1 и FC = 2, FC = вычитания 2-1.
- Вставьте команду 'ждать' (называемый далее как «ждать») в течение 30 сек (чтобы иметь стабильный базовый уровень).
- Подайте 15 сек РБ.
ПРИМЕЧАНИЕ: длительность впрыска будет варьироваться между различными системами, в зависимости от их предравновесных кинетических констант (в основном K A). - Подождите 120-600 сек регистрировать фазу диссоциации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина этой стадии варьируется в зависимости от
- Цикл 4: Аналит впрыска
- Копировать / вставить точные условия, используемые в справочной инъекции (цикл 3) Таким образом, эти две инъекции в дальнейшем могут быть вычтены. Изменение расположения слота в стойке с одной холдинговой управления решение одной, которая содержит анализируемый раствор. Выберите концентрацию, которая немного выше ожидаемого K D. Если никаких предварительных знаний не доступна, выберите 1 мкм, как хорошей отправной точкой.
- Цикл 5: Буфер впрыска
- Повторите цикл 3.
- Цикл 6: Аналит впрыска
- Повторите цикл 4.
- Цикл 7: Chip сдирать
- Установите поток до 50 мкл / мин. </ Li>
- Вводите 350 мМ ЭДТА в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще два раза. Не используйте одну инъекцию 3 мин, так как это может привести к повреждению чипа.
- Вводите 0,25% SDS в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще два раза. Не используйте одну инъекцию 3 мин, так как это может привести к повреждению чипа.
- Если исходный уровень не достигнут, вводят 100 мМ HCl в течение 1 мин в качестве дополнительного стадии десорбции.
- Вставьте команду 'конец запуске', которая переключает в режим ожидания.
- Хранение Chip
- Расстыкуйтесь сенсорного чипа и вывести его из прибора.
- Возьмите датчик из ножен, не прикасаясь к поверхности, промыть DDW, и место в 50 мл пробирку, содержащую РБ. Хранить при 4 ° С.
8. Анализ данных с использованием Места Оценка программного обеспечения
- Выполните следующие действия, чтобы обработать исходные данные, полученные SPR до вывода кинетических параметров.
- Использование программного обеспечения оценки, открытыйФайл результатов, выберите циклы 3-6 Fc = 2-1 (ссылка вычитается данных).
- Сдвига по оси:
- Циклы Показать 3-6.
- Нулевая стоимость Y-ось исходных данных (начальная 30 сек время ожидания в каждом цикле) до всех четырех кривых.
- Совместите оси X- четырех кривых. Выберите выраженные черты (например, шипы начала впрыска или отделки) в полном совместите четыре кривые вдоль оси Х. Установите время начала анализируемого (или контрольного буфера) до нуля.
- Ссылка вычитание
- Вычитания фона ответа путем вычитания кривой цикла 3 из кривой цикла 4 и кривой цикла 5 из кривой цикла 6. Использование Операция вычитания кривой, которая может быть найдена в Y-оси смещается меню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить этот шаг, поскольку это аннулирует любые неспецифические компоненты (не связанных с анализируемым), которые могли повлиять на индекс поверхность преломления.- Сохранить вычитается кривые в Т-он лист проекта под другим именем.
- Обратитесь к этим кривым, как «дважды вычитается кривых": первый вычитание 2-1 вычитание выполняется на обоих инъекций, и второй вычитание одной кривой от другой.
Примечание: данное дважды ссылок является золотым стандартом в SPR экспериментов. - Наложить вычитается кривые, выполняя сдвига по оси, как описано ранее.
- Вычитания фона ответа путем вычитания кривой цикла 3 из кривой цикла 4 и кривой цикла 5 из кривой цикла 6. Использование Операция вычитания кривой, которая может быть найдена в Y-оси смещается меню.
- Определение кинетики констант и подгонка модели
- Проведение кинетическую эксперимент
- Подайте серию 6-7 концентраций аналита иметь надежный данных для определения кинетических констант. Выберите анализируемых концентраций от 10-кратное выше в 10 раз ниже расчетной K D, в 2-3-кратном разбавлении. Включить "нулевой" концентрации, в дальнейшем используется для вычитания двойного значения (см. Выше) Проведение инъекции в трех экземплярах и в случайном порядке.
- Выровнятьи вычесть все кривые по отношению к Y-оси и оси Х до попытки подгонки модели.
- Модель Место
- Выберите подходящую программу анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство имеющихся программ, уместно предложить несколько моделей, которые могут быть применены для установки и определения кинетических констант. - Применение простейшей модели (Лэнгмюра) Предполагая обратимый 1: 1 взаимодействие между анализируемым веществом и лигандом для фитинга. Если убедительных данных не доступны из других экспериментальных методов для существования более сложного взаимодействия, всегда используйте простую модель Ленгмюра.
- Выберите подходящую программу анализа.
- Проведение кинетическую эксперимент
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В системе, описанной в данном документе, чип NiNTA используется для иммобилизации His-меченый мембраны транспортер 6,7. Будучи гомодимер, каждый транспортер вдвойне помечены, повышение его связывание с чипом NiNTA. После никеля нагрузку, лиганд А (транспортер интерес) будет обездвижен на FC = 2, до ~ 3500 RU (протокол цикла 2, 2А черная метка). Затем, используя тот же поток и продолжительность впрыска, лиганд B (контроль лиганд) вводится на FC = 1, первоначально достигнув только до ~ 3000 RU. Чтобы убедиться, что аналогичные суммы белка иммобилизуют на обоих проточных ячеек; лиганд B дополнительно загружается, используя короткий укол, в то время как внимательно следит за нагрузку до 3500 RUS. Форма "Лестница" представляет постепенное увеличение массы на FC = 1 при каждой инъекции (2А серый этикетки). Он-лайн мониторинг FC = 2-1 помогает контролировать равное лиганда нагрузку. 2В демонстрирует Fc = 21 вычитание, т.е. вычитания максимального значения RU ФК = 2, от ступенчатых приращений стоимости RU ФК = 1. Важно, чтобы варьировать продолжительность инъекций лигандов ", чтобы достичь равного загрузку исследуемых и контрольных лигандов. В отличие от этого, при введении аналита, длительность инъекции должна оставаться постоянной для всех концентраций используется. 3А и 3В показывают ответов измеренные путем введения 'пустой аналит "(то есть, опуская РБ только аналит) в циклах 3 и 5, и где анализируемые инъекции (в циклах 4 и 6). Отметим, что оба sensograms представляют = вычитание Fc 2-1. В каждом из циклов (3-6) идентичен инъекции аналита (заготовки или заданной концентрации) наносится на два потока клеток, иммобилизованных с различными лигандами. Два повтора наложить очень хорошо, демонстрируя высокую воспроизводимость SPR. Ответ записывается в обоих случаях; ~ 3 RU для заготовки против ~ 40 RU аналита. Эти значения представляют собой отношение сигнала к шуму в ~ 13. Чтобы получить двойные ссылки sensograms, представляющих только специфический связывающий ответ, заготовки инъекции в настоящее время вычитается из инъекций аналита (~ 37 RU, фиг.3С). Сенсограмма записан показывает характерный образец переходного взаимодействия. После инъекции, фаза ассоциации характеризуется быстрым увеличением количества лиганда-связаны аналита, достижения устойчивого состояния после ~ 7 секунд. Стационарное состояние сохраняется до тех пор, пока аналит вводится. При инъекции заканчивается, клетки промывали РБ запуска фазы диссоциации. Комплекс быстро диссоциирует, и, как аналита вымывается из лиганда ППР сигнал возвращается к исходному уровню.
Чтобы получить количественные данные (предравновесной и констант равновесия), диапазон концентраций аналита вводят в двух экземплярах или трех экземплярах (см 8.3.1 в протоколе).
Рисунок 1. Иллюстрация из этапов ППР эксперимента с использованием сенсорного чипа Ni-NTA. ( (B - D) Иллюстрация к = 2-1 Сенсограмма записанного во время ППР эксперимента. В цикле 2, как его-меченого лиганда вводят через Ni-заряженной поверхности, масса постепенно накапливается. Инъекции прекращается при достижении конечного значения RU в диапазоне от 1000-5000 RU (в зависимости от МВт лиганда). Исходные формируется, отражающие устойчиво связывания лиганда с чипом. В цикле 3, пустой инъекции предварительно инъекционных компоненты образца анализируемого вещества за исключением только аналита. В этой инъекции часто низкая ответ записывается (1-5 юнита). В цикле 4 аналит вводится с помощью того же режима, как пустой инъекции. Увеличение RU, отражают изменения массы на поверхности, то есть связывание аналита с лигандом. Сигнал быстро возрастает, а затем плато, как гоE Система достигает равновесия. По окончании инъекции, аналит отделяется от лиганда, что приводит к снижению в сигнале и возврат к исходным уровням.
Рисунок 2. О мониторинге линии лигандов нагрузок. () Безвычитательных кривые лиганда нагрузки. Лиганд интерес (лиганд "A") будет загружена не течь клетку 2 (FC = 2, черный) до достижения желаемого уровня Ru (~ 3500 RU в этом примере). Затем отрицательный контроль лиганда (лигандов "В") является поэтапный наносили на клетки потока 1 (Fc = 1, серый) до одинаковом уровне RU достигается. (Б) Эти два инъекции, проведенные в (А) мониторинг в режиме реального времени в качестве = вычитания Fc 2-1. Это облегчает контроль одинаковую загрузку лигандов, представляющих интерес и контроля.
Рисунок 3. Дважды ссылок. () Дубликаты вычитания 2-1 (то есть, Fc = 2-1) заготовки инъекции. (Б) Как в (а), только аналита вводят. (C) Окончательные sensograms после вычитания фона проявленное в (А) от измеренного отклика в (б). Эти кривые называют "двойным бланкированный" или "двойное ссылки". Дубликаты последовательных циклов.
. Рисунок 4. Определение констант кинетический инъекциями нескольких концентраций аналита (в двух экземплярах) Черные линии припадки, которые были рассчитаны с использованием простой 1: 1 модель Ленгмюра взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR является высокочувствительным методом для изучения молекулярных взаимодействий, и часто единственный подход, который обеспечивает мониторинг в режиме реального времени переходных (еще важных) взаимодействий. Примером может служить переходный взаимодействия, представленные здесь, которые не могли быть обнаружены с помощью любого другого метода (выпадающих анализов, липосомы седиментации анализах 6). Кроме того, в то время как другие методы ограничены к равновесию измерения (как количественной или качественной), ППР является одним из методов, которые только измеряют также предравновесном кинетики.
Его повышенная чувствительность является также его предостережение. Ложно-положительные sensograms легко записывается. Поэтому рекомендуется установить существование взаимодействия с использованием других методов, прежде чем пытаться ППР измерений. До знание характеристик системы (грубая оценка K D, стабильный по сравнению с транзиторной взаимодействия) может быть очень полезным в создании SPR experimeNTS и оценки функциональной значимости полученных измерений. Важным вопросом, имейте в виду, перед началом ППР измерения является качество образцов белка. SPR очень чувствительна к агрегатам, и они должны быть удалены из обеих лиганда и анализируемого вещества препаратов (с помощью гель-фильтрационной хроматографии или ультрацентрифугирования, когда это возможно). Другим источником шума и ложных сигналов может быть связано с буферными несоответствия между РБ и буфера аналита. Это может быть решена путем диализа аналит против RB, либо с помощью высоко концентрированного препарата аналита, который разбавленной много складок (~ 100-1000-кратное) в РБ. Ложные положительные данные также могут быть результатом неспецифических взаимодействий аналита с матрицей чипа или с отрицательным контролем. Эти взаимодействия низкого сродства, так что иногда можно избежать при использовании низких концентраций аналита. Кроме того, включение низкой BSA и / или концентрации моющего средства (0,1 мг / мл и / или 0,05-0,1% (Масса / объем), соответственно) в РБ и впрыскиваемого образца аналита может уменьшаться неспецифических взаимодействий. Изменение содержимого в отрицательной контрольной клетке (разные отрицательный контроль) и другой подход для решения проблем неспецифического связывания. Кроме того, с помощью другой тип чипа также может влиять на качество данных. Различные виды датчиков чипов являются коммерчески доступными, основанных на различных химических. В наиболее часто используемой микросхемы датчика (чип CM-5) карбоксиметилированное декстрана ковалентно присоединен к золотой поверхности. Белки могут быть ковалентно соединены с поверхностью датчика с использованием различных простейших поверхностных химических (обычно амин или тиол связи). Тем не менее, в наших руках, при работе с мембранными белками ковалентной иммобилизации часто приводит артефакты и, таким образом, не метод выбора. В контексте изучения мембранный белок, следует отметить, что существуют коммерческие чипы, которые покрыты липофильных молекул. Это позволит Immobilization мембранных белков на родной-среде. Похожие чипы датчиков также могут быть получены "в доме". Для описания других методов связи см 10,11. Протокол, описанный здесь, основан на использовании микросхемы Ni-NTA для иммобилизации Его помеченной, растворенного моющего средства транспортера (аналит не His-метками, чтобы избежать аналит связывания на поверхности чипа). По нашему опыту 6,12, кинетические константы, полученные из экспериментов, проведенных с Ni-NTA чипов находятся в хорошем согласии с теми, определяется в родной подобных условиях. Хотя Ni-NTA чипы относительно дороги, их основное преимущество в том, что они могут быть лишены лиганда и использовать повторно. Сотни измерений может быть сделано на чип. Кроме того, ориентации лиганда на чипе определяется положением His-Tag и, таким образом, достаточно однородной.
После того, как взаимодействие успешно записаны SPR, серия управления и REPEОВД, необходимо проверить правильность сигнала SPR. Проверка следующих параметров может помочь для проверки SRP данные:
1. Специфика SPR сигнала: из-за высокой чувствительности SPR, использование соответствующих отрицательных контролей имеет особое значение. Неспецифическое взаимодействие записаны SRP может быть из-за адсорбции аналита в матрице. Таким образом, пустая ячейка потока часто не лучший вариант, так как проточная ячейка загружается с белком (лиганд) не является химически эквивалентны в пустую ячейку потока. Лучшим вариантом является использование неактивный мутантный вариант лиганда, тот, который, как известно, не связывать аналит. В качестве альтернативы, можно использовать аналогично мутантный аналита. Если такие мутанты не доступны гомологичного белка (но различной специфичностью связывания) могут быть использованы 12. Примеры хороших отрицательных контролей являются гомологичными лиганда (как описано здесь) или точечной мутации в одном из взаимодействующих партнеров, что, как известно,отменить ассоциацию. Еще один рекомендуемый Отрицательный контроль изменение пост-трансляционной модификации (например, фосфорилирование, метилирование, тиол вывода), что имеет важное значение для взаимодействия. Например, де-фосфорилирование тирозина, что имеет важное значение для взаимодействия SH2 домена. Другие отрицательный контроли могут быть специфические,. При использовании SPR, важность использования строгих отрицательных контролей не может быть переоценена.
2. Воспроизводимость SPR сигнала: SPR чрезвычайно воспроизводимый метод. Когда равные количества лиганда загружаются в чип биосенсоров и равные концентрации анализируемого вещества вводят повторяется должны прекрасно выровнять (рисунок 3).
3. Восстановление системы: при взаимодействии с медленной скорости диссоциации (K d), аналит должен быть удален из лиганда при сохранении функциональную и структурную целостность в Лос-Анджелесеель. Если диссоциации и / или регенерации неполные, SPR сигнала будет постепенно затухать при последующих инъекций аналита. Типичные условия регенерирующие, которые могут быть проверены высокие концентрации Mg 2+ (до 2 м), кислые или основные условия (например, 10 мМ глицина, рН 2,5, 10 мМ NaOH), высокой соли (до 4 М NaCl), или Высокая концентрация моющего средства (например, 1% DDM). Тем не менее, эффективность регенерации этих реагентов (и других) в высшей степени от системы и, таким образом, условия регенерации должны быть проверены. В некоторых случаях, взаимодействие настолько стабильным и сильным, что восстановление никогда не бывает полным, так как в случае Е. палочка витамина B 12 транспортная система (BtuCD-F) 7. В таких условиях, единственный вариант, чтобы лишить лиганд от чипа биосенсора и перезагрузите новую партию для каждой инъекции. В тех случаях, когда диссоциации аналита с лигандом является быстрым и полной регенерации поверхности не является необходимым(См протокол и цифры 2-3).
4. Мембранные белки всегда очищается в присутствии детергента, которые могут повлиять на ППР уровень чувствительности и реакции. Однако, по нашему опыту с BtuCD, измеренные показатели очень похожи. Всегда необходимо получить подтверждающие документы, используя бесплатные подходы, такие как гель-проникающей хроматографии (SEC), в выпадающем анализы, липосомы оседания анализ и т.д. Например корреляция между SPR и других методов было показано для метионина, витамина B 12, и два молибдатные системы 6,12.
Ошибочное определение констант кинетический часто возникает в процессе подгонки. Как правило, всегда необходимо применять простой Ленгмюра 1: 1 модель взаимодействия для анализа кинетических экспериментов. Более сложные модели делать дополнительные предположения о конформационных изменений, двухвалентного анализируемого вещества, или образец неоднородности. Эти предположения должны бытьсделал только если поддерживается доказательствами от других экспериментальных подходов. Заметим, что применение этих моделей будет, скорее всего, результат в более удобных и нижних Chi 2 значений, но это не следует рассматривать как свидетельство их надежности. Чем выше степень свободы, которую дает более сложных моделей, как правило, несет ответственность за более удобное, чем их механистической актуальность.
Одним из преимуществ является его SPR широкой химической совместимости, особенно в отношении моющих средств, которые используются для растворения и очистки мембранных белков. Тем не менее, сахароза и глицерин (и другие вязкие растворы), которые часто добавляют в процессе очистки мембранных белков имеют сильное воздействие на RU. Поэтому рекомендуется, чтобы избежать их, если это возможно, или, по крайней мере, уменьшить их концентрацию. При использовании вязкие растворы, избегая буфера несоответствие становится необходимым. Добавление липиды моющего средства, содержащего RB может усиливать обязательную знакаль настолько, насколько в десять раз. Тем не менее, такие усилия дорого (для большинства липидов) и имеет тенденцию к сокращению продолжительности жизни биосенсора фишек.
Советы и устранение неполадок, перечисленные выше, могут помочь при калибровке новую систему. Тем не менее, данная система часто требует определенного тонкой настройки (например, выбор моющего средства, соли, рН) для достижения оптимальных результатов.
SPR уже давно признана в качестве мощной и уникальный подход для измерения молекулярных взаимодействий. В последние годы наличие различных SPR платформ и снижение их цен составил SPR более доступным. Он быстро становится стандартным подходом золото для изучения белок-белковых взаимодействий, целевые взаимодействия белка с наркотиками, и в раскрытии свинца низкомолекулярные ингибиторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
