Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca 2 + spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement Ca2 + indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.
Les indices de développement de l'environnement et induisent des fluctuations de Ca2 + dans les cellules végétales. spatio-temporelles de Ca2 + modèles spécifiques de stimulation sont détectées par cellulaires Ca2 + protéines de liaison qui initient Ca2 + cascades de signalisation. Cependant, nous en savons encore peu de choses sur la façon dont les signaux de stimulus Ca spécifique sont générés. La spécificité d'un signal de Ca2 + peut être attribuée à la régulation sophistiquées de l'activité des canaux et / ou des transporteurs de Ca en réponse à un stimulus donné. Pour identifier ces composants cellulaires et comprendre leurs fonctions, il est essentiel d'utiliser des systèmes qui permettent un enregistrement sensible et robuste des signaux de Ca à la fois le tissu et niveaux cellulaires. Codés génétiquement Ca2 + indicateurs qui ciblent différents compartiments cellulaires ont fourni une plate-forme pour des cellules vivantes imagerie confocale de cellulaires Ca2 + signaux. Nous décrivons ici l'instructions pour l'utilisation de deux systèmes de Ca2 + de détection: aequorine base (FAS adhésives Les plants de film luminescence) Ca2 + et d'imagerie des cellules vivantes cas12 fluorescence confocal basé imagerie de Ca2 +. imagerie de luminescence en utilisant le système FAS fournit une détection simple, robuste et sensible spatiales et temporelles des signaux Ca2 + au niveau des tissus, tandis que la cellule en direct imagerie confocale en utilisant cas12 permet la détection simultanée de cytosolique de Ca2 + et signaux nucléaires à haute résolution.
La cellule de plante répond à l'environnement par l'intermédiaire d'une signalisation qui coordonne les actions cellulaires. Événement de signalisation en réponse à des stimuli de l'environnement d'une cellule début est une augmentation transitoire de Ca2 +. Le modèle, ou la signature d'une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 + libre est caractérisé par son amplitude, la fréquence et la durée. Signatures Ca2 + spatio-temporelles distinctes régissent différentes activités cellulaires 1. Stimuli spécifiques, tels que la chaleur, le froid, le sel, la sécheresse, la lumière, ou des hormones végétales, peuvent affiner l'activité spatio-temporelle de la membrane localisée canaux Ca2 + et / ou transporteurs, entraînant spécifiques Ca2 + signatures. Bien que Ca2 + transporteurs ont été bien caractérisés, on sait peu sur l'identité et les fonctions moléculaires des canaux de Ca dans les plantes 1. Écrans génétiques pour les mutants avec altéré Ca2 + réponse au stress stimuli peuvent être une appr efficaceOach pour identifier les composants qui composent Ca de signatures. Ca2 + systèmes de détection récemment fondé plusieurs Aequorin ont été développés qui facilitent écrans génétiques pour Ca2 + composants de signalisation en réponse à l'attaque d'agents pathogènes et stress abiotique 2-4.
A été utilisé pour la première Aequorin pour détecter des signaux Ca2 + dans les usines dans les années 1990 5. Depuis lors, l'aequorine a été ciblée pour différents compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme 5, le noyau 6, les chloroplastes 7, tonoplastique 8, les mitochondries 9, et le stroma 10, ainsi que de différents types de cellules dans la racine de surveiller cellule spécifique Ca 2 + 11 signaux. Les mesures sur la base de Ca de l'aequorine révèlent le Ca2 + réponse spatiale et temporelle d'une population de cellules pour souligner stimuli. Cependant, dans la plupart des cas, les réponses du Ca de cellules individuelles sont unsynchronized dans le tissu de répondre 4. Par conséquent, l'enregistrement de Aequorin Ca ne rend pas nécessairement le signal Ca2 + dans des cellules individuelles. Au cours des dernières années, la protéine fluorescente génétiquement codé (FP) à base de Ca2 + indicateurs, tels que cameleon jaune (centres jeunesse) 12 et 13 cas12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + avec une résolution subcellulaire élevé. Centres jeunesse sont le transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) à base d'indicateurs de Ca2 +, contenant CFP et YFP variants lié par le liant le Ca2 + et calmoduline de la protéine de peptide liant la calmoduline M13. Calmodulin subit un changement de conformation telle qu'elle se lie au Ca2 +, ce qui apporte CFP et YFP rapprocher, ce qui entraîne un transfert d'énergie accrue (FRET accru). Le niveau de FRET avec le temps, plus ou moins calculé comme le rapport de la YFP à la PCP intensités de signal, traduit la dynamique intracellulaire de Ca2 +. Plusieurs versions YC ont été utilisés dans des plantes. YC3.6 était targeted vers le cytosol 14,15, 16 noyau, les mitochondries 17, et la membrane plasmique 18, et YC4.6 et D4ER ont été ciblés à l'urgence 15,19, et D3cpv a été visé aux peroxysomes 20. Les plantes transgéniques exprimant des centres jeunesse permettent l'imagerie des cellules vivantes de Ca2 + dynamique au sein de différents compartiments cellulaires de différents types de cellules. Cas (probablement Ca lcium soi RNDS) sont des protéines simples circulairement permutées fluorescentes (cpFPs) abritant une calmoduline et le peptide liant la calmoduline M13. Lors de la liaison à Ca2 +, les cas sont soumis à des changements de conformation, conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence. La corrélation entre la réponse de fluorescence de la CAS et concentration de Ca2 + intracellulaire de Ca2 + permet dynamique à mesurer quantitativement. La variante cas12 a 12 fois fluorescence accrue dans les Ca2 + formes saturés. N. plantes benthiminana transitoire expresser cas12 ou de plantes d'Arabidopsis exprimant de façon stable Case 12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + dans la défense et stress abiotique 4,21. Asynchrone spatiale et temporelle Ca2 + oscillations dans les cellules répondant à une attaque pathogène, ou au stress de déshydratation ont été révélés avec la société cas12 Ca2 + imagerie.
Ici, nous présentons des instructions détaillées pour Aequorin imagerie de luminescence en fonction de stimuli et tissulaire spécifique Ca2 + dynamique en plants d'Arabidopsis, et pour l'imagerie confocale de cytosolique et nucléaire Ca 2 + dynamique dans les cellules d'Arabidopsis profondes qui expriment Cas 12: Luminescence imagerie du SAF pourrait être adapté pour analyser le stress induit par Ca2 + dynamique dans les plantes ou les tissus ne sont pas décrits ici intacts, ou pour dépister les populations de plantes d'Arabidopsis mutagénisées des mutants avec le stress a induit des troubles de Ca2 + signaux. L'installation d'imagerie Ca 2 + des cellules vivantes pourrait être adapté pour analyser Ca2 + dynamique au sein des différents compartiments de subcelluar ou dans différents types de cellules à l'aide de Ca2 + autres indicateurs.
Nous avons démontré un système FAS pour l'enregistrement de la spatio-temporelle Ca2 + réponse des plants d'Arabidopsis. Cette 2+ système d'enregistrement FAS Ca offre une approche simple, sensible et robuste qui pourrait être adapté pour mesurer Ca2 + dynamique déclenchée par divers stimuli, en plus des stimuli de stress abiotiques qui sont présentés ici. Grâce à ce système, nous pouvons comparer facilement tissulaires ou des stimuli spécifiques spatio-tempore…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10X10 cm square petri dish | VWR | 60872-310 | |
adhesive film | VWR | 60941-062 | |
polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
1 mL syringe | VWR | 53548-000 | |
silicone grease | Beckman | 335148 | |
2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
ImageJ | NIH | N/A | Public domain, Java-based image processing program |
DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
All purpose Bleach | Any local store | N/A | |
Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
Agar | Sigma | A1296-5KG | |
Phytagel | Sigma | P8169-1KG |