Summary
السرطان مرض معقد يتأثر الأنسجة المحيطة للورم، وكذلك المؤيد المحلية والمضادة للالتهابات وسطاء. لذلك، ونماذج حقن المتعامدة التغاير، بدلا من نماذج تحت الجلد قد تكون مفيدة لدراسة تطور سرطان بطريقة يحاكي أفضل علم الأمراض البشرية.
Abstract
يمكن دراسة نمو سرطان الثدي في الفئران باستخدام مجموعة كبيرة من النماذج. التلاعب الجيني للخلايا سرطان الثدي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف البروتينات المشاركة في التقدم أنكجنيك أو مساعدة لاكتشاف المكثفات الورم جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الخلايا السرطانية في الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة قد توفير فهم أفضل لأهمية المقصورة اللحمية. قد يكون العديد من النماذج مفيدة للتحقيق في جوانب معينة من تطور المرض ولكن لا ألخص عملية السرطانية بأكملها. في المقابل، خلايا سرطان الثدي engraftment إلى لوحة الدهون الثديية من الفئران أفضل يلخص موقع للمرض وجود مقصورة انسجة سليمة وبالتالي يحاكي أفضل مرض سرطاني البشري. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية زرع خلايا سرطان الثدي في الفئران orthotopically وشرح كيفية جمع الأنسجة لتحليل: 14px؛ خط الطول: 28px؛ "> ورم الوسط والانبثاث إلى أعضاء بعيدة عن طريق هذا النموذج، العديد من الجوانب (النمو، والأوعية الدموية، والانبثاث) من السرطان يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق توفير البيئة المناسبة لخلايا الورم في النمو.
Introduction
السرطان مرض معقد جدا التي كانت تخضع لدراسات لأكثر من قرون. سرطان الثدي هو نوع السرطان الأكثر شيوعا. يحدث في الغالب في الإناث ولكن قد يحدث أيضا بشكل متقطع في الذكور 27. وينجم هذا المرض أساسا عن فقدان آلية السيطرة انقسام الخلايا الحكم والذي بدوره يؤدي إلى نمو لا حصر له من الخلايا في الجسم. يمكن أن يكون سبب هذه الأعطال من قبل عدة آليات: أولا، الخلايا السليمة تحتاج إشارات نمو من الخلايا المحيطة بها من أجل تتكاثر الخلايا السرطانية في حين تجعل عوامل النمو الخاصة بها وتزيد من التعبير عن مستقبلات عوامل النمو وبالتالي الحصول على أعلى معدل التكاثري 1؛ الثانية، الخلايا السرطانية هي أقل عرضة للإشارات مكافحة التكاثري 8؛ ثالثا، لتحقيق التوازن في عدد الخلايا في مطلوب أيضا وفاة خلية من خلايا الجسم. ومع ذلك، الخلايا السرطانية الهروب من موت الخلايا المبرمج، وصفته موت الخلايا المبرمج 14؛ الرابع، وخلايا تلتزم مصفوفات خارج الخليةمن أجل البقاء على قيد الحياة ولكن الخلايا السرطانية يمكن أن تنمو من دون الحاجة إلى التعلق وتظهر مقاومة anoikis 19. الخامس وتفعيل التيلوميراز تلتف تقصير التيلومير ويمنع الشيخوخة تنسخي 21؛ أخيرا وليس آخرا، تخطي مراقبة الجودة DNA التالية النتائج الانقسام في المحتوى الجيني تغير 15،16. من أجل تحديد الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم التي تلعب دورا في هذا الانتشار المحررة من القيود التنظيمية، والتجارب نمو الورم في الفئران هي الحاسمة.
نمو الورم الرئيسي عموما ليست السبب الرئيسي للوفاة. هجرة الخلايا السرطانية من الموقع الأساسي إلى موقع ثانوي، يطلق ورم خبيث، هو السبب الرئيسي للوفاة في معظم مرضى السرطان 22. ورم خبيث ينطوي غزو الخلايا السرطانية، دخول الوعاء، والسفر من خلال الدورة الدموية، وتجنب المناعة الهجوم، التسرب والنمو في الموقع الثانوي. الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو عملية أساسية فيورم خبيث وينطوي على التبديل في ملامح التعبير الجيني العائد الخلايا مع ارتفاع الحركة والغازية، والتي هي بمستلزمات للخلية نقيلي 12. ولما كانت عملية السرطانية هي حصيلة مجموعة من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك التفاعلات المتبادلة بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والخلايا المؤيدة والمضادة للالتهابات، وهو نهج في المختبر بالسرطان في كثير من الأحيان لا توفر رؤية كاملة في عملية السرطانية. وبالمثل، والعلاجات المضادة للسرطان تؤثر على الأوعية الدموية السرطانية يمكن في كثير من الأحيان لا يتم دراستها في المختبر، وبالتالي فإن استخدام الجسم الحي في النهج أمر لا مفر منه.
لدراسة تطور سرطان الثدي، وقد وضعت الطرق التجريبية المختلفة. النموذج الأكثر استخداما هو الحقن تحت الجلد من خلايا سرطان الثدي في الفئران 5. في هذا الإعداد التجريبية، يجوز للمحقق تقديم مجموعة واسعة من التعديلات على خط خلية من خيار في المختبر (أيupregulation، downregulation من البروتينات) وحقن الخلايا تحت الجلد. على الرغم من أن هذه الطريقة هي واضحة وعملية حقن بسيطة دون الحاجة إلى إجراء عمليات جراحية على الفئران، الموقع الذي يتم حقن الورم لا يمثل البيئة الورم الثديية المحلية وغياب هذه البيئة قد يؤدي إلى الإصابة بسرطان الثدي الذي يختلف عن تلك التي لوحظت في علم الأمراض البشرية. ثانيا، تستخدم فئران معدلة وراثيا في كثير من الأحيان كأداة في الجسم الحي لدراسة تطور سرطان الثدي. في هذا النموذج، هو الدافع وراء الجين الورمي (أي PyMT، نوي) التعبير من قبل المروج محدد الأنسجة الثديية مما أدى إلى تشكيل عفوية ورم الثدي الصورة. هذا الإعداد التجريبية مفيد لدراسة جوانب العلاج من هذا المرض عن طريق حقن المخدرات أو الأجسام المضادة أثناء التحقق من حجم الورم في الوقت المناسب 3. ومع ذلك، تربية هذه الفئران مع سلالات الفئران الأخرى ناقصة أو تحور في الجينات في المصالح ويمكن أيضا إعطاء الإضافيةights في دور البروتينات المختلفة في نمو الورم الثدي 24. الجانب السلبي من هذا النموذج هو أنه عرضة للتفاوت في حجم الورم والعدد. وعلاوة على ذلك، فإن مستوى التعبير التحوير يعتمد على موقع التكامل في الجينوم، ويمكن أن تتغير من سلالة الماوس واحد إلى 4 آخر. في هذا النموذج، والتعبير عن التحوير يمكن أن يتحقق من قبل جميع الخلايا الظهارية مع الأصل بينما في الأمراض التي تصيب البشر، فقط جزء من السكان من الخلايا التعبير عن الجين الورمي أو downregulate مستويات الكابتة للورم 26. لدراسة ورم خبيث، ويمكن أيضا أن حقن خلايا سرطان الثدي عن طريق الوريد (نموذج يسمى ورم خبيث تجريبي) 25. ومع ذلك، فإن هذا النهج يلخص فقط عملية المنتشر جزئيا. انها تلتف شرط للخلايا السرطانية لغزو وintravasate، ويبدأ من النقطة التي الخلايا السرطانية هي بسهولة الموجودة في التداول.
في عملنا، ونحن استخدام حقن مثليأيون نموذج لدراسة تورط الجينات في المصالح في تطور سرطان الثدي 13. نحن بإفراط عن البروتين في خلايا سرطان الثدي البشرية وضخها إلى لوحة الدهون الثديية من NOD / غاما SCID (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران. هذه الطريقة هو مفيد من نواح عديدة: فهو يسمح التغيرات الجينية السريعة جدا ومتنوعة في خط الخلية حقن، فإنه يغطي كامل عملية تطور سرطان الثدي من نمو الورم الرئيسي لورم خبيث في المواقع ذات الصلة مرضي، وأنه يوفر أيضا نموذج تجريبي جيد لدراسة تأثير العلاجات العلاجية في مراحل مبكرة أو متأخرة من المرض. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هذا النموذج يمكن لأحد أن التحقيق في دور انسجة مقابل السرطان البروتينات المشتقة من خلية في تطور المرض باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الخلايا. وعلى الرغم من الحقن تحت الجلد هي أسهل لأداء، ونماذج مثلي تؤدي إلى نشوء الخلايا السرطانية أكثر السكان مكون للأورام وأكثر النقيلي. وهكذا، والنتائج التي تم الحصول عليها عن طريق الحقن تحت الجلدالصورة قد تكون إما كاذبة أو سلبي إيجابية كاذبة 6،17 تشجيع استخدام نماذج مثلي لدراسة نمو الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الرفق بالحيوان من المركز الطبي لجامعة لايدن (LUMC).
1. إعداد الخلايا، أدوات والفئران
- وقبل يوم من العملية، ويحلق في NOD / SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران من الحلمة الرابعة إلى خط الوسط ووزن الفئران للتحقق من أن جميع الفئران لها أوزان مقاربا.
- الأوتوكلاف مقص، واثنين من ملاقط واثنين من ملقط البعوض على التوالي (الشكل 1A).
- في يوم العملية، وغسل غدية الثدي الإنسان (MDA-MB-231) الخلايا التي سوف يتم حقنه مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4 ويعرض للتريبسين الخلايا. إخماد التربسين وذلك بإضافة 10 مل تحتوي على المصل DMEM وسائل الاعلام على أعلى من الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق على RT لإزالة المصل عن طريق إعادة التعليق الخلايا إما في برنامج تلفزيوني أو في وسائل الإعلام دون المصل. أجهزة الطرد المركزي لهم مرة أخرى لإزالة آثار مصل تماما. resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني أووسائل الاعلام.
- عدد الخلايا مع عدادة الكريات وحساب كمية من الخلايا. استخدام 500000 خلية / الماوس في عدم أكثر من 150 ميكرولتر. اختياري لبرنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام، resuspend الخلايا في matrigel.
ملاحظة: تحديد كمية الخلايا اعتمادا على نوع من الخلايا المستخدمة. - وضع الخلايا في أنابيب microcentrifuge معقمة والاحتفاظ بها على الجليد.
- ملء واحدة 50 مل مخروطي أنبوب الطرد المركزي مع 35 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وآخر 50ML المخروطية أنبوب الطرد المركزي مع 70٪ من الإيثانول. نقع قطعة قطن في كل أنبوب.
2. حقن مثلي
- إجراء الجراحة في غطاء العقيمة للحفاظ على جو معقم. تخدير الماوس عن طريق الحقن تحت الجلد Xylazin / الكيتامين مزيج بجرعة 10MG / كغ، و 100 ملغم / كغم من وزن الجسم على التوالي. إصلاح الماوس على وسادة التدفئة. تأكيد نجاح التخدير بسبب عدم وجود رد فعل حتى أخمص القدمين قرصة.
ملاحظة: إذا كان أحد ليست مألوفة جدا مع العمليات الجراحية وجراحة قد يستغرق وقتا أطول. رتبالتخدير جرعة وفقا لذلك. - تطبيق مرهم للعين على العيون من الفئران، لمنع العينين من الجفاف.
- تنظيف المنطقة حلق باستخدام قطعة من القطن مغموسة إلى إيثانول أعدت في الخطوة 1.6. بالتناوب الدعك باستخدام بتدين والكحول ثلاث مرات بطريقة دائرية الدورية بعيدا عن موقع شق المخطط يجب أن يتم تنفيذ. بدلا من ذلك، استخدم حامل الأيون كمطهر.
- إجراء شق صغير بين الحلمة الرابعة وخط الوسط مع مقص وجعل جيب عن طريق إدخال مسحة القطن مبللة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
- استخدام الملقط لفضح لوحة الدهون الثديية. مراقبة لوحة الدهون التي كتبها لونه أبيض.
- ضغط لوحة الدهون مع منتاش آخرين من قاعدتها. من خلال ذلك، كشف تماما لوحة الدهون (الشكل 1B) لإجراء الحقن بسهولة.
- تجانس الخليط خلية pipetting صعودا وهبوطا. نضح بلطف 50 ميكرولتر من تعليق خلية في حقنة الأنسولين ويحقنلوحة الدهون الثديية من خلال عقد الإبرة أفقيا. تأكيد حقن ناجحة عن طريق التحقق من تورم لوحة الدهون.
- الافراج عن لوحة الدهون بلطف.
- خياطة شق باستخدام برنامج تشغيل الإبرة. جعل ثلاث رميات من خلال تحويل خياطة حول السائق الإبرة في اتجاه عقارب الساعة، عكس عقارب الساعة واتجاه عقارب الساعة. وينبغي أن تستخدم وهما عقدة في خياطة الجروح.
ملاحظة: تأكد من أن عقدة ضيقة خلاف الفئران يمكن أن تفتح الغرز. - بعد الجراحة، وحقن مسكن، مثل temgesic في ،05-،1 ملغم / كغم من وزن الجسم، تحت الجلد من أجل تخفيف الألم.
- لا تترك الحيوانات غير المراقب حتى الحصول على وعيه والحفاظ على رقود القصية. وضع كل الحيوانات في أقفاص مختلفة حتى يتم استردادها بالكامل.
- للحفاظ على العقم، واستخدام أقفاص تعقيمها والمياه. تغيير أقفاص كل ثلاثة أيام للحفاظ على أجواء نظيفة.
3. حصاد أجهزة لتحليل
- فييوم الحصاد، وبعد 8 أسابيع من زرع الخلايا، وملء 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية مع 3 مل من محلول بوان لكل الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام اثنين من 15 مل أنابيب مليئة 5 مل من محلول الفورمالين في الماوس.
- تخدير الحيوانات عن طريق حقن Xylazin / الكيتامين، بجرعة 10 ملغ / كغ 100 ملغ / كغ من وزن الجسم تحت الجلد. الانتظار حتى يفقد الحيوان قرصة أخمص قدميه الانسحاب لا ارادي.
- إصلاح الحيوان مع الإبر على قاعدة. جعل طويلة، الرأسي شق خط الوسط مع مقص. جعل اثنين من الشقوق الأفقية الحق دون الساق الأمامية وفوق الساق الخلفية. كشف الورم عن طريق تعلق الجلد إلى القاعدة. قياس حجم الورم باستخدام الفرجار.
- فصل الورم من الجلد باستخدام المقص. التقط تجميد جزء من الورم في النيتروجين السائل لعزل الحمض النووي الريبي. وضع الجزء الآخر، في أنبوب الطرد المركزي المخروطية مليئة الفورمالين لأداء المناعية التالية تضمين البارافين.
- بلطف اخراج الرئتين. ضعغادر الرئة إلى حل بوان. الحفاظ على الرئة في حل لمدة 3 أيام. مراقبة بؤر المنتشر سطحيا بشكل واضح للعين المجردة. اختياريا، ضع الرئة اليمنى في الفورمالين للتحقق من نقيلة مجهرية باستخدام haematoxylin ويوزين (H & E) تلطيخ.
ملاحظة: على الرغم من ورم خبيث في الرئة لوحظ في كثير من الأحيان في سرطان الثدي، واحد قد ترغب أيضا في جمع العظام والكبد والدماغ والطحال لتحليل ورم خبيث. الخلايا في منطقة النقيلي هي أكثر كثافة ومختلفة شكليا، وبالتالي يمكن تمييزها بسهولة من أنسجة الرئة. - وبعد يوم الحصاد، ونضح الحل الفورمالين من 15 مل أنابيب واستبدال مع 70٪ من الإيثانول. تضمين الأنسجة في البارافين وإجراء الدراسات المناعية.
- لتحليل الدم، وفتح تجويف الصدر مع مقص. سحب الدم 450 ميكرولتر من خلال ثقب في القلب. ضع عينة من الدم في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 50 ميكرولتر من 3.2٪ سيترات الصوديوم. بعد جمع الدم، وتدور عليه في 2،000 x ج لمدة 10 ميلن. تخزين عينات البلازما في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: هناك عدة تقنيات جمع الدم الأخرى التي تستخدم عادة في الممارسة 20 والتقنية التي تحتاج لاستخدامها يعتمد على الإعداد التجريبية واختيار العلماء. إذا لم يكن مطلوبا عينة من الدم، والموت ببطء الحيوان وفقا لبروتوكول الحيوان أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويستند التطبيق الناجح ل"نموذج سرطان الثدي مثلي" على حقن السليم من الخلايا في لوحة الدهون الثديية. أخطاء التجريبية مثل التلقيح غير دقيق من الخلايا أو تسرب قد يؤدي إلى اختلافات في حجم الورم أو حتى عدم وجود الورم الذي يؤدي إلى تشكيل هيكل أبحث مشابهة لمنصة الدهون الثديية حقن مع العازلة التحكم (الشكل 2A). معدل نمو الورم يعتمد على طبيعة الخط حقن الخلايا وبشكل عام، يمكن ملاحظة من خلال الجلد من الفئران (الشكل 2B). خلافا لما حدث في التجارب المختبرية، ومعدل نمو الخلايا السرطانية قد لا تكون ثابتة في الوقت المناسب في الجسم الحي (الشكل 2C). بسبب نقص الأكسجين ونقص المواد الغذائية، قد تشكل المناطق الميتة وسوف هذه المناطق يؤثر على معدل نمو الورم (الشكل 2D). وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجينات في المصالح قد يؤثر مرحلة معينةمن تطور سرطان (في وقت مبكر أو متأخر)، وبالتالي يتوقف على الإعداد التجريبية، قد يبدأ نمو الورم بسرعة ولكن يتباطأ في نهاية أو العكس بالعكس.
ينبغي توخي الحذر أثناء إجراء إزالة الورم. التعامل الصارم قد تؤثر على هيكل من الورم ويؤدي إلى مشاكل في تحليل المناعى. المنطقة المحيطة الورم قد تعرض السفن الكبيرة التي تنشأ من إعادة الأوعية الدموية. هذه السفن تلعب دورا حاسما في إزالة النفايات وتزويد أنسجة الورم مع المواد المغذية والأكسجين مما يسهل نمو الورم (الشكل 2B). تشكيل neovessels (الأوعية الدموية) يمكن التحقيق من قبل تلطيخ الورم لعلامات neovessel (أي CD31، CD34).
مجموعة من الرئتين في حل بوان يساعد على تصور بؤر المنتشر سطحيا على الرئتين (الشكل 3A). بؤر يمكن تمييزها عن أنسجة الرئة عن طريق اللون وشاحبد سهلة للكشف عن 18 عاما. ويمكن التعبير عن ورم خبيث حيث بلغ عدد البؤر تشكلت على سطح الرئة. ومع ذلك، وتشكيل بؤر هو خط تعتمد الخلية؛ الخلايا غير عدوانية تؤدي إلى نقيلة مجهرية فقط أو أي ورم خبيث على الإطلاق. الانبثاث الجزئي يمكن تحديدها بسهولة مع تلطيخ haematoxylin / يوزين على جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة الأنسجة (الشكل 3C).
الشكل 1: المواد والأساليب (A) المعدات الجراحية اللازمة لحقن خلايا سرطان الثدي في لوحة الدهون الثديية (B) الصورة الممثل تظهر تعرض الثديية سادة الدهون.
الشكل 2: نظرة عامة على مثلي نمو الورم الثدي في السيطرة على الفئران (A) وسائل الإعلام أو
الشكل (3): ورم خبيث في الرئة (A) رئة الفئران التي حقنت orthotopically مع الخلايا السرطانية (MDA-MB-231). حضانة الرئتين في حل بوان تكشف بؤر المنتشر على الرئتين. (B) الرئتين من السيطرة على الفئرانالتي خضعت للحقن مثلي وسائل الإعلام السيطرة. كما يمكن أن يرى بوضوح، وهذه السيطرة الرئتين لا تظهر النقائل العيانية. يظهر (C) H & E تلطيخ المنطقة المنتشر في أنسجة الرئة. يظهر إدراج لمحة التكبير منخفضة من أنسجة الرئة التي تحتوي على تركيز النقيلي. ويمثل المستطيل متقطع الأسود في إدراج في لوحة كبيرة. يشار إلى خلايا الورم عن طريق خط متقطع أبيض؛ لاحظ نوى أكبر وأكثر كثافة. (شريط نطاق وأسود = 100 ميكرون، شريط النطاق الأبيض = 20 ميكرون)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي هو نموذج قوي لدراسة جميع جوانب نمو السرطان. زرع هذه الخلايا في لوحة الدهون الثديية من الفئران يجب أن يتم تنفيذ بعناية من أجل منع التباين في نمو الورم. الأهم من ذلك، حقن نفس الكمية من الخلايا لكل فأر أمر بالغ الأهمية. للقيام بذلك، ينبغي للمرء أن يعرض للتريبسين الخلايا بدقة دون التأثير على سلامة الخلايا. يجب تجاهل الخلايا غير قابلة للحياة خلال عملية فرز الخلايا والكواشف (أي الأزرق التريبان) التي يمكن أن تساعد على التمييز بين الخلايا الميتة وقابلة للحياة قد تكون مفيدة لتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة. وينبغي تجنب تشكيل كتل من الخلايا بواسطة pipetting الخلايا صعودا وهبوطا كما تشكيل كتل الخلايا يسبب مشاكل أثناء العد الخلايا ويؤدي إلى سوء تقدير من عدد الخلايا. وهناك جانب آخر مهم ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار هو حجم الخلايا نفسها. كما هو موضح في قسم البروتوكول، خليةومكعبات الصورة من أجل وقف لهم في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام. قبل إضافة PBS أو وسائل الإعلام، وحجم الخلايا ويمكن تقدير بمقارنة بيليه مع أنابيب مليئة أحجام مختلفة من وسائل الإعلام. وفي وقت لاحق حجم الخلية قد تطرح من حجم وسائل الإعلام المقصود، وفقا للمعادلة التالية:
حجم وسائل الاعلام التي تحتاج إلى أن تضاف = حجم محسوبة - حجم خلية
الكواشف التي يتم استخدامها في البروتوكول قد تؤثر على نتائج التجربة. ولذلك ينبغي تعديل البروتوكول وفقا لذلك اعتمادا على سؤال البحث. على سبيل المثال، إذا كانت التجربة تهدف إلى إلقاء الضوء على دور بروتين الغشاء في تطور الورم، قد يؤدي trypsinization في الهضم من البروتين الغشاء ويسبب القطع الأثرية 9. إذا كان هذا هو مصدر قلق، وذلك باستخدام محلول EDTA مخزنة أو كشط الخلايا هو بديل لفصل الخلايا. وكما ذكر أعلاه، قد يكون معلق الخلايا في وسائل الإعلام، PBS أو matrigel FOص الحقن. ومن بين هؤلاء، matrigel هو خيار مريحة كما يبلمر matrigel في لوحة الدهون، وبالتالي التقليل من خلايا تسرب من fatpad. وبالإضافة إلى ذلك، engraftment في وجود matrigel يمكن أن تعزز نمو الورم النقيلي والإمكانات من خطوط الخلايا معينة مثل سرطان الثدي خط الخلية MDA-MB-435 2، وسرطان الغدة تحت الفك البشري A253، وسرطان بشرانية البشري كيلو بايت والفأر سرطان الجلد B16F10 خلايا 7. من فضلك لاحظ أن بعض التحضيرات matrigel تحتوي على عوامل النمو التي تؤثر يحتمل أن تكون النتائج التجريبية. ومع ذلك، النمو المنضب عامل matrigel هو متاح من مختلف الموردين. بالإضافة إلى ذلك، يعمل matrigel باعتبارها المصفوفة خارج الخلية (ECM) وينشط مجموعات فرعية إنتغرين. وهكذا، إذا كان السؤال البحوث ينطوي على دور وظيفة إنتغرين في نمو الورم، ينبغي للمرء أن استخدام وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني باعتبارها الناقل للخلايا سرطان الثدي.
في الإعداد التجريبية لدينا، وحقن خلايا سرطان الثدي البشرية (MDA-MB-231) إلىلوحة الدهون الثديية من الفئران مجموعة موردي المواد النووية. استخدام الفئران العوز المناعي الواضح يجعل من الصعب لدراسة تورط الجينات immunoregulatory في تطور مرض السرطان. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم أيضا في الفئران مع الجهاز المناعي سليمة إذا كانت الخلايا التي تحتاج إلى حقن لها الماوس أصل 23. وبالإضافة إلى ذلك، خط الخلية MDA-MB-231 هو مستقبلات الاستروجين السلبية (ER-) وبالتالي فإن تأثير الهرمونات في تطوير سرطان الثدي مفقود. ومع ذلك، أظهر عملنا السابق أن هذه التقنية هي أيضا قابلة للER + خلايا سرطان الثدي مثل MCF-7 13. وترد أوراق استخدام هذا الأسلوب لدراسة نمو الورم من خطوط خلايا سرطان الثدي التي يشيع استخدامها أدناه:
الإجراء نفسه يحتوي على بعض الخطوات الحاسمة أيضا. وخلافا للحقن تحت الجلد، تنطوي على حقن مثلي العمليات الجراحية التي أجريت على الفئران. وبالتالي، يجب تنظيف الأدوات الجراحية جيدا وتعقيمها. وتجدر الإشارة، زرع الخلايا البشرية فيمنصات الدهون الثديية يتطلب استخدام الفئران العوز المناعي (على سبيل المثال، NOD / SCID). لذلك الحقن ويفضل أن تتم في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وذلك باستخدام أدوات معقمة. وعلاوة على ذلك، خلال الحقن، ويجب أن تبقى الإبرة في الزاوية اليمنى مع افتتاح الإبرة التي تواجه صعودا. عقد إبرة في هذا الموقف يقلل من التسرب وبهذه الطريقة يمكن التحقق حقن ناجحة من خلال مراقبة تورم في لوحة الدهون الثديية. وبالإضافة إلى ذلك، عند تنفيذ عملية جراحية، لا بد من إجراء شق بعض المسافة بعيدا عن لوحة الدهون الثديية من أجل تفادي أي تشويش من عملية التئام الجروح مع نمو الورم. ومع ذلك، لا ينبغي بذل شق بعيد جدا عن لوحة الدهون الثديية سواء، كما يعرض لوحة الدهون الثديية قد يكون صعبا.
وبعد هذا الإجراء، يجب فحص الحيوانات بانتظام. بسبب الجراحة والتعرض للمخدر، والفئران قد تواجه مشقة كبيرة أو حتىيموت. وهكذا، في الأسبوع الأول بعد العملية أمر بالغ الأهمية وينبغي رصد الفئران بعناية. اعتمادا على معدل نمو الخلايا المزروعة، ويمكن قياس حجم الورم تصل إلى 4 مرات في الأسبوع. ويمكن أيضا أن يتم حقن الخلايا الموسومة مع بروتين فلوري أو luciferase المراسل، مما يتيح تتبع الخلايا السرطانية الأولية والنقيلي، وذلك باستخدام كاميرا حساسة للضوء. لا ينبغي أبدا أن يسمح الأورام لتصل إلى أحجام كبيرة للغاية كما تقرحات قد تحدث هذا الضرر نسيج الورم. قد تعوق هذه التحليلات المناعى السليم للأنسجة الورم. مرة واحدة يتم حصاد الورم، يمكن للمرء أن ينظر في تنميق الورم وزراعة الخلايا السرطانية متفرقة لإنشاء خط خلية سرطان الثدي الجديد للتحقيق في الخلافات بين الوالدين وmammay سادة الدهون مرت خطوط (MFP) خلية 11.
في الختام، مثلي زرع سرطان الثدي أننا الواردة في هذه الورقة هو أداة مفيدة جدا لدراسة العمليات السرطان ذات الصلة. واحد كاليفورنيان التلاعب في جينوم الخلايا حقن إما عن طريق upregulating أو downregulating الجينات في المصالح وتحقق تأثيرها على نمو الورم الرئيسي، الأوعية الدموية أو ورم خبيث. هذا النهج هو مفيد لدراسة بروتو الجينات المسرطنة، supressors ورم أو الجينات التي تشارك في EMT. وبالإضافة إلى ذلك، وخطوط الخلايا يمكن حقن الفئران المعدلة وراثيا لدراسة تأثير انسجة مقصورة في تطور السرطان. ونحن نشجع بقوة على استخدام تقنية الحقن مثلي على نماذج سرطان الثدي المذكورة بسبب خلاصة عال من عملية المرضية في جسم المريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
