Summary
कैंसर ट्यूमर के आसपास के ऊतकों के साथ ही स्थानीय समर्थक और विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों से प्रभावित है कि एक जटिल बीमारी है। इसलिए, बल्कि चमड़े के नीचे मॉडल की तुलना में orthotropic इंजेक्शन मॉडल, एक तरह से बेहतर है कि mimics मानव विकृति में कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
Abstract
स्तन कैंसर के विकास मॉडल की एक बहुतायत का उपयोग कर चूहों में अध्ययन किया जा सकता है। स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर नए ट्यूमर शामक को खोजने के लिए oncogenic प्रगति या मदद में शामिल प्रोटीन के कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, अलग जीनोटाइप के साथ चूहों में कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने स्ट्रोमल डिब्बे के महत्व का एक बेहतर समझ प्रदान हो सकता है। कई मॉडल रोग प्रगति के कुछ पहलुओं की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है लेकिन पूरे कैंसर प्रक्रिया पुनरावृत्ति नहीं है। इसके विपरीत, स्तन कैंसर की कोशिकाओं को बेहतर चूहों के स्तन वसा पैड को engraftment रोग और उचित स्ट्रोमल डिब्बे की उपस्थिति और इसलिए बेहतर mimics मानव कैंसर रोग के स्थान स्मरण दिलाता है। इस अनुच्छेद में, हम orthotopically चूहों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और विश्लेषण करने के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए समझाने के लिए कैसे का वर्णन: 14px; रेखा से ऊंचाई:। 28px; "> ट्यूमर परिवेश और मेटास्टेसिस दूर अंगों में इस मॉडल का उपयोग करना, कैंसर के कई पहलुओं (विकास, एंजियोजिनेसिस, और मेटास्टेसिस) ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक उचित वातावरण प्रदान करके बस की जांच की जा सकती है।
Introduction
कैंसर सदियों से अधिक के लिए पढ़ाई के अधीन कर दिया गया है कि एक बहुत ही जटिल बीमारी है। स्तन कैंसर सबसे आम कैंसर के प्रकार है; यह महिलाओं में मुख्य रूप से होता है, लेकिन कई मायनों भी पुरुषों के 27 में हो सकता है। बीमारी मुख्य रूप से बदले में शरीर में कोशिकाओं की एक अनंत विकास की ओर जाता है जो नियंत्रण तंत्र शासी कोशिका विभाजन के नुकसान के कारण होता है। ये खराबियां कई तंत्र की वजह से हो सकता है: पहला, स्वस्थ कोशिकाओं को कैंसर की कोशिकाओं को अपने स्वयं के विकास के कारकों बनाने के लिए और इस तरह एक उच्च proliferative दर 1 प्राप्त वृद्धि कारक रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में वृद्धि जबकि पैदा करने के क्रम में आसपास की कोशिकाओं से विकास संकेतों की जरूरत है; दूसरा, कैंसर की कोशिकाओं विरोधी प्रफलन संकेतों से 8 कम अतिसंवेदनशील होते हैं; तीसरा, यह भी आवश्यक है शरीर कोशिका मृत्यु में सेल नंबर संतुलन के लिए; हालांकि, कैंसर की कोशिकाओं, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु से बच apoptosis के 14 करार दिया; चौथा, कोशिकाओं कोशिकी matrices के पालन करने के लिएआदेश में जीवित रहने के लिए, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं लगाव की जरूरत के बिना आगे बढ़ने और anoikis 19 के लिए प्रतिरोध दिखा सकते हैं; पांचवां, टेलोमिरेज के सक्रियण टेलोमेर छोटा करने में गतिरोध उत्पन्न और replicative वार्धक्य 21 रोकता है; पिछले नहीं बल्कि कम से कम, बदल आनुवंशिक सामग्री 15,16 में पिंजरे का बँटवारा परिणामों के बाद डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण का लंघन। इस अविनियमित प्रसार में एक भूमिका निभा कि ओंकोजीन या ट्यूमर शामक की पहचान करने के लिए, चूहों में ट्यूमर के विकास के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं।
प्राथमिक ट्यूमर के विकास को आम तौर पर मौत का मुख्य कारण नहीं है। एक माध्यमिक साइट के लिए प्राथमिक साइट से कैंसर कोशिकाओं के प्रवासन, मेटास्टेसिस में कहा, सबसे कैंसर रोगियों के 22 में मौत का प्रमुख कारण है। मेटास्टेसिस माध्यमिक स्थल पर प्रतिरक्षा हमला, परिस्त्राव और विकास से परहेज है, संचलन के माध्यम से यात्रा, ट्यूमर सेल आक्रमण, intravasation जरूरत पर जोर देता। Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया में हैमेटास्टेसिस और metastasizing सेल 12 के लिए पूर्व आवश्यक वस्तुएँ हैं जो उच्च गतिशीलता और invasiveness के साथ कोशिकाओं, उपज जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में एक स्विच शामिल है। कैंसर प्रक्रिया कैंसर की कोशिकाओं, stromal कोशिकाओं और समर्थक और विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं के बीच पारस्परिक बातचीत सहित विभिन्न कार्यों का एक संयोजन का परिणामी है, कैंसर के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर कैंसर की प्रक्रिया में पूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है। इसी तरह, ट्यूमर वाहिका संरचना प्रभावित कैंसर विरोधी उपचार अक्सर इस प्रकार इन विवो के उपयोग के दृष्टिकोण अपरिहार्य है, इन विट्रो में अध्ययन नहीं किया जा सकता।
स्तन कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक विधियों का विकास किया गया है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल चूहों 5 में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन है। इस प्रयोगात्मक सेटअप में, अन्वेषक इन विट्रो में पसंद का एक सेल लाइन के लिए परिवर्तन की एक विस्तृत रेंज को पेश हो सकता है (यानीupregulation, प्रोटीन की डाउनरेगुलेशन) और त्वचा के नीचे कोशिकाओं इंजेक्षन। इस विधि सरल है और इंजेक्शन प्रक्रिया चूहों पर सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना सरल है, ट्यूमर इंजेक्ट किया जाता है, जिस पर साइट स्तन कैंसर के विकास में हो सकता है स्थानीय स्तन ट्यूमर पर्यावरण और इस माहौल के अभाव का प्रतिनिधित्व नहीं करता है कि मानव विकृति में मनाया कि से अलग है। दूसरे, अनुवांशिक इंजीनियर चूहों में स्तन कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक vivo में उपकरण के रूप में अक्सर इस्तेमाल किया जाता है। इस मॉडल में, ओंकोजीन (यानी PyMT, Neu) अभिव्यक्ति सहज स्तन ट्यूमर एस के गठन के लिए अग्रणी एक स्तन के ऊतकों विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है। इस प्रयोगात्मक सेटअप समय 3 में ट्यूमर के आकार की जाँच के दौरान ड्रग्स या एंटीबॉडी इंजेक्शन लगाने के द्वारा रोग के उपचार के पहलू का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, कमी या भी आईएनएस दे सकता है ब्याज की एक जीन में उत्परिवर्तित अन्य माउस उपभेदों के साथ इन चूहों के प्रजननस्तन ट्यूमर के विकास को 24 में विभिन्न प्रोटीन की भूमिका में ights। इस मॉडल का नकारात्मक पक्ष यह ट्यूमर के आकार और संख्या में भिन्नता होने का खतरा है। इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति के स्तर जीनोम में एकीकरण साइट पर निर्भर करता है और एक और 4 के लिए एक माउस तनाव से बदल सकते हैं। मानव रोग में, केवल कोशिकाओं के एक subpopulation ओंकोजीन व्यक्त या ट्यूमर शमन का स्तर 26 downregulate जबकि इस मॉडल में, transgene की अभिव्यक्ति उपकला मूल के साथ सभी कोशिकाओं के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए, स्तन कैंसर की कोशिकाओं को भी नसों के द्वारा इंजेक्शन जा सकता है 25 (एक मॉडल प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस कहा जाता है)। हालांकि, इस दृष्टिकोण केवल आंशिक रूप से मेटास्टैटिक प्रक्रिया का स्मरण दिलाता है; यह ट्यूमर कोशिकाओं पर आक्रमण और intravasate करने के लिए आवश्यकता circumvents, और ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रचलन में मौजूद हैं, जो बिंदु से शुरू होता है।
हमारे काम में, हम एक Orthotopic सुई का उपयोगआयन मॉडल स्तन कैंसर की प्रगति 13 में ब्याज की जीन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए। हम मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में प्रोटीन overexpress और इशारा / SCID गामा (एनएसजी) चूहों के स्तन वसा पैड में उन्हें इंजेक्षन। यह इंजेक्शन सेल लाइन में बहुत तेजी से और विविध आनुवंशिक परिवर्तन, यह विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक स्थलों पर मेटास्टेसिस के लिए प्राथमिक ट्यूमर के विकास से स्तन कैंसर की प्रगति की पूरी प्रक्रिया को शामिल किया गया है की अनुमति देता है, और यह भी एक अच्छा प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है: इस विधि को कई मायनों में फायदेमंद है रोग का जल्दी या देर चरणों में चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों या कोशिकाओं का उपयोग करके रोग प्रगति में कैंसर सेल व्युत्पन्न प्रोटीन बनाम स्ट्रोमल की भूमिका की जांच कर सकते हैं। चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, Orthotopic मॉडल एक अधिक tumorigenic और अधिक मेटास्टेटिक कैंसर सेल की आबादी को जन्म दे। इस प्रकार, परिणाम चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त कीझूठी नकारात्मक या ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के Orthotopic मॉडल के उपयोग को प्रोत्साहित करने 6,17 झूठी सकारात्मक या तो हो सकता है।
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Protocol
पशु प्रयोगों लीडेन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर (LUMC) के पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
सेल, उपकरण और चूहे की 1. तैयारी
- आपरेशन से एक दिन पहले, midline के चौथे निपल से इशारा / SCID गामा (एनएसजी) चूहों दाढ़ी और सभी चूहों को मोटे तौर पर तुलनीय वजन है कि सत्यापित करने के लिए चूहों का वजन।
- , दो चिमटी और दो सीधे मच्छर संदंश (चित्रा 1 ए) के एक कैंची आटोक्लेव।
- आपरेशन के दिन पर, मानव स्तन ग्रंथिकर्कटता (एमडीए MB-231) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार इंजेक्ट किया जाएगा कि कोशिकाओं, 7.4 पीएच धोने और कोशिकाओं trypsinize। कोशिकाओं की चोटी पर 10 मिलीलीटर सीरम युक्त DMEM मीडिया जोड़कर trypsin बुझाना। सीरम के बिना पीबीएस में या मीडिया में या तो कोशिकाओं resuspending द्वारा सीरम दूर करने के लिए आरटी पर 7 मिनट के लिए 1200 rpm पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। पूरी तरह से सीरम के निशान को दूर करने के लिए उन्हें फिर से अपकेंद्रित्र। पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend यामीडिया।
- एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और कोशिकाओं की राशि की गणना। नहीं 150 से अधिक μl में 500,000 कोशिकाओं / माउस का प्रयोग करें। पीबीएस या मीडिया के लिए वैकल्पिक, Matrigel में कोशिकाओं resuspend।
नोट: इस्तेमाल सेल प्रकार के आधार पर कोशिकाओं की राशि का निर्धारण करते हैं। - एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं की जगह और बर्फ पर उन्हें रखने के लिए।
- 35 पीबीएस पीएच 7.4 मिलीलीटर और 70% इथेनॉल के साथ एक और 50ml शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें। प्रत्येक ट्यूब में कपास swabs भिगोएँ।
2. Orthotopic के इंजेक्शन
- एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए एक बाँझ हुड में सर्जरी प्रदर्शन। / किग्रा शरीर के वजन 100 मिलीग्राम क्रमशः 10mg / किलो, की एक खुराक पर Xylazin / Ketamine मिश्रण इंजेक्शन लगाने subcutaneously द्वारा माउस anesthetize। एक हीटिंग पैड पर माउस को ठीक करें। पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की सफलता की पुष्टि करें।
नोट: एक सर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ बहुत परिचित नहीं है, तो सर्जरी में लंबा समय लग सकता है। व्यवस्थित करेंसंज्ञाहरण तदनुसार खुराक। - बाहर सुखाने से आंखों को रोकने के लिए, चूहों की आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
- कदम 1.6 में तैयार इथेनॉल में डूबा कपास झाड़ू का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र को साफ। योजना बनाई चीरा साइट से दूर घूर्णन एक परिपत्र फैशन में betadine और शराब तीन बार का उपयोग कर scrubs की बारी प्रदर्शन किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, एक कीटाणुनाशक के रूप में ionophore का उपयोग करें।
- एक कैंची के साथ चौथे निप्पल और midline के बीच एक छोटा सा चीरा और पीबीएस 7.4 पीएच के साथ सिक्त कपास झाड़ू डालने से एक जेब बनाते हैं।
- स्तन वसा पैड को बेनकाब करने के लिए एक चिमटी का प्रयोग करें। अपनी सफेद रंग से वसा पैड का निरीक्षण करें।
- इसके आधार से अन्य चिमटी से नोचना साथ वसा पैड निचोड़; ऐसा करने से, पूरी तरह से आसानी से इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए वसा पैड (चित्रा 1 बी) बेनकाब।
- ऊपर और नीचे pipetting द्वारा सेल मिश्रण homogenize। धीरे एक इंसुलिन सिरिंज में सेल निलंबन के 50 μl महाप्राण और में इंजेक्षनक्षैतिज सुई धारण करके स्तन वसा पैड। वसा पैड की सूजन के लिए जाँच करके सफल इंजेक्शन की पुष्टि करें।
- धीरे वसा पैड रिलीज।
- एक सुई के ड्राइवर का उपयोग करके चीरा सीवन। तीन दक्षिणावर्त, विरोधी दक्षिणावर्त और घड़ी की दिशा में सुई ड्राइवर के आसपास सीवन बदल कर फेंकता बनाओ। सिवनी प्रति दो नॉट इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
नोट: समुद्री मील अन्यथा चूहों टांके खोल सकते तंग कर रहे हैं सुनिश्चित करें। - सर्जरी के बाद, दर्द को दूर करने के क्रम में 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा वजन, subcutaneously पर इस तरह के temgesic के रूप में, एक एनाल्जेसिक इंजेक्षन।
- वे चेतना हासिल करने और sternal लेटना बनाए रखने के लिए जब तक नायाब जानवरों मत छोड़ो। वे पूरी तरह से बरामद कर रहे हैं जब तक अलग-अलग पिंजरों में सभी जानवरों रखें।
- , बाँझपन बनाए रखने autoclaved पिंजरों और पानी का उपयोग करने के लिए। स्वच्छ वातावरण बनाए रखने के लिए हर तीन दिन पिंजरों बदलें।
विश्लेषण के लिए 3. फसल काटने वाले अंग
- परफसल के दिन, 8 सप्ताह कोशिकाओं के आरोपण के बाद, प्रत्येक माउस के लिए 3 मिलीलीटर Bouin के समाधान के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब भरना। इसके अलावा, माउस प्रति 5 एमएल formalin समाधान के साथ भरा दो 15 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें।
- 10 मिलीग्राम की एक खुराक पर, Xylazin / Ketamine इंजेक्शन द्वारा जानवरों चतनाशून्य / 100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन subcutaneously किलो। पशु पैर के अंगूठे चुटकी वापसी पलटा खो देता है जब तक प्रतीक्षा करें।
- एक आधार पर सुइयों के साथ जानवर को ठीक करें। कैंची के साथ एक लंबी, ऊर्ध्वाधर midline चीरा बनाओ। ठीक सामने पैर के नीचे और पीछे के पैर के ऊपर दो क्षैतिज चीरों बनाओ। आधार के लिए त्वचा लगाए द्वारा ट्यूमर बेनकाब। एक कैलीपर का उपयोग करके ट्यूमर मात्रा को मापने।
- कैंची का उपयोग त्वचा से ट्यूमर अलग कर देना। स्नैप आरएनए अलगाव के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूमर का एक हिस्सा फ्रीज। आयल एम्बेडिंग निम्नलिखित immunohistochemistry के प्रदर्शन करने के लिए formalin से भर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में, दूसरे भाग में ही।
- धीरे फेफड़ों के लिए बाहर ले। रखेंBouin के समाधान में फेफड़ों के छोड़ दिया है। 3 दिनों के लिए समाधान में फेफड़ों रखें। नग्न आंखों के लिए स्पष्ट रूप से सतही मेटास्टैटिक foci को ध्यान से देखें। वैकल्पिक रूप से, haematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला का उपयोग micrometastasis सत्यापित करने के लिए formalin में सही फेफड़ों जगह है।
नोट: फेफड़ों मेटास्टेसिस स्तन कैंसर में अक्सर देखा, हालांकि, एक भी मेटास्टेसिस का विश्लेषण करने की हड्डी, यकृत, मस्तिष्क और तिल्ली इकट्ठा करने के लिए चाहते हो सकता है। मेटास्टैटिक क्षेत्र में कोशिकाओं को सघन और आकृति विज्ञान के अलग-अलग हैं और इसलिए फेफड़े के ऊतकों से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। - एक दिन फसल के बाद, 15 मिलीलीटर ट्यूब से formalin समाधान महाप्राण और 70% इथेनॉल के साथ बदलें। आयल में ऊतकों शामिल करें और immunohistochemistry अध्ययन करते हैं।
- रक्त विश्लेषण के लिए, कैंची से छाती गुहा खुला। कार्डियक पंचर के माध्यम से 450 μl रक्त वापस ले लें। 3.2% सोडियम साइट्रेट के 50 μl युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में खून का नमूना रखें। रक्त एकत्र किया जाता है के बाद, 10 मील के लिए 2000 XG पर स्पिनएन। आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा नमूनों की दुकान।
नोट: वहाँ आमतौर पर अभ्यास 20 में इस्तेमाल कई अन्य रक्त संग्रह तकनीकों हैं और इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है कि तकनीक प्रयोगात्मक सेटअप और वैज्ञानिक की पसंद पर निर्भर करता है। रक्त के नमूने की आवश्यकता नहीं है, तो पशु प्रोटोकॉल के लिए या संस्था के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुसार पशु euthanize।
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Representative Results
"Orthotopic स्तन कैंसर मॉडल" के सफल आवेदन स्तन वसा पैड में कोशिकाओं के समुचित इंजेक्शन पर आधारित है। ऐसी कोशिकाओं या रिसाव की imprecise टीका प्रयोगात्मक रूप में त्रुटियों के ट्यूमर के आकार या एक नियंत्रण बफर (2A चित्रा) के साथ इंजेक्शन एक स्तन वसा पैड करने के लिए इसी तरह की तलाश में एक संरचना के गठन की ओर जाता है जो एक ट्यूमर का भी अभाव में बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकता है। ट्यूमर की वृद्धि दर इंजेक्ट सेल लाइन की प्रकृति पर निर्भर है और सामान्य रूप में, चूहों (चित्रा 2B) की त्वचा के माध्यम से देखा जा सकता है। इन विट्रो प्रयोगों के विपरीत, ट्यूमर कोशिकाओं की वृद्धि दर विवो में समय (चित्रा -2) में निरंतर नहीं किया जा सकता। हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी के कारण, परिगलित क्षेत्रों फार्म का हो सकता है और इन क्षेत्रों में ट्यूमर (चित्रा 2 डी) की विकास दर को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, ब्याज की जीन एक निश्चित चरण प्रभाव हो सकता हैकैंसर प्रगति की (जल्दी या देर से), इस प्रकार प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, ट्यूमर के विकास को तेजी से शुरू है, लेकिन अंत में या ठीक इसके विपरीत नीचे धीमी हो सकती है।
केयर ट्यूमर को हटाने की प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए; कठोर से निपटने के ट्यूमर की संरचना को प्रभावित और immunohistochemical विश्लेषण में समस्याओं की ओर जाता है हो सकता है। ट्यूमर के आसपास के क्षेत्र संवहनी remodeling से उठता है कि बड़े जहाजों प्रदर्शित कर सकता है। इन जहाजों अपशिष्ट उत्पादों के हटाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और इस तरह के ट्यूमर के विकास (चित्रा 2 बी) की सुविधा के पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के साथ ट्यूमर के ऊतक की आपूर्ति। Neovessels (एंजियोजिनेसिस) के गठन neovessel मार्करों के लिए ट्यूमर धुंधला द्वारा जांच की जा सकती है (यानी CD31, CD34)।
Bouin के समाधान में फेफड़ों का संग्रह फेफड़ों पर सतही मेटास्टैटिक foci (चित्रा 3A) कल्पना करने के लिए मदद करता है। foci पीला रंग एक के माध्यम से फेफड़े के ऊतकों से प्रतिष्ठित किया जा सकता हैडी 18 का पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं। मेटास्टेसिस फेफड़ों की सतह पर गठित foci के संख्या के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, foci के गठन सेल लाइन पर निर्भर है; गैर-आक्रामक कोशिकाओं केवल micrometastasis या सब पर कोई मेटास्टेसिस को जन्म दे। माइक्रो मेटास्टेसिस आसानी से आयल एम्बेडेड फेफड़े के ऊतकों (चित्रा -3 सी) पर एक haematoxylin / eosin धुंधला के साथ पहचाना जा सकता है।
चित्रा 1:। स्तन वसा पैड में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए आवश्यक सामग्री और तरीके (ए) सर्जिकल उपकरणों (बी) स्तन वसा पैड का जोखिम दिखा प्रतिनिधि तस्वीर।।
चित्रा 2:। चूहों में Orthotopic स्तन ट्यूमर के विकास का अवलोकन (ए) मीडिया पर नियंत्रण या
चित्रा 3: फेफड़े में ट्यूमर मेटास्टेसिस (ए) orthotopically ट्यूमर कोशिकाओं (एमडीए MB-231) के साथ इंजेक्शन थे कि चूहों के फेफड़ों।। Bouin के समाधान में फेफड़ों के ऊष्मायन फेफड़ों पर मेटास्टैटिक foci को उजागर करता है। नियंत्रण चूहों से (बी) के फेफड़ेउस पर नियंत्रण मीडिया के Orthotopic इंजेक्शन कराना पड़ा। स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है, इन पर नियंत्रण फेफड़ों स्थूल मेटास्टेसिस नहीं दिखाते। (सी) एच एंड ई धुंधला फेफड़े के ऊतकों में मेटास्टैटिक क्षेत्र से पता चलता है। डालने मेटास्टैटिक फोकस युक्त फेफड़े के ऊतकों की एक कम बढ़ाई अवलोकन से पता चलता है। डालने में काले धराशायी आयत बड़े पैनल में प्रतिनिधित्व किया है। ट्यूमर कोशिकाओं सफेद धराशायी लाइन ने संकेत दिया जाता है; बड़ा और सघन नाभिक ध्यान दें। (काला पैमाने बार = 100 माइक्रोन, सफेद पैमाने बार = 20 माइक्रोन)
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Discussion
स्तन कैंसर की कोशिकाओं की orthotopic इंजेक्शन कैंसर के विकास के सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। चूहों के स्तन वसा पैड में इन कोशिकाओं का प्रत्यारोपण ध्यान से ट्यूमर के विकास में परिवर्तन को रोकने के लिए किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक माउस के लिए कोशिकाओं का एक ही राशि इंजेक्शन लगाने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, एक कड़ाई से कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना कोशिकाओं trypsinize चाहिए। अलाभकारी कोशिकाओं व्यवहार्य सेल नंबर निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है मर चुका है और व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच विभेद करने के लिए मदद कर सकते हैं कि सेल गिनती और अभिकर्मकों (यानी trypan नीले) के दौरान की अवहेलना किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के clumps के गठन सेल clumps के गठन सेल गिनती के दौरान समस्याओं के कारण के रूप में ऊपर और नीचे कोशिकाओं pipetting से बचा और सेल नंबर की गलती की ओर जाता है किया जाना चाहिए। ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू कोशिकाओं को खुद की मात्रा है। प्रोटोकॉल अनुभाग, सेल के रूप में वर्णितएस पीबीएस या मीडिया में उन्हें निलंबित करने के क्रम में pelleted कर रहे हैं। पीबीएस या मीडिया जोड़ने से पहले, कोशिकाओं की मात्रा मीडिया के विभिन्न संस्करणों के साथ भरा ट्यूब के साथ गोली की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। इसके बाद सेल मात्रा निम्न सूत्र के अनुसार, इरादा मीडिया मात्रा से घटाया जा सकता है:
जोड़े जाने के लिए = गणना की मात्रा की जरूरत है कि मीडिया की मात्रा - सेल की मात्रा
प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाता है कि अभिकर्मकों; इसलिए प्रोटोकॉल अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है उसके अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। प्रयोग ट्यूमर प्रगति में एक झिल्ली प्रोटीन की भूमिका को स्पष्ट करना है अगर उदाहरण के लिए, trypsinization झिल्ली प्रोटीन के पाचन में परिणाम और कलाकृतियों 9 का कारण बन सकता है। यह चिंता का विषय है, तो बफर EDTA समाधान का उपयोग कर या कोशिकाओं scraping कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विकल्प है। जैसा कि ऊपर कहा, कोशिकाओं मीडिया, पीबीएस या Matrigel के लिए में resuspended किया जा सकता हैआर इंजेक्शन। Matrigel इस प्रकार fatpad के बाहर लीक कोशिकाओं को कम करने, वसा पैड में polymerizes के रूप में इन के अलावा, Matrigel एक सुविधाजनक विकल्प है। इसके अलावा, Matrigel की उपस्थिति में engraftment ऐसे स्तन कैंसर कोशिका लाइन एमडीए MB-435 2, मानव अवअधोहनुज कार्सिनोमा A253, मानव बाह्यत्वचाभ कार्सिनोमा KB और माउस मेलेनोमा B16F10 कोशिकाओं के रूप में 7 ट्यूमर के विकास और निश्चित सेल लाइनों के मेटास्टेटिक संभावित वृद्धि कर सकते हैं। कुछ Matrigel तैयारी संभावित प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करने वाले विकास कारकों होते हैं कि कृपया ध्यान दें। हालांकि, वृद्धि कारक समाप्त Matrigel विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध है। इसके अतिरिक्त, Matrigel एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के रूप में कार्य करता है और Integrin कैंपेन्स सक्रिय। अनुसंधान प्रश्न ट्यूमर के विकास में Integrin समारोह की भूमिका शामिल है इस प्रकार, यदि एक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए एक कैरियर के रूप में मीडिया या पीबीएस का उपयोग करना चाहिए।
हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, हम में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं (एमडीए MB-231) इंजेक्टएनएसजी चूहों के स्तन वसा पैड। immunodeficient चूहों का उपयोग स्पष्ट रूप से यह कठिन कैंसर के विकास में immunoregulatory जीन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए बनाता है। हालांकि, यह इंजेक्ट किए जाने की आवश्यकता है कि कोशिकाओं माउस मूल 23 है, तो इस तकनीक को भी बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एमडीए MB-231 सेल लाइन इसलिए, स्तन कैंसर के विकास में हार्मोन के प्रभाव को याद आ रही है एस्ट्रोजन रिसेप्टर नकारात्मक (ईआर) है। फिर भी, हमारे पिछले काम में इस तकनीक को भी इस तरह के MCF 7 के रूप में 13 ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए संभव है कि पता चला है। आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग पत्रों के नीचे सूचीबद्ध हैं:
प्रक्रिया ही साथ ही कुछ महत्वपूर्ण चरणों में हैं। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के विपरीत, Orthotopic इंजेक्शन चूहों पर सर्जिकल प्रक्रियाओं को शामिल करना। इसलिए, सर्जिकल उपकरण अच्छी तरह से साफ किया और autoclaved किया जाना चाहिए। ध्यान दें, मानव कोशिकाओं का प्रत्यारोपण में सेस्तन वसा पैड immunodeficient चूहों (जैसे, मंजूरी / SCID) के उपयोग की आवश्यकता है। इसलिए इंजेक्शन अधिमानतः बाँझ उपकरणों का उपयोग कर, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाहर किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान, सुई ऊपर की ओर का सामना करना पड़ सुई खोलने के साथ सही कोण पर रखा जाना चाहिए। इस स्थिति में सुई होल्डिंग रिसाव कम कर देता है और इस तरह से सफल इंजेक्शन स्तन वसा पैड की सूजन देख द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। सर्जरी प्रदर्शन जब इसके अलावा, यह ट्यूमर के विकास के साथ घाव भरने की प्रक्रिया के हस्तक्षेप से बचने के क्रम में कुछ दूरी पर स्तन वसा पैड से एक चीरा बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, चीरा मुश्किल हो सकता है स्तन वसा पैड को उजागर के रूप में, या तो स्तन वसा पैड से बहुत दूर नहीं बनाया जाना चाहिए।
प्रक्रिया के बाद जानवरों को नियमित रूप से जाँच की जानी चाहिए। कारण संवेदनाहारी के लिए सर्जरी और प्रदर्शन करने के लिए, चूहे भी पर्याप्त असुविधा या अनुभव हो सकता हैमरना। इस प्रकार, प्रक्रिया के बाद पहले हफ्ते महत्वपूर्ण है और चूहों सावधानी से नजर रखी जानी चाहिए। प्रत्यारोपित कोशिकाओं के विकास दर पर निर्भर करता है, ट्यूमर मात्रा 4 बार एक सप्ताह तक मापा जा सकता है। इंजेक्शन कोशिकाओं को भी एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कैमरे का उपयोग कर, प्राथमिक और metastatic ट्यूमर कोशिकाओं के ट्रैकिंग सक्षम, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या luciferase के साथ टैग किया जा सकता है। ट्यूमर ulcerations कि क्षति ट्यूमर के ऊतक को हो सकती है के रूप में बहुत बड़े आकार तक पहुँचने के लिए अनुमति दी जा कभी नहीं करना चाहिए। इस ट्यूमर के ऊतक के समुचित immunohistochemical विश्लेषण आसानी और क्षमता हो सकती है। ट्यूमर काटा जाता है एक बार, एक ट्यूमर नख़रेबाज़ और माता पिता के बीच मतभेद की जांच और वसा पैड से पारित कर दिया (MFP) सेल लाइनों 11 mammay के लिए एक नया स्तन कैंसर कोशिका लाइन बनाने के लिए फैलाया ट्यूमर कोशिकाओं संवर्धन पर विचार हो सकता है।
अंत में, हम इस पत्र में उल्लिखित है कि Orthotopic स्तन कैंसर आरोपण कैंसर से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के क्रम में एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। एक सीएएन या तो upregulating द्वारा इंजेक्शन कोशिकाओं के जीनोम में हेरफेर या ब्याज की जीन downregulating और प्राथमिक ट्यूमर के विकास, एंजियोजिनेसिस या मेटास्टेसिस पर उसके प्रभाव की जाँच करें। यह दृष्टिकोण प्रोटो-ओंकोजीन, ट्यूमर supressors या EMT में शामिल कर रहे हैं कि जीन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, सेल लाइनों कैंसर प्रगति में स्ट्रोमल डिब्बे के प्रभाव की जांच करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को इंजेक्शन जा सकता है। हम दृढ़ता के कारण pathophysiological प्रक्रिया के अपने उच्च आवृत्ति करने के aforementioned स्तन कैंसर से अधिक मॉडल Orthotopic इंजेक्शन तकनीक के इस्तेमाल के लिए प्रोत्साहित करते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
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