Summary
Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.
Abstract
Borstgroei kanker kan worden bestudeerd in muizen met behulp van een overvloed aan modellen. Genetische manipulatie van borstkankercellen kan inzicht in de functie van eiwitten die betrokken zijn bij oncogene progressie of hulp aan nieuwe tumor suppressors ontdekken. Bovendien injecteren kankercellen in muizen met verschillende genotypen misschien beter begrip van het belang van het stromale compartiment verschaffen. Veel modellen kan nuttig zijn om bepaalde aspecten van ziekteprogressie te onderzoeken maar niet herhalen het gehele kankerproces. Daarentegen borstkankercellen enting de uiervet pad muizen betere recapituleert de plaats van de ziekte en de aanwezigheid van het juiste stromale compartiment en dus beter nabootst humane kankerachtige ziekten. In dit artikel beschrijven we hoe je de cellen van borstkanker te implanteren in muizen orthotopically en uitleggen hoe je weefsels aan het analyseren verzamelen: 14px; line-height:. 28px; "> tumor milieu en metastase naar verre organen Met dit model vele aspecten (groei, angiogenese en metastase) kanker kan eenvoudig worden onderzocht door een geschikte omgeving voor tumorcellen groeien.
Introduction
Kanker is een zeer complexe ziekte die onderworpen is geweest aan studies voor de eeuwen heen. Borstkanker is de meest voorkomende vorm van kanker; Het komt voornamelijk bij vrouwen, maar kan sporadisch ook voorkomen bij mannen 27. De ziekte wordt voornamelijk veroorzaakt door het verlies van regelmechanisme besturen celdeling wat leidt tot een oneindige groei van cellen in het lichaam. Deze storingen kunnen worden veroorzaakt door verschillende mechanismen: enerzijds gezonde cellen hebben groei signalen van de omringende cellen om te prolifereren terwijl kankercellen hun eigen groeifactoren en verhoging van de expressie van groeifactorreceptoren dus een hogere snelheid proliferatieve 1 verkrijgen; tweede kankercellen zijn minder gevoelig voor anti-proliferatieve signalen 8; derde, het aantal cellen in het lichaam celdood is ook vereist evenwicht; echter kankercellen ontsnappen van geprogrammeerde celdood, apoptose genaamd 14; vierde cellen zich aan extracellulaire matricesom te overleven, maar tumorcellen kan groeien zonder de noodzaak van hechting en weerstand tegen anoikis 19 tonen; vijfde, activering van telomerase omzeilt de telomeerverkorting en voorkomt de replicatieve senescentie 21; last but not least, het overslaan van DNA kwaliteitscontrole volgende mitose resultaten in gewijzigde genetische inhoud 15,16. Om oncogenen of tumor suppressors die een rol spelen gedereguleerde proliferatie identificeren tumorgroei experimenten bij muizen cruciaal.
Primaire tumor groei is over het algemeen niet de belangrijkste reden van de dood. Migratie van kankercellen van de primaire locatie naar een tweede locatie, genoemd metastase, is de belangrijkste doodsoorzaak in de meeste kankerpatiënten 22. Metastase meebrengt tumorcelinvasie, intravasation, reizen door de circulatie, het vermijden immuun aanval, extravasatie en groei op de secundaire locatie. Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is een belangrijk proces inmetastase en het gaat om een schakelaar in genexpressie profielen waardoor cellen met een hogere beweeglijkheid en invasiviteit, die voorwaarden zijn voor de metastasizing cel 12 zijn. Omdat de kankercellen proces is de resultante van een combinatie van verschillende acties, inclusief de wederzijdse interacties tussen kankercellen, stromale cellen en pro- en anti-inflammatoire cellen, een in vitro benadering van kanker vaak niet tot het inzicht in het kankerproces. Ook behandelingen tegen kanker invloed op de tumor vasculatuur kan vaak niet worden bestudeerd in vitro, waardoor het gebruik van in-vivo-benaderingen is onvermijdelijk.
Om borstkanker progressie te bestuderen, hebben verschillende experimentele methoden ontwikkeld. De meest gebruikte model is de subcutane injectie van borstkankercellen in muizen 5. In deze experimentele opstelling kan de onderzoeker diverse wijzigingen aan te brengen aan een cellijn naar keuze in vitro (dwzopregulatie, downregulatie van eiwitten) en injecteer de cellen onder de huid. Hoewel deze methode is eenvoudig en het injectieproces is eenvoudig zonder dat zij opereren op muizen, is de plaats waar de tumor geïnjecteerd niet de lokale borsttumor omgeving en zonder deze milieu vormen kan resulteren in de ontwikkeling van borstkanker die afwijkt van die in menselijke pathologie. Tweede genetisch gemanipuleerde muizen vaak gebruikt als een in vivo middel borstkanker progressie bestuderen. In dit model wordt oncogen (dwz PyMT, Neu) expressie aangedreven door een borstklierweefsel promotor leidt tot de vorming van spontane borsttumor s. Deze experimentele opstelling is nuttig voor de behandeling aspect van de ziekte te bestuderen door het injecteren van geneesmiddelen of antilichamen terwijl inchecken tumorgrootte tijd 3. Echter, het kweken van deze muizen met andere muizenstammen deficiënt of gemuteerd in een gen van belang kan ook ins gevenECHTEN naar de rol van verschillende eiwitten in moedermelk tumorgroei 24. Het nadeel van dit model is dat het gevoelig voor variatie in tumorgrootte en nummer. Bovendien is het niveau van transgenexpressie afhankelijk van de integratieplaats in het genoom en kan van de ene naar de andere muizenstam 4. In dit model kan de expressie van het transgen worden bereikt door alle cellen van epitheliale oorsprong dat in menselijke ziekte, slechts een subpopulatie van cellen brengen het oncogen of downregulate de tumor suppressor niveau 26. Om metastase studeren, borstkankercellen ook intraveneus worden geïnjecteerd (een model genoemd experimentele metastase) 25. Echter, deze aanpak recapituleert alleen de metastatische proces gedeeltelijk; Het omzeilt het vereiste tumorcellen binnen te dringen en intravasate en begint vanaf het punt waarop tumorcellen gemakkelijk aanwezig in de circulatie.
In ons werk gebruiken we een orthotopic injecterenion model om de betrokkenheid van de genen van belang bij borstkanker progressie 13 bestuderen. We overexpressie van het eiwit in menselijke borstkankercellen en injecteren ze in de uiervet pad van NOD / SCID-gamma (NSG) muizen. Deze werkwijze is voordelig in veel opzichten: het maakt zeer snelle en verschillende genetische veranderingen in de geïnjecteerde cellijn, bestrijkt het gehele proces van borstkanker progressie van primaire tumor groei metastase bij pathologisch relevante sites, en ook een goede experimenteel model voor het bestuderen van het effect van therapeutische behandelingen in vroege of late stadia van de ziekte. Voorts worden volgens dit model kan de rol van stromale versus kankercellen afkomstige eiwitten ziekteprogressie door gebruik van genetisch gemodificeerde muizen of cellen te onderzoeken. Hoewel subcutane injecties zijn makkelijker uit te voeren, orthotopische modellen leiden tot een tumorigene en metastatische kanker celpopulatie. Zo resultaten verkregen met subcutane injecties kunnen ofwel vals-negatieve of vals-positieve 6,17 stimuleren van het gebruik van orthotopische modellen om de tumorgroei te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door het dierenwelzijn commissie van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC).
1. Voorbereiding van de Cellen, Instrumenten en Muizen
- Een dag voor de operatie, scheren de NOD / SCID-gamma (NSG) muizen uit de vierde tepel aan de middellijn en wegen van de muizen om te controleren of alle muizen hebben ongeveer vergelijkbaar gewichten.
- Autoclaaf een schaar, twee pincet en twee rechte mosquitoklem (Figuur 1A).
- Op de dag van de operatie, was de menselijke borst adenocarcinoom (MDA-MB-231) cellen die eenmaal worden geïnjecteerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 en trypsinize de cellen. Doof het trypsine door 10 ml serum-bevattend DMEM medium bovenop de cellen. Centrifugeer de cellen bij 1200 rpm gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur om serum te verwijderen door resuspenderen van de cellen ofwel PBS of medium zonder serum. Centrifuge ze weer naar sporen van het serum volledig te verwijderen. Resuspendeer de cellen in PBS ofmedia.
- Tel de cellen met een hemocytometer en bereken de hoeveelheid cellen. Gebruik 500.000 cellen / muis in niet meer dan 150 pi. Facultatieve PBS of media, resuspendeer de cellen in Matrigel.
OPMERKING: Bepaal de hoeveelheid cellen afhankelijk van het gebruikte celtype. - Plaats cellen in een steriele microcentrifugebuisjes en bewaar ze op ijs.
- Vul een 50 ml conische centrifugebuis met 35 ml PBS pH 7,4 en een 50 ml conische centrifugebuis met 70% ethanol. Soak wattenstaafjes in elke buis.
2. Orthotope Injection
- Voer de chirurgie in een steriele kap een steriele atmosfeer te handhaven. Verdoven de muis door subcutaan injecteren Xylazin / Ketamine mix in een dosis van 10 mg / kg 100 mg / kg lichaamsgewicht. Bevestig de muis op een verwarming pad. Bevestigen het succes van de anesthesie door het gebrek aan reactie op teen knijpen.
OPMERKING: Als men niet erg vertrouwd met chirurgische ingrepen, kan een operatie langer duren. Regelende verdoving dosis dienovereenkomstig. - Breng oogzalf op de ogen van muizen te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Reinig het geschoren gebied met behulp van de wattenstaafje gedompeld in ethanol bereid in stap 1.6. Afwisselend scrubs met behulp van betadine en alcohol drie keer in een circulaire manier weg te draaien van de geplande incisie site moet worden uitgevoerd. U kunt ook gebruik maken van ionofoor als ontsmettingsmiddel.
- Maak een kleine incisie tussen de vierde tepel en de middellijn met een schaar en een zak door het invoegen van het wattenstaafje met PBS pH 7,4.
- Gebruik een pincet om de uiervet pad bloot te leggen. Let op de dikke pad door zijn witte kleur.
- Knijp het vet pad met de andere pincet van zijn basis; door dit te doen, het vet pad (Figuur 1B) volledig bloot aan injecties eenvoudig uitvoeren.
- Homogeniseer het celmengsel door en neer te pipetteren. Zuig 50 pi celsuspensie in een insulinespuit en injecteer inhet uiervet pad door het vasthouden van de naald horizontaal. Bevestig succesvolle injectie door te controleren op zwelling van het vet pad.
- Laat de vetkussentje zachtjes.
- Hecht de incisie met behulp van een naald driver. Maak drie worpen door het draaien van de hechtdraad rond de naald bestuurder met de klok mee, tegen de klok in en met de klok mee. Twee knopen per hechtingen worden gebruikt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de knopen zijn strakke anders muizen kunnen openstellen van de hechtingen. - Na de operatie, injecteert een analgeticum, zoals TEMGESIC bij 0.05-0.1 mg / kg lichaamsgewicht, subcutaan om de pijn te verlichten.
- Laat de dieren niet onbeheerd achter tot ze het bewustzijn krijgen en borstbeen recumbence behouden. Plaats alle dieren in verschillende kooien totdat ze volledig zijn hersteld.
- Om de steriliteit te behouden, gebruiken geautoclaveerd kooien en water. Wijzig de kooien om de drie dagen aan de atmosfeer schoon te houden.
3. Oogsten Organen voor Analyse
- Bij dedag van de oogst, 8 weken na de implantatie van de cellen, vul 15 ml conische centrifugebuizen met 3 ml oplossing Bouin voor elke muis. Daarnaast gebruiken twee 15 ml buisjes gevuld met 5 ml formalineoplossing per muis.
- Verdoven dieren door het injecteren Xylazin / ketamine in een dosis van 10 mg / kg 100 mg / kg lichaamsgewicht subcutaan. Wacht totdat het dier verliest teen knijpen terugtrekking reflex.
- Fix het dier met naalden op een voetstuk. Maak een lange, verticale middellijn incisie met een schaar. Maak twee horizontale incisies direct onder het voorste been en boven het achterste been. Expose de tumor door pinning de huid aan de basis. Meet het tumorvolume met een schuifmaat.
- Distantiëren de tumor van de huid met een schaar. Snap bevriezen een deel van de tumor in vloeibare stikstof voor RNA isolatie. Leg het andere deel, in de conische centrifuge buis gevuld met formaline aan immunohistochemie volgende inbedden in paraffine voeren.
- Neem voorzichtig uit de longen. Plaats delinkerlong in Bouin's oplossing. Houd de long in oplossing gedurende 3 dagen. Observeren oppervlakkige metastatische foci duidelijk blote oog. Eventueel, plaatst de rechter long in formaline om micrometastase controleren met behulp van haematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
Opmerking Hoewel, longmetastasen vaak waargenomen bij borstkanker, kan men ook willen bot, lever, hersenen en milt verzamelen metastase analyseren. De cellen in de metastatische gebied dichter en morfologisch verschillende en derhalve gemakkelijk te onderscheiden van longweefsel. - Een dag na de oogst, zuigen de formaline-oplossing van 15 ml buizen en vervangen door 70% ethanol. De weefsels in paraffine insluiten en het uitvoeren van immunohistochemie studies.
- Voor bloed, het openstellen van de borstholte met een schaar. Terugtrekken 450 ul bloed via cardiale punctie. Plaats bloedmonster in een microcentrifugebuis met 50 pi van 3,2% natriumcitraat. Na het bloed wordt verzameld, draai het op 2.000 xg gedurende 10 min. Bewaar de plasmamonsters bij -20 ° C tot verder gebruik.
OPMERKING: Er zijn verschillende andere bloedafname technieken in de praktijk voorkomende 20 en de techniek die gebruikt moet worden is afhankelijk van experimentele opstelling en de keuze wetenschapper. Als bloedmonster niet vereist, inslapen het dier volgens de dierlijke protocol of vanaf de instelling richtlijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle toepassing van de "orthotoop borstkanker model" is gebaseerd op een goede injectie van cellen in het uiervet pad. Experimentele fouten zoals onnauwkeurig inoculatie van cellen of lekkage kan leiden tot variaties in tumorgrootte of zelfs de afwezigheid van een tumor die leidt tot de vorming van een structuur vergelijkbaar zoek naar een uiervet pad geïnjecteerd met een controle buffer (Figuur 2A). De groei van de tumor af van de aard van de geïnjecteerde cellijn en in het algemeen kan worden waargenomen door de huid van de muizen (Figuur 2B). In tegenstelling tot in vitro experimenten, kan de groei van de tumorcellen niet constant in de tijd in vivo (figuur 2C). Door hypoxie en gebrek aan nutriënten necrotische gebieden vormen en deze gebieden zal de groei van de tumor (figuur 2D) beïnvloeden. Daarnaast kan het gen van belang beïnvloeden bepaalde fasekanker progressie (vroeg of laat), waardoor afhankelijk van de experimentele opstelling, tumorgroei kan snel starten, maar vertraagt eind of vice versa.
Zorg moeten worden genomen tijdens de procedure voor het verwijderen van de tumor; rigoureuze gebruik kan de structuur van de tumor beïnvloeden en leiden tot problemen bij immunohistochemische analyse. Het gebied rond de tumor grote vaten die voortvloeien uit vasculaire remodellering geven. Deze schepen een cruciale rol spelen in de afvoer van afvalstoffen en leveren het tumorweefsel met voedingsstoffen en zuurstof waardoor tumorgroei (Figuur 2B) te vergemakkelijken. Vorming van neovessels (angiogenese) kan worden onderzocht door het kleuren van de tumor voor neovessel markers (dwz CD31, CD34).
Verzameling van de longen in Bouin's oplossing helpt oppervlakkige metastatische foci op de longen (figuur 3A) te visualiseren. De foci kan worden onderscheiden van longweefsel door de bleke kleur eend zijn gemakkelijk te detecteren 18. Metastase kan worden uitgedrukt als het aantal foci gevormd op het longoppervlak. Maar de vorming van foci is cellijn-afhankelijke; niet-agressieve cellen geven aanleiding tot enige micrometastasen of geen metastase helemaal. Micro metastase kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met een hematoxyline / eosine kleuring van paraffine ingebed longweefsel (figuur 3C).
Figuur 1:. Materialen en werkwijzen (A) chirurgische apparatuur nodig voor het injecteren van borstkankercellen in de uiervet pad (B) Representatieve foto die de blootstelling van uiervet pad..
Figuur 2:. Overzicht van de orthotope borst tumorgroei bij muizen (A) Mediabedieningsknoppen of
Figuur 3: Tumor metastase naar de longen (A) longen van muizen die orthotopically werden geïnjecteerd met tumorcellen (MDA-MB-231).. Incubatie van de longen in Bouin's oplossing onthult de metastatische foci op longen. (B) Longen van controle muizendat onderging orthotopische injectie van controle media. Zoals duidelijk blijkt, deze controle longen geen macroscopische metastasen tonen. (C) H & E kleuring toont de metastatische regio longweefsel. De inzet toont een lage vergroting overzicht van het longweefsel met de metastatische focus. De zwarte gestippelde rechthoek in het inzetstuk is weergegeven in het grote venster. Tumorcellen worden weergegeven door de witte streeplijn; let op de grotere en dichtere kernen. (Zwarte schaal bar = 100 micrometer, witte schaal bar = 20 pm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotope injectie van borstkankercellen is een krachtig model voor alle aspecten van de groei van kanker te bestuderen. Implantatie van deze cellen in de uiervet pad van de muizen zorgvuldig worden uitgevoerd om de variatie in tumorgroei voorkomen. Het belangrijkste injecteren dezelfde hoeveelheid cellen aan elke muis cruciaal. Om dit te doen, moet men de cellen trypsinize rigoureus zonder dat de levensvatbaarheid van de cellen. Niet-levensvatbare cellen worden genegeerd tijdens het tellen van cellen en reagentia (bijvoorbeeld trypan blauw) die kunnen helpen om onderscheid tussen dode en levende cellen kunnen nuttig zijn voor het bepalen van het aantal levensvatbare cel. Vorming van klompjes cellen moet worden voorkomen door pipetteren de cellen op en neer vorming van klonten van cellen veroorzaken problemen tijdens celtelling en leidt tot onjuiste berekening van het aantal cellen. Een ander belangrijk aspect dat in aanmerking moet worden genomen, is het volume van de cellen zelf. Zoals beschreven in het protocol sectie, cels gepelleteerd om ze schorten PBS of media. Voor het toevoegen van PBS of media, kan het volume van de cellen wordt geschat door de pellet met buizen gevuld met verschillende volumes media. Vervolgens het celvolume kan worden afgetrokken van het beoogde media volume, volgens de volgende formule:
Volume van de media die worden toegevoegd = berekende volume moet - het volume van de Cel
Reagentia die worden gebruikt in het protocol kan de uitkomst van het experiment beïnvloeden; daarom het protocol dienovereenkomstig afhankelijk van de onderzoeksvraag worden aangepast. Bijvoorbeeld, wanneer het experiment beoogt de rol van een membraaneiwit in tumorprogressie verduidelijken, kan trypsine leiden digestie van het membraaneiwit en artefacten 9 veroorzaken. Indien dit een probleem, met gebufferde EDTA of schrapen van de cellen is een alternatief voor de cellen los. Zoals hierboven vermeld, kunnen cellen worden geresuspendeerd in medium, PBS of matrigel for injectie. Onder deze, matrigel is een handige optie als matrigel polymeriseert in het vet pad, dus het minimaliseren van cellen lekt uit de fatpad. Bovendien kan engraftment in aanwezigheid van Matrigel tumorgroei en metastatische vermogen van sommige cellijnen verbeteren zoals de borstkanker cellijn MDA-MB-435 2, menselijk submandibulaire carcinoom A253, menselijk epidermoïde carcinoom Kb en muis melanoma B16F10 cellen 7. Let op: sommige matrigel voorbereidingen groeifactoren die mogelijk de experimentele resultaten te beïnvloeden bevatten. De groei-factor verarmd Matrigel is verkrijgbaar bij verschillende leveranciers. Daarnaast Matrigel werkt als een extracellulaire matrix (ECM) en activeert integrine subsets. Dus als de vraagstelling betreft de rol van integrine functie tumorgroei, moet men media of PBS als drager voor borstkankercellen.
In onze experimentele opstelling, we geïnjecteerd menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231) inhet uiervet pad van NSG muizen. Het gebruik van immunodeficiënte muizen natuurlijk maakt het moeilijker om de betrokkenheid van immunoregulatoire genen in de ontwikkeling van kanker te bestuderen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze techniek ook gebruikt kan worden in muizen met intacte immuunsysteem als de cellen die moet worden geïnjecteerd hebben muizenafkomst 23. Bovendien, MDA-MB-231 cellijn oestrogeenreceptor negatief (ER-) Derhalve ontbreekt het effect van hormonen in de ontwikkeling van borstkanker. Toch onze eerdere studies hebben aangetoond dat deze techniek ook mogelijk voor ER + borstkankercellen zoals MCF-7 13. Papers methode te gebruiken om tumorgroei van veelgebruikte borstkankercellijnen studie worden hieronder vermeld:
De procedure zelf bevat enkele kritische stappen ook. In tegenstelling tot subcutane injecties, orthotoop injecties betrekken chirurgische procedures op muizen. Daarom moet chirurgische instrumenten goed gereinigd en geautoclaveerd. Van de nota, implantatie van menselijke cellen inuiervet pads vereist het gebruik van immunodeficiënte muizen (bijvoorbeeld NOD / SCID). Daarom injecties bij voorkeur uitgevoerd in een bioveiligheidskast uitgevoerd met behulp van steriele instrumenten. Bovendien, tijdens de injectie, moet de naald op de juiste hoek met de naald opening naar boven gehouden. Houd de naald in deze positie vermindert lekkage en op deze manier succesvol injectie kan worden geverifieerd door het observeren van zwelling van de borstklier vet pad. Bovendien, bij het uitvoeren van een operatie, is het cruciaal om een incisie op afstand van de uiervet pad om interferentie van het wondgenezingsproces met tumorgroei voorkomen. Echter, de incisie moet niet te ver van de uiervet pad gemaakt ofwel, als het blootstellen van de uiervet pad moeilijk zou kunnen zijn.
Volgens de werkwijze worden de dieren regelmatig gecontroleerd. Door de operatie en blootstelling aan narcose kan muizen aanzienlijk ongemak of zelfs ervarensterven. Dus de eerste week na de procedure is kritisch en muizen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Afhankelijk van de groei van de geïmplanteerde cellen kunnen tumorvolume worden gemeten tot 4 keer per week. De geïnjecteerde cellen kunnen ook worden gelabeld met een fluorescerend eiwit of luciferase, waardoor het volgen van primaire en metastatische tumorcellen, met een lichtgevoelige camera. Tumoren mogen nooit worden toegestaan om extreem grote maten te bereiken als zweren kunnen voorkomen dat de schade het tumorweefsel. Dit kan ertoe immunohistochemische analyses van het tumorweefsel belemmeren. Wanneer de tumor wordt geoogst, kan men overwegen hakken de tumor en het kweken van de verspreide tumorcellen in nieuw borstkankercellijn verschillen tussen ouderlijke onderzoeken en mammay vetkussentje gepasseerd (MFP) cellijnen 11 creëren.
Concluderend, de orthotope borstkanker implantatie dat we in dit document is aangegeven is een zeer nuttig hulpmiddel om de kanker- gerelateerde processen te bestuderen. Eén can manipuleren van het genoom van de geïnjecteerde cellen door ofwel opwaarts reguleren of neerwaarts reguleren van het gen van interesse en laat het effect op de primaire tumorgroei, angiogenese en metastase. Deze benadering is nuttig proto-oncogenen, tumor supressors of genen die betrokken zijn bij EMT bestuderen. Bovendien kunnen de cellijnen worden geïnjecteerd in genetisch gemodificeerde muizen om het effect van stromale compartiment progressie van kanker onderzocht. Wij het gebruik van de orthotopische injectietechniek dan bovengenoemde borstkanker modellen moedigen sterk vanwege de hoge recapitulatie van pathofysiologische proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
