मापने स्थानिक और लौकिक सीए<sup> 2 +</supArabidopsis संयंत्रों में> सिग्नल
Summary
सीए 2 + संकेतन पौधों में विविध जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है. यहाँ हम स्थानिक और लौकिक सीए प्रेरित अजैव तनाव की निगरानी के लिए दृष्टिकोण पेश Arabidopsis कोशिकाओं और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक Aequorin या Case12 का उपयोग ऊतकों में 2 + संकेतों.
Abstract
विकास और पर्यावरण संकेतों सीए संयंत्र कोशिकाओं में 2 + उतार चढ़ाव प्रेरित. प्रेरणा विशिष्ट स्थानिक लौकिक सीए 2 + पैटर्न सीए 2 + cascades संकेत आरंभ कि सेलुलर सीए 2 + बंधनकारी प्रोटीन द्वारा महसूस कर रहे हैं. हालांकि, हम अभी भी विशिष्ट सीए 2 + संकेतों उत्पन्न कर रहे प्रोत्साहन के बारे में कैसे कम जानते हैं. एक सीए 2 + संकेत की विशिष्टता किसी दिए गए प्रोत्साहन के जवाब में सीए 2 + चैनलों और / या ट्रांसपोर्टरों की गतिविधियों का परिष्कृत विनियमन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इन सेलुलर घटकों की पहचान करने और उनके कार्यों को समझने के लिए, यह ऊतक और सेलुलर स्तर दोनों पर सीए 2 + संकेतों के एक संवेदनशील और मजबूत रिकॉर्डिंग की अनुमति प्रणालियों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. विभिन्न सेलुलर डिब्बों को लक्षित कर रहे हैं कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक सेलुलर सीए 2 + संकेतों का जीना सेल confocal इमेजिंग के लिए एक मंच प्रदान किया है. यहाँ हम अनुदेश का वर्णनदो सीए 2 + का पता लगाने प्रणालियों के इस्तेमाल के लिए है: एफएएस (फिल्म चिपकने वाला पौध) luminescence सीए 2 + इमेजिंग और case12 आधारित लाइव सेल confocal प्रतिदीप्ति सीए 2 + इमेजिंग आधारित aequorin. Case12 का उपयोग रहते सेल confocal इमेजिंग एक उच्च संकल्प पर साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + संकेतों के एक साथ पता लगाने प्रदान करता है, जबकि एफएएस प्रणाली का उपयोग luminescence इमेजिंग, ऊतक स्तर पर स्थानिक और लौकिक सीए 2 + संकेतों के एक सरल, मजबूत और संवेदनशील पता लगाने प्रदान करता है.
Introduction
संयंत्र सेल सेल कार्यों का समन्वय करता है कि संकेत के माध्यम से पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया करता है. पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में घटना संकेत एक प्रारंभिक सेल एक क्षणिक सीए 2 + वृद्धि हुई है. नि: सीए 2 + एकाग्रता में पैटर्न, या एक क्षणिक वृद्धि के हस्ताक्षर अपने आयाम, आवृत्ति, और अवधि की विशेषता है. पृथक spatio- अस्थायी सीए 2 + हस्ताक्षर अलग सेलुलर गतिविधियों 1 विनियमित. ऐसी गर्मी, सर्दी, नमक, सूखा, प्रकाश, या संयंत्र हार्मोन के रूप में विशिष्ट उत्तेजनाओं, ठीक धुन सकता झिल्ली स्थानीयकृत सीए 2 + चैनलों और / या ट्रांसपोर्टरों की spatio- लौकिक गतिविधि, विशिष्ट सीए 2 + हस्ताक्षर में जिसके परिणामस्वरूप. सीए 2 + ट्रांसपोर्टरों अच्छी तरह से विशेषता किया गया है, छोटे पौधों 1 में सीए 2 + चैनलों की आणविक पहचान और कार्य के बारे में जाना जाता है. उत्तेजनाओं तनाव को बदल सीए 2 + प्रतिक्रिया के साथ म्यूटेंट के लिए आनुवंशिक स्क्रीन एक प्रभावी appr हो सकता हैसीए 2 + हस्ताक्षर रचना कि घटकों की पहचान करने के लिए oach. हाल ही में कई Aequorin आधारित सीए 2 + का पता लगाने प्रणालियों रोगज़नक़ हमले और अजैविक तनाव 2-4 के जवाब में घटकों संकेत 2 + कैरियर के लिए आनुवंशिक स्क्रीन की सुविधा है कि विकसित किया गया है.
Aequorin पहले 1990 के दशक में 5 सीए पौधों में 2 + संकेतों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तब से, Aequorin ऐसे सीए 2 विशेष सेल की निगरानी करने की जड़ में 8 tonoplast कोशिका द्रव्य 5, नाभिक 6, क्लोरोप्लास्ट 7, माइटोकॉन्ड्रिया 9, और स्ट्रोमा 10, साथ ही साथ करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के रूप में विभिन्न सेलुलर डिब्बों, के लिए लक्षित किया गया है + संकेतों 11. Aequorin आधारित सीए 2 + माप उत्तेजनाओं तनाव की कोशिकाओं की आबादी के स्थानिक और लौकिक सीए 2 + प्रतिक्रिया प्रकट करते हैं. हालांकि, ज्यादातर मामलों में, एकल कक्षों के सीए 2 + प्रतिक्रियाओं unsynchroni हैंप्रत्युत्तर देना ऊतक 4 में जेड. इसलिए, Aequorin सीए 2 + रिकॉर्डिंग जरूरी व्यक्ति की कोशिकाओं में सीए 2 + संकेत रिपोर्ट नहीं है. हाल के वर्षों में, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) उच्च subcellular संकल्प के साथ संकेत 2 + सीए अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है सीए ऐसे पीला Cameleon (YCS) 12 और CASEs12 13 के रूप में 2 + संकेतक, आधारित. YCS प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) पाकिस्तानी युक्त, सीए 2 + संकेतक आधारित और YFP प्रोटीन calmodulin और calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड M13 -binding 2 + सीए द्वारा जुड़ा हुआ वेरिएंट हैं. यह सीए 2 + करने के लिए बांध के रूप में Calmodulin जिससे वृद्धि हुई ऊर्जा हस्तांतरण (बढ़ाया झल्लाहट), जिसके परिणामस्वरूप करीब एक साथ पाकिस्तानी और YFP लाता है, एक गठनात्मक बदलाव आए. पाकिस्तानी संकेत तीव्रता को YFP के अनुपात के रूप में मोटे तौर पर गणना की समय पर झल्लाहट स्तर,, intracellular सीए 2 + गतिशीलता को दर्शाता है. कई YC संस्करणों संयंत्रों में इस्तेमाल किया गया है. YC3.6 टी थाcytosol 14,15, नाभिक 16, माइटोकॉन्ड्रिया 17, और प्लाज्मा झिल्ली 18, और YC4.6 और D4ER को argeted ईआर 15,19 को निशाना बनाया गया, और D3cpv peroxisomes 20 को निशाना बनाया गया. YCS व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न सेलुलर डिब्बों के भीतर सीए 2 + गतिशीलता का जीना सेल इमेजिंग अनुमति देते हैं. मामले (शायद सीए lcium एसई nsor) एक calmodulin और calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड M13 शरण एकल चक्राकार permuted फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cpFPs) कर रहे हैं. सीए 2 + के लिए बाध्य करने पर, मामलों प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि करने के लिए अग्रणी, गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना. मामला है प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया और सीए 2 + एकाग्रता के बीच संबंध intracellular सीए 2 + गतिशीलता मात्रात्मक मापा जा करने की अनुमति देता है. Case12 संस्करण 12 गुना सीए 2 + -saturated रूपों में प्रतिदीप्ति बढ़ गया है. एन benthiminana पौधों क्षणिक exprEssing Case12 या stably प्रकरण 12 व्यक्त Arabidopsis पौधों रक्षा और अजैव तनाव 4,21 में सीए 2 + संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. , या निर्जलीकरण तनाव को रोगज़नक़ हमले का जवाब देने की कोशिकाओं में अतुल्यकालिक स्थानिक और लौकिक सीए 2 + दोलनों Case12 आधारित सीए 2 + इमेजिंग के साथ खुलासा किया गया है.
यहाँ, हम Arabidopsis पौध में 2 + गतिशीलता सीए विशिष्ट, और साइटोसोलिक की confocal इमेजिंग और परमाणु कैरियर के लिए ऊतक और उत्तेजनाओं की Aequorin आधारित luminescence इमेजिंग के लिए विस्तृत निर्देश उपस्थित एफएएस के प्रकरण 12 Luminescence इमेजिंग व्यक्त कि Arabidopsis रूट कोशिकाओं में 2 + गतिशीलता बरकरार पौधों या यहाँ वर्णित नहीं ऊतकों में तनाव प्रेरित सीए 2 + गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, या 2 + संकेतों सीए प्रेरित बदल तनाव के साथ म्यूटेंट के लिए mutagenized Arabidopsis संयंत्र आबादी स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. लाइव सेल सीए 2 + इमेजिंग सेटअप सीए का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैअन्य सीए 2 + संकेतक का उपयोग विभिन्न subcelluar डिब्बों के भीतर या विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में 2 + गतिशीलता.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम Arabidopsis seedlings के स्थानिक अस्थायी सीए 2 + प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए एक एफएएस प्रणाली का प्रदर्शन किया है. इस एफएएस सीए 2 + रिकॉर्डिंग प्रणाली सीए यहां प्रस्तुत कर रहे हैं कि अजैव तनाव उत्तेजनाओं …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10X10 cm square petri dish | VWR | 60872-310 | |
| adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 mL syringe | VWR | 53548-000 | |
| silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| ImageJ | NIH | N/A | Public domain, Java-based image processing program |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose Bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
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