Summary
癌は、腫瘍の周囲の組織だけでなく、ローカルプロ - および抗炎症性メディエーターによって影響される複雑な疾患である。したがって、むしろ皮下モデルより異方性注入モデルは、方法をより良く模倣するヒト病理における癌の進行を研究するために有用であり得る。
Abstract
乳癌増殖は、モデルの過多を使用してマウスで研究することができる。乳癌細胞の遺伝子操作は、発癌の進行に関与するタンパク質の機能への洞察を提供するか、または新たな腫瘍抑制因子を発見するのを助けることができる。さらに、異なる遺伝子型を有するマウスに癌細胞を注入する間質区画の重要性のよりよい理解を提供するかもしれない。多くのモデルは、疾患の進行の特定の局面を調査するために有用であり得るが、全体の癌のプロセスを反復しない。対照的に、マウスの乳房脂肪パッドに乳癌細胞の生着が、より適切な間質区画、従ってより良い模倣するヒト癌性疾患の疾患および存在の位置を再現する。この記事では、同所マウスに乳癌細胞を移植し、分析するために、組織を収集する方法を説明する方法を説明します:14px;行の高さ:28px; ">腫瘍環境および転移遠隔臓器にこのモデルを用いて、癌の多くの側面(成長、血管新生、および転移)は、腫瘍細胞が成長するための適切な環境を提供することにより、簡単に調べることができる。
Introduction
がんは何世紀にもわたってのための研究の対象となっている非常に複雑な疾患である。乳がんは、最も一般的な癌型です。それは女性で主に発生するが、散発的にも、男性27内に発生する可能性があります。この疾患は、主に次に体内の細胞の無限増殖をもたらす細胞分裂を支配する制御機構の損失によって引き起こされる。これらの不具合がいくつかのメカニズムによって引き起こされる可能性がありますまず、正常細胞は、癌細胞が自分自身の成長因子を行うため、より高い増殖率1を得る成長因子受容体の発現を増加させるのに対して、増殖するために、周囲のセルからの増殖シグナルを必要とする。第二に、癌細胞は、抗増殖シグナル8を受けにくい。第三の、また必要とされる体細胞死細胞数のバランスをとる。しかし、癌細胞は、プログラム細胞死から脱出アポトーシス14と呼ばれる。第四に、細胞は、細胞外マトリックスに付着生き残るために、腫瘍細胞は付着を必要とせずに成長し、アノイキス19に対する抵抗性を示すことができるために。第五、テロメラーゼの活性化は、テロメアの短縮を回避し、複製老化21を防ぎます。最後のではなく、少なくとも、変更された遺伝的内容15,16における有糸分裂の結果、以下のDNAの品質管理のスキップ。この調節解除された増殖に役割を果たす癌遺伝子または腫瘍抑制因子を同定するために、マウスにおける腫瘍増殖実験は重要である。
原発腫瘍の成長は、一般的に死の主な理由ではありません。セカンダリサイトへのプライマリサイトから癌細胞の移動、転移と呼ばれるが、ほとんどの癌患者の死亡の主要な原因で22です。転移はセカンダリサイトでの腫瘍細胞の浸潤、血管内、循環を通過する、免疫攻撃を回避し、血管外漏出と成長を伴う。間葉移行(EMT)の上皮は、キープロセスである転移および転移性細胞12のための前提条件である、より高い運動性と侵襲性で細胞をもたらす遺伝子発現プロファイル、スイッチを伴う。癌処理としては、がん細胞、ストローマ細胞とプロと抗炎症性細胞との間の相互の相互作用を含む様々なアクションの組み合わせの結果として、癌にin vitroでのアプローチは、多くの場合、癌のプロセスに完全な洞察を提供していませんされている。同様に、腫瘍血管系に影響を与える抗癌治療は、しばしば、したがって、インビボでの使用が避けられない近づき、 インビトロで研究することができない。
乳癌の進行を研究するために、異なる実験的方法が開発されている。最も広く使用されるモデルは、マウス5に乳癌細胞の皮下注射である。この実験では、研究者は、in vitroで選択した細胞株の変化の広い範囲を導入することができる( すなわちアップレギュレーション、タンパク質のダウンレギュレーション)と皮膚の下に細胞を注入する。この方法は簡単で、注入プロセスがマウスの手術を実行する必要なしに単純であるが、腫瘍が注入される部位は、ローカル乳腺腫瘍環境を表していないと、この環境の欠如は、乳癌の発達をもたらし得るヒト病態において観察されるものとは異なる。第二に、遺伝子操作されたマウスは、乳癌の進行を研究するためのin vivoでのツールとして頻繁に使用される。このモデルでは、癌遺伝子( すなわち PyMT、ノイ)の発現は、自発乳癌sの形成をもたらす乳房組織特異的プロモーターによって駆動される。この実験は、時間3における腫瘍の大きさを確認しながら、薬物または抗体を注入することによって、疾患の治療の側面を研究するのに有用である。しかし、欠損またはまたインを与えるかもしれない、目的の遺伝子に変異した他のマウス系統とこれらのマウスの繁殖乳房腫瘍増殖24の異なるタンパク質の役割にights。このモデルの欠点は、腫瘍の大きさおよび数の変動を受けやすいということである。さらに、導入遺伝子発現のレベルは、ゲノム中の組込み部位に依存し、別の4一つのマウス株から変更することができる。ヒト疾患において、細胞の亜集団のみが癌遺伝子を発現するかまたは腫瘍抑制レベル26を下方のに対し、このモデルでは、導入遺伝子の発現は、上皮起源のすべての細胞によって達成することができる。転移を研究するために、乳癌細胞を静脈内注射することができる25(モデルは、実験的転移と呼ばれる)。しかし、このアプローチは、部分的にしか転移プロセスを再現する。それは、腫瘍細胞が侵入しintravasateするための要件を回避し、腫瘍細胞が容易に循環中に存在するところから始まる。
私たちの研究では、同所注入を使用乳癌進行13における目的の遺伝子の関与を研究するためのイオンモデル。本発明者らは、ヒト乳癌細胞においてタンパク質を過剰発現し、NOD / SCIDガンマ(NSG)マウスの乳房脂肪パッドにそれらを注入する。この方法は、多くの点で有利である:それは、注入された細胞株において非常に急速な多様な遺伝的変化を可能にし、それは病理学的に関連する部位に転移する原発性腫瘍成長の乳癌進行のプロセス全体をカバーし、それはまた、良好な実験モデルを提供疾患の初期または後期段階での治療処置の影響を研究するため。また、このモデルを用いたものは、遺伝的に改変されたマウスまたは細胞を用いて疾患の進行中の癌細胞由来のタンパク質対間質の役割を調べることができる。皮下注射は実行が容易であるが、同所性モデルは、より腫瘍形成、より転移性癌細胞集団を生じる。したがって、結果は、皮下注射により得られるSは、偽陰性または腫瘍増殖を研究するための同所モデルの使用を奨励6,17偽陽性のいずれかである可能性があります。
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Protocol
動物実験は、ライデン大学医療センター(LUMC)の動物福祉委員会によって承認された。
細胞、楽器やマウスの作製
- 操作前日は、正中線に第四の乳首からNOD / SCIDガンマ(NSG)マウスを剃ると、すべてのマウスがほぼ同程度の重みを持っていることを確認するために、マウスの重量を量る。
- はさみ、2ピンセットと2ストレートモスキート鉗子( 図1A)をオートクレーブ。
- 操作の日に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一回注射するヒト乳腺癌(MDA-MB-231)細胞を洗浄し、pH7.4で、細胞をトリプシン処理。細胞の上の10mlの血清含有DMEM培地を添加することによりトリプシンをクエンチする。血清を含まないPBS中またはメディアのいずれかで細胞を再懸濁することによって血清を除去するために、室温で7分間1200 rpmで細胞を遠心します。完全に血清の痕跡を除去するためにそれらを再度遠心します。 PBSに細胞を再懸濁またはメディア。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、細胞の量を計算する。しないより150以上μlの500,000細胞/マウスを使用しています。 PBSまたはメディアへのオプション、マトリゲルで細胞を懸濁します。
注:使用する細胞の種類に応じて、細胞の量を決定します。 - 滅菌マイクロチューブに細胞を配置し、氷の上に保管してください。
- 35 PBS pHを7.4 mlの70%エタノールを有する別の50mlの円錐形遠心分離管と、ワン50mlコニカル遠心チューブを埋める。各チューブに綿棒を浸す。
2.同所インジェクション
- 無菌雰囲気を維持するために、無菌フード内で手術を行う。それぞれの10mg / kgを、100 mg / kg体重の用量でキシラジン/ケタミン混合物を皮下注射することによってマウスを麻酔。加熱パッド上でマウスを修正。つま先のピンチに反応の欠如によって麻酔の成功を確認してください。
NOTE:一つは外科手術手順に精通していない場合は、手術が長くかかる場合があります。アレンジ麻酔はそれに応じて投与量。 - 乾燥から目を防ぐために、マウスの眼に眼軟膏を適用します。
- ステップ1.6で作成エタノールに浸漬綿棒を使って、剃らエリアを清掃してください。離れて計画された切開部位から回転する円形の方法でベタジンとアルコール3回を使用して交互にスクラブを実行する必要があります。また、消毒剤としてイオノフォアを使用しています。
- はさみで四ニップルと正中線の間に小さな切開を行い、PBSのpHは7.4で湿らせた綿棒を挿入してポケットを作る。
- 乳腺脂肪体を露出させるためにピンセットを使用してください。その白い色で脂肪パッドを観察します。
- そのベースから他のピンセットで脂肪パッドを絞る。これを行うことで、完全に簡単に注入を実行するために脂肪パッド( 図1B)を公開します。
- ピペッティングにより細胞混合物を均質化する。静かにインスリン注射器に細胞懸濁液50μlを吸引しに注入水平に針を保持することによって乳腺脂肪パッド。脂肪パッドの腫れのためにチェックすることで成功した注射を確認します。
- 優しく脂肪パッドを離します。
- 針ドライバを使用して切開部を縫合する。 3時計回り、反時計回りおよび時計回りに針ドライバの周りに縫合糸を回すことによりスロー行う。縫合ごとに2つの結び目を使用する必要があります。
注:ノットが締まっているそうでマウスが縫合糸を開くことができていることを確認してください。 - 手術後、痛みを緩和するために、0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重、皮下にかかるtemgesicとして、鎮痛剤を注入する。
- 彼らが意識を獲得し、胸骨横臥を維持するまで無人の動物に放置しないでください。彼らは完全に回復するまで、別のケージにすべての動物を置きます。
- 無菌性を維持するために、オートクレーブケージと水を使用する。清浄な雰囲気を保つために3日ごとにケージを変更します。
分析のための3.収穫臓器
- アット収穫の日は、8週間の細胞の移植後、各マウスのための3ミリリットルブアン液で15ミリリットルコニカル遠心管を埋める。また、マウス当たり5ミリリットルホルマリン溶液で充填された2つの15ミリリットルチューブを使用。
- 10ミリグラムの用量で、キシラジン/ケタミンを注射することによって動物を麻酔/ 100 mg / kg体重の皮下キロ。動物が足指ピンチ引っ込め反射を失うまで待ってください。
- ベース上の針を動物に固定してください。はさみとの長い、垂直正中切開を行います。右の前脚の下と後脚の上に二つの水平切開を行います。ベースに皮膚を固定することによって腫瘍を公開します。キャリパーを用いて腫瘍体積を測定する。
- ハサミを用いて皮膚からの腫瘍を解離。スナップは、RNA単離のために液体窒素中での腫瘍の一部を凍結する。パラフィン包埋以下の免疫組織化学を実行するためにホルマリンで満たされたコニカル遠心チューブに、他の部分を配置します。
- ゆっくりと肺を取り出します。置きブアン溶液中に肺を残した。 3日間溶液中の肺にしてください。肉眼ではっきりと表面的な転移巣を観察します。必要に応じて、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を使用して微小転移を確認するためにホルマリンに右肺を置く。
注:肺転移が乳癌で頻繁に見られ、が、1にも転移を分析するために骨、肝臓、脳および脾臓を収集する場合があります。転移領域における細胞はより高密度と形態学的に異なっており、したがって、肺組織から容易に区別することができる。 - 日は収穫後、15ミリリットル管からのホルマリン溶液を吸引し、70%エタノールで交換してください。パラフィンで組織を埋め込み、免疫組織化学研究を行う。
- 血液分析のために、はさみで胸腔を開く。心臓穿刺を介して450μlの血液を撤回。 3.2%クエン酸ナトリウムを50μl含むマイクロ遠心チューブに血液試料を置く。血液が収集された後、10マイルのために2000×gで、それをスピンN。さらに使用するまで-20℃で血漿サンプルを保管してください。
注:一般的慣行20と実験科学者の選択に依存して使用する必要がある技術で使用されるいくつかの他の血液採取技術がある。血液サンプルを必要としない場合は、動物プロトコルや機関のガイドラインに従って応じて動物を安楽死させる。
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Representative Results
「同所乳癌モデル」の成功したアプリケーションは、乳房脂肪パッドへの細胞の適切な注入に基づいています。このような細胞または漏れの不正確接種の実験誤差は、腫瘍の大きさまたは対照緩衝液( 図2A)を注射した乳房脂肪パッドに似て見て構造が形成される腫瘍であっても非存在下でのばらつきにつながるかもしれない。腫瘍の増殖速度は、注入された細胞株の性質に依存し、一般的には、マウス( 図2B)の皮膚を介して観察することができる。 インビトロ実験とは異なり、腫瘍細胞の増殖速度は、 インビボでの時間( 図2C)で一定でなくてもよい。低酸素および栄養素の不足のため、壊死領域を形成していてもよいし、これらの領域は、腫瘍( 図2D)の増殖速度に影響を与える。また、目的の遺伝子は、特定のフェーズに影響を与える可能性がある癌の進行の(初期または後期)、したがって、実験の設定に応じて、腫瘍の成長が速い開始が、最後に、またはその逆に遅くなる場合があります。
ケアは、腫瘍の除去手順の間に注意が必要です。厳密な取り扱いは、腫瘍の構造に影響を与え、免疫組織化学的分析の問題をもたらすことができる。腫瘍周辺は血管リモデリングから発生する大型船が表示されることがあります。これらの容器は、廃棄物の除去に重要な役割を果たし、それによって腫瘍の増殖( 図2B)を促進する栄養素と酸素と腫瘍組織を供給する。新生血管の形成(血管新生)が新血管マーカー( すなわち 、CD31、CD34)のために腫瘍を染色することによって調べることができる。
ブアン溶液中の肺のコレクションは、肺( 図3A)上の表面的な転移巣を視覚化するのに役立ちます。病巣が淡色ANによって肺組織から区別することができるdは18を検出するのは簡単です。転移は、肺表面上に形成された病巣の数として表すことができる。しかし、フォーカスの形成は、細胞株に依存する。非攻撃的な細胞は唯一の微小転移または全く転移を引き起こす。微小転移が容易にパラフィン包埋した肺組織( 図3C)にヘマトキシリン/エオシン染色により同定することができる。
図1:乳房脂肪パッドの露出を示す材料と方法(A)乳房脂肪パッドに乳癌細胞を注入するために必要な手術用機器(B)の代表的な画像。
図2:マウスにおける同所性乳房腫瘍増殖の概要(A)メディアコントロールまたは
図3:肺への腫瘍転移(A)同所腫瘍細胞(MDA-MB-231)を注射したマウスの肺。ブアン溶液中の肺のインキュベーション肺に転移巣を公開しています。対照マウスから(B)肺すなわち、コントロール培地の同所注射を受けた。明らかなように、これらの制御肺巨視的転移を示さない。(C)H&E染色は、肺組織の転移領域を示している。インサートは、転移巣を含む肺組織の低倍率の概要を示しています。インサートの黒破線の長方形は大型パネルで表されます。腫瘍細胞は、白い点線で示されている。大きく、より高密度の核を注意してください。 (ブラックスケールバー=100μmの、白いスケールバー=20μm)を
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Discussion
乳癌細胞の同所注射は、癌の成長のすべての側面を研究するための強力なモデルである。マウスの乳腺脂肪体におけるこれらの細胞の注入は、慎重に腫瘍成長の変化を防止するために行われるべきである。最も重要なことは、各マウスへの細胞の同量を注入することは重要である。これを行うためには、細胞の生存に影響を与えることなく、厳密に細胞をトリプシン処理すべきである。非生存細胞は、生存細胞数を決定するために有用である可能性が死んで生存細胞を区別するのを助けることができる細胞計数および試薬( 例えばトリパンブルー)中に無視されるべきである。細胞塊の形成は、細胞計数の間に問題を発生させ、細胞数の誤算につながるように細胞塊の形成は、上下の細胞をピペッティングすることによって回避されるべきである。考慮されるべきもう一つの重要な側面は、細胞自体の体積である。プロトコルセクション、セルに記載されているようにSは、PBSまたはメディアでそれらを一時停止するために、ペレット化する。 PBSまたはメディアを追加する前に、細胞の容積は、媒体の異なる容積を充填したチューブをペレットと比較することによって推定することができる。続いて、細胞体積は以下の式に従って、意図された培地容量から減算することができる。
追加される=計算量を必要とするメディアのボリューム - 細胞容積
プロトコルで使用される試薬は、実験の結果に影響を与えることができる。したがって、プロトコルは、研究課題に応じて、それに応じて調整する必要があります。実験は、腫瘍進行における膜タンパク質の役割を解明することを目的とする場合、例えば、トリプシン処理は、膜タンパク質の消化をもたらし、アーティファクト9を引き起こすことがある。これが問題である場合、バッファリングされたEDTA溶液を用いて、または細胞を掻きする細胞を剥離するための代替手段である。 foの上述したように、細胞は培地中に再懸濁させてもよいし、PBSまたはマトリゲルR注入。マトリゲルは、このように脂肪体の外に漏れるの細胞を最小限に抑え、脂肪パッドで重合としてこれらのうち、マトリゲルは便利なオプションです。また、マトリゲルの存在下での生着は、乳癌細胞株MDA-MB-435 2、ヒト顎下癌A253、ヒト類表皮癌KBバイト及びマウスメラノーマB16F10細胞7などの特定の細胞株の腫瘍増殖および転移の可能性を高めることができる。いくつかのマトリゲル調製物は、潜在的に、実験結果に影響を与える成長因子を含むことに注意してください。しかし、成長因子枯渇マトリゲルは、さまざまな供給元から入手可能である。さらに、マトリゲルは、細胞外マトリックス(ECM)として機能し、インテグリンサブセットを活性化させる。調査の質問は、腫瘍増殖におけるインテグリン機能の役割に関与する場合したがって、一方が乳癌細胞のための担体としてメディアまたはPBSを使用してください。
我々の実験では、中にヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)を注射しNSGマウスの乳房脂肪パッド。免疫不全マウスの使用は明らかにそれが難しく、癌の発生における免疫調節遺伝子の関与を研究することができます。しかしながら、注入される必要がある細胞は、マウス起源23を持っている場合、この技術はまた、インタクトな免疫系を有するマウスにおいて使用することができることに留意することが重要である。また、MDA-MB-231細胞株は、従って、乳癌発生におけるホルモンの影響が欠落しているエストロゲン受容体陰性(ER-)である。それでも、我々の以前の研究は、この方法はまた、MCF-7 13としてER +乳癌細胞のために実行可能であることを示した。一般的に使用される乳癌細胞株の腫瘍増殖を研究するためにこの方法を利用して紙を以下に列挙する。
手順自体にもいくつかの重要な手順が含まれています。皮下注射とは異なり、同所注射は、マウスでの外科手術を伴う。したがって、手術器具は、よく洗浄し、オートクレーブする必要があります。ノート、ヒト細胞の移植での乳房脂肪パッドは、免疫不全マウス( 例えば、NOD / SCID)の使用を必要とする。したがって、注射は、好ましくは滅菌器具を用いて、生物学的安全キャビネット内で行われるべきである。また、注入中、針は、針開口部が上向きに直角に保たれるべきである。この位置で針を保持することは、漏れを低減し、このようにして成功した注入が乳腺脂肪体の膨潤を観察することによって確認することができる。手術を行う際に加えて、それは、腫瘍の成長、創傷治癒過程の干渉を回避するためにある程度の距離離れた乳房脂肪パッドから切開することが重要である。しかし、切開は難しいかもしれない乳房脂肪体を露出するように、いずれの乳房脂肪パッドからあまりに遠く行われるべきではない。
手順の後、動物は定期的にチェックする必要があります。による麻酔、手術および暴露、マウスはかなりの不快感を経験する、あるいは可能性死ぬ。このように、手順の後の最初の週は重要であり、マウスは注意深く監視する必要があります。移植された細胞の増殖速度に依存して、腫瘍体積は4週まで測定することができる。注入された細胞は、光に敏感なカメラを使用して、原発性および転移性腫瘍細胞の追跡を可能にする、蛍光タンパク質またはルシフェラーゼでタグ付けすることができる。潰瘍は、腫瘍組織の損傷を生じる可能性がある腫瘍は非常に大きいサイズに到達させてはいけません。これは、腫瘍組織の適切な免疫組織化学的分析を妨げる可能性があります。腫瘍が収穫されると、人は腫瘍ミンチと親の間の差を調査し、脂肪パッドを通過し(MFP)細胞株11を mammay新しい乳癌細胞株を作成するために分散された腫瘍細胞を培養することを考慮するかもしれない。
結論として、私たちはこの論文で概説同所乳癌注入は、癌関連プロセスを研究するために非常に便利なツールです。 One CAnのいずれかレギュレートすることにより注入された細胞のゲノムを操作したり、目的の遺伝子をダウンレギュレートし、原発腫瘍の増殖、血管新生又は転移に対するその効果を確認してください。このアプローチは、プロトオンコジーン、腫瘍サージサプレッサまたはEMTに関与する遺伝子を研究すると便利です。また、細胞株は、癌の進行中の間質区画の影響を調べるために遺伝的に改変されたマウスに注射することができる。私たちは強く病態生理学的プロセスの高い要約のために、上記の乳癌モデル上同所注入技術の使用を奨励する。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
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