Summary
Cancer är en komplex sjukdom som påverkas av den vävnad som omger tumören, liksom lokala pro- och anti-inflammatoriska mediatorer. Därför kan ortotropiska injektion modeller, snarare än subkutana modeller bör undersökas cancer progression på ett sätt som bättre efterliknar människo patologi.
Abstract
Bröstcancer tillväxt kan studeras i möss med användning av en uppsjö av modeller. Genetisk manipulering av bröstcancerceller kan ge insikter i de funktioner av proteiner involverade i onkogen progression eller hjälp att upptäcka nya tumörsuppressorer. Dessutom kan injicera cancerceller i möss med olika genotyper ge en bättre förståelse för vikten av stromal utrymmet. Många modeller kan vara användbara för att undersöka vissa aspekter av sjukdomsprogression men inte rekapitulera hela cancerprocessen. Däremot bröstcancerceller ympning till juverfett pad av möss bättre rekapitulerar platsen för sjukdomen och närvaro av rätt stromal utrymmet och därmed bättre efterliknar människans cancersjukdom. I den här artikeln beskriver vi hur man implantera bröstcancerceller i möss ortotopiskt och förklara hur man samlar vävnader att analysera: 14px; line-height:. 28px; "> tumörmiljö och metastasering till avlägsna organ Med hjälp av denna modell, många aspekter (tillväxt, angiogenes och metastasering) av cancer kan undersökas genom att helt enkelt ge en lämplig miljö för tumörceller att växa.
Introduction
Cancer är en mycket komplex sjukdom som har varit föremål för studier för över århundraden. Bröstcancer är den vanligaste typen av cancer; Det förekommer främst hos kvinnor, men kan sporadiskt också förekomma hos män 27. Sjukdomen orsakas främst av förlust av styrmekanismen styrande celldelning vilket i sin tur leder till en oändlig tillväxt av celler i kroppen. Dessa felfunktioner kan orsakas av flera mekanismer: för det första, friska celler behöver tillväxtsignaler från de omgivande cellerna för att proliferera medan cancerceller göra sina egna tillväxtfaktorer och öka expressionen av tillväxtfaktorreceptorer sålunda erhålla en högre proliferativ hastighet 1; andra, cancerceller är mindre känsliga för anti-proliferativa signaler 8; tredje, för att balansera cellantalet i döden kroppscell krävs också; Men cancerceller fly från programmerad celldöd, benämnd apoptos 14; fjärde, celler vidhäfta till extracellulära matriserför att överleva, men tumörceller kan växa utan behov av fäst och visa motstånd mot anoikis 19; femte, aktivering av telomeras kringgår telomerförkortning och förhindrar replika senescens 21; sist men inte minst, hoppa av DNA kvalitetskontroll efter mitos ger förändrad genetisk innehåll 15,16. För att identifiera onkogener eller tumörsuppressorer som spelar en roll i denna avreglerade spridning, tumörtillväxt experiment på möss är avgörande.
Primär tumörtillväxt är i allmänhet inte den främsta orsaken till dödsfall. Migration av cancerceller från den primära platsen till en sekundär plats, kallas metastaser, är den ledande dödsorsaken i de flesta cancerpatienter 22. Metastas innebär tumörcellinvasion, intravasering, reser genom cirkulationen, undvika immunattack, extravasering och tillväxt på den sekundära platsen. Epitelial till mesenkymala övergång (EMT) är en viktig processmetastaser och innebär en switch i genuttrycksprofilerna ger celler med högre motilitet och invasivitet, vilka är förutsättningarna för metastaserande cellen 12. Som cancerprocessen är resultanten av en kombination av olika åtgärder, bland annat ömsesidiga interaktioner mellan cancerceller, stromaceller och pro- och antiinflammatoriska celler, en in vitro metod för cancer ofta inte ger full insyn i cancerprocessen. Likaså behandlingar mot cancer som påverkar tumörkärl ofta inte kan studeras in vitro, sålunda användning av in vivo närmar är oundviklig.
För att studera bröstcancer progression, har olika experimentella metoder utvecklats. Den mest använda modellen är den subkutana injektionen av bröstcancerceller i möss 5. I denna experimentuppställning, kan utredaren införa ett brett spektrum av förändringar av en cellinje av val in vitro (dvs.uppreglering, nedreglering av proteiner) och injicera cellerna under huden. Även om denna metod är enkel och insprutningsprocessen är enkelt utan något behov av att utföra kirurgi på mössen, betyder det ställe vid vilket tumören injiceras inte representera den lokala brösttumörmiljö och frånvaron av denna miljö kan resultera i bröstcancerutveckling som skiljer sig från den som observerats hos människa patologi. För det andra är genetiskt manipulerade möss som ofta används som en in vivo-verktyg för att studera bröstcancer progression. I denna modell är onkogen (dvs pymt, Neu) uttryck som drivs av en bröstvävnadsspecifik promotor som leder till bildandet av spontan brösttumör s. Denna experimentuppställning är användbar för att studera behandlings aspekten av sjukdomen genom att injicera droger eller antikroppar vid kontroll tumörstorlek i tid 3. Men uppfödning av dessa möss med andra musstammar bristfälliga eller muterade i en gen av intresse kan också ge insights in i rollen av olika proteiner i brösttumörtillväxt 24. Nackdelen med denna modell är att den är benägen att variation i tumörstorlek och antal. Dessutom, graden av transgen expression beror på integrationsstället i genomet och kan förändras från en mus-stam till en annan 4. I denna modell, kan expressionen av transgenen uppnås genom alla celler med epitelialt ursprung medan det i human sjukdom, endast en subpopulation av celler uttrycker onkogenen eller nedreglera de tumörundertryckande nivåerna 26. För att studera metastaser, kan bröstcancerceller också injiceras intravenöst (en modell benämnd experimentell metastas) 25. Men detta synsätt rekapitulerar bara den metastatiska processen delvis; det kringgår kravet för tumörceller att invadera och intravasate, och startar från den punkt vid vilken tumörcellerna är lätt närvarande i cirkulationen.
I vårt arbete använder vi en orthotopic injiceraion modell för att studera medverkan av gener av intresse för bröstcancer progression 13. Vi överuttrycker proteinet i humana bröstcancerceller och spruta in dem i bröstfettkudden i NOD / SCID gamma (NSG) möss. Denna metod är fördelaktig på många sätt: det tillåter mycket snabba och diverse genetiska förändringar i den injicerade cellinje, täcker hela processen av bröstcancer progression från primärtumörtillväxt till metastaser vid patologiskt relevanta platser, och det ger också en bra experimentell modell för att studera effekterna av terapeutiska behandlingar i tidiga eller sena stadier av sjukdomen. Dessutom kan använda denna modell en undersöka vilken roll stromal kontra cancer-cellerna proteiner i sjukdomsprogression med hjälp av genetiskt modifierade möss eller celler. Fastän subkutana injektioner är lättare att utföra, orthotopic modeller ger upphov till en mer tumorogen och mer metastatisk cancer cellpopulationen. Sålunda erhållna resultat med hjälp av subkutan injektions kan vara antingen falskt negativa eller falskt positiva 6,17 uppmuntra användningen av orthotopic modeller för att studera tumörtillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök har godkänts av djurskyddskommitté Leiden University Medical Center (LUMC).
1. Beredning av celler, Instrument och möss
- En dag före operationen, rakar NOD / SCID gamma (NSG) möss från fjärde bröstvårtan med mittlinjen och väger mössen att kontrollera att alla möss har ungefär jämförbara vikter.
- Autoklavera en sax, två pincetter och två raka mygga pincett (Figur 1A).
- På dagen för operationen, tvätta den mänskliga bröstadenokarcinom (MDA-MB-231) celler som ska injiceras en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 och trypsinize cellerna. Släck trypsinet genom att tillsätta 10 ml seruminnehållande DMEM-medium ovanpå cellerna. Centrifugera cellerna vid 1200 rpm i 7 min vid RT för att avlägsna serum genom resuspending cellerna antingen i PBS eller i media utan serum. Centrifugera dem igen för att avlägsna spår av serum helt. Resuspendera cellerna i PBS ellermedier.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och beräkna mängden celler. Använd 500.000 celler / mus i högst 150 l. Valfri till PBS eller media, resuspendera cellerna i matrigel.
OBS: Bestäm mängden celler beroende på celltypen som används. - Placera celler i en steril mikrocentrifugrör och hålla dem på is.
- Fyll en 50 ml koniskt centrifugrör med 35 ml PBS pH 7,4 och en annan 50 ml koniskt centrifugrör med 70% etanol. Blötbomullspinnar i varje rör.
2. Orthotopic Injektion
- Utför kirurgi i en steril huva för att upprätthålla en steril atmosfär. Bedöva musen genom subkutant injicera Xylazin / Ketamin mix med en dos på 10 mg / kg, 100 mg / kg kroppsvikt respektive. Fäst musen på en värmedyna. Bekräfta framgången av anestesi genom avsaknaden av reaktion på tå nypa.
OBS: Om man inte är särskilt bekant med kirurgiska ingrepp, kan operation ta längre tid. Arrangerade anestesi dosen därefter. - Applicera oftalmologiska salva på ögonen på möss, för att förhindra att ögonen blir uttorkade.
- Rengör rakade området med hjälp av bomullstuss doppad i etanol som framställts i steg 1.6. Omväxlande skurar använder Betadine och alkohol tre gånger i en cirkulär mode roterar bort från den planerade snittet webbplatsen ska utföras. Alternativt kan du använda jonofor som desinfektionsmedel.
- Gör ett litet snitt mellan den fjärde nippel och mittlinjen med en sax och göra en ficka genom insättning av bomullspinne fuktad med PBS pH 7,4.
- Använd en pincett för att exponera bröstfettkudden. Observera fettkudden med sin vita färg.
- Kläm fettkudden med den andra pincett från sin bas; genom att göra detta, helt utsätta fettkudden (Figur 1B) att utföra injektioner lätt.
- Homogenicellblandningen genom att pipettera upp och ned. Aspirera försiktigt 50 pl cellsuspension i en insulinspruta och injicera ijuverfett pad genom att hålla nålen vågrätt. Bekräfta lyckad injektion genom att kontrollera svullnad av fettkudden.
- Släpp fettkudden försiktigt.
- Sutur snittet med hjälp av en nål drivrutin. Gör tre kast genom att vrida sutur runt nålen föraren i medurs, moturs och medurs. Två knutar per sutur bör användas.
OBS: Se till att knutarna är täta annars möss kan öppna upp suturerna. - Efter operation, injicera ett smärtstillande, såsom Temgesic på 0,05-0,1 mg / kg kroppsvikt, subkutant för att lindra smärtan.
- Lämna inte djuren utan tillsyn tills de får medvetande och bibehålla sternala bakåtlutad kroppsställning. Placera alla djur i olika burar tills de är helt återhämtat sig.
- För att bibehålla sterilitet, använd autoklave burar och vatten. Ändra burarna var tredje dag för att hålla stämningen rent.
3. organstölder för analys
- Vidskördedagen, 8 veckor efter implantation av cellerna, fylla 15 ml koniska centrifugrör med 3 ml Bouins lösning för varje mus. Dessutom använder två 15 ml rör fyllda med 5 ml formalinlösning per mus.
- Bedöva djuren genom att injicera Xylazin / Ketamin, i en dos av 10 mg / kg 100 mg / kg kroppsvikt subkutant. Vänta tills djuret förlorar tå nypa tillbakadragande reflex.
- Fäst djuret med nålar på en bas. Gör en lång, vertikal mittlinje snitt med en sax. Gör två horisontella snitt strax under främre benet och ovanför det bakre benet. Exponera tumören genom att klämma fast huden till basen. Mät tumörvolymen med hjälp av en passare.
- Dissociera tumören från huden med hjälp av en sax. Snap frysa en del av tumören i flytande kväve för RNA-isolering. Placera den andra delen, i den koniska centrifugrör fylld med formalin för att utföra immunohistokemi efter paraffininbäddning.
- Försiktigt ta ut lungorna. Placeravänstra lungan in Bouins lösning. Förvara lungan i lösning under 3 dagar. Observera ytliga metastashärdar klart blotta ögat. Eventuellt placera höger lunga i formalin för att kontrollera mikrometastas använder hematoxylin och eosin (H & E) färgning.
OBS: Även lungmetastas ofta noterade i bröstcancer, kanske man också vill samla ben, lever, hjärna och mjälte att analysera metastaser. Cellerna på metastaser området är tätare och morfologiskt olika och kan därför skiljas lätt från lungvävnad. - En dag efter skörd, aspirera formalinlösning från 15 ml rör och ersätta med 70% etanol. Bädda vävnaderna i paraffin och utföra immunohistokemi studier.
- För blodanalys, öppna upp bröstkorgen med en sax. Uttag 450 xl blod via hjärtpunktering. Placera blodprov i ett mikrocentrifugrör innehållande 50 pl 3,2% natriumcitrat. Efter blod samlas, snurra det vid 2000 xg under 10 kmn. Förvara plasmaproverna vid -20 ° C tills vidare användning.
OBS: Det finns flera andra tekniker insamlings blod som vanligen används i praktiken 20 och tekniken som måste användas beror på experimentuppställning och vetenskapsman val. Om blodprov inte krävs, avliva djuret i enlighet med djur protokoll eller enligt riktlinjerna institution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik tillämpning av "orthotopic bröstcancer modell" är baserad på riktig injektion av celler i bröstfettkudden. Experimentella fel såsom inexakt inokulering av celler eller läckage kan leda till variationer i tumörstorlek till och med avsaknaden av en tumör, som leder till bildningen av en struktur ser liknar en bröstfettkudden som injicerats med en kontrollbuffert (Figur 2A). Tillväxthastigheten av tumören är beroende på naturen hos den injicerade cellinjen och i allmänhet kan iakttas genom huden på möss (Figur 2B). Till skillnad från in vitro-experiment, kan tillväxthastigheten hos tumörcellerna inte att vara konstant i tiden in vivo (figur 2C). På grund av hypoxi och brist på näringsämnen, kan nekrotiska områden bildas och dessa områden kommer att påverka tillväxten av tumören (figur 2D). Dessutom kan den intressanta genen påverkar en viss fasav cancer progression (tidig eller sen), vilket beror på experimentuppställning, tumörtillväxt kan börja snabbt men sakta ner i slutet eller tvärtom.
Försiktighet bör iakttas under förfarandet av tumören bort; rigorös hantering kan påverka strukturen av tumören och leder till problem i immunhistokemisk analys. Området kring tumören kan uppvisa stora fartyg som uppstår från vaskulär remodellering. Dessa fartyg spelar en avgörande roll för avlägsnande av avfallsprodukter och förse tumörvävnad med näringsämnen och syre och därigenom underlätta tumörtillväxt (Figur 2B). Bildning av neovessels (angiogenes) kan undersökas genom färgning tumören för neovessel markörer (dvs CD31, CD34).
Insamling av lungorna i Bouins lösning hjälper till att visualisera ytliga metastashärdar på lungorna (Figur 3A). Den härdar kan skiljas från lungvävnad med hjälp av den bleka färgen end är lätt att upptäcka 18. Metastas kan uttryckas som antalet foci bildade på lungytan. Dock är bildningen av foci cellinje beroende; icke-aggressiva celler ger upphov till endast mikrometastas eller ingen metastas alls. Micro metastas kan lätt identifieras med en haematoxylin / eosin färgning på paraffininbäddade lungvävnad (Figur 3C).
Figur 1:. Material och metoder (A) Kirurgiska utrustning som krävs för injektion av bröstcancerceller in i bröstfettkudden (B) representativ bild som visar exponeringen av bröstfettkudde..
Figur 2:. Översikt över orthotopic brösttumörtillväxt i möss (A) Medie kontroll eller
Figur 3: tumörmetastas till lungorna (A) Lungor av möss som ortotopiskt injicerats med tumörceller (MDA-MB-231).. Inkubation av lungorna i Bouins lösning exponerar metastashärdar på lungorna. (B) Lungor från kontrollmösssom genomgick orthotopic injektion av kontrollmedia. Såsom kan ses tydligt, behöver dessa styr lungor inte visar makroskopiska metastaser. (C) H & E-färgning visar den metastatiska regionen i lungvävnad. Insatsen visar en låg förstoring översikt över lungvävnad innehåller metastaser fokus. Den svarta streckade rektangeln i insatsen är representerat i den stora panelen. Tumörceller indikeras med den vita streckade linjen; notera de större och tätare kärnor. (Svart skala bar = 100 nm, vit skala bar = 20 pm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotopic injektion av bröstcancerceller är en kraftfull modell för att studera alla aspekter av cancertillväxt. Implantation av dessa celler i bröstfettkudden hos möss bör utföras noggrant för att förhindra variation i tumörtillväxt. Viktigast är avgörande att injicera samma mängd celler till varje mus. För att göra detta bör man trypsinize cellerna rigoröst utan att påverka livskraften hos cellerna. Icke-viabla celler bör bortses under cellräkning och reagenser (dvs trypanblått) som kan hjälpa till att skilja mellan döda och levande celler kan vara användbara för att bestämma antalet viabla celler. Bildning av klumpar av celler bör undvikas genom att pipettera cellerna upp och ner som bildandet av cellklumpar orsaka problem under cellräkning och leder till felaktig beräkning av antalet celler. En annan viktig aspekt som bör beaktas är volymen av cellerna själva. Som beskrivs i protokollet avsnittet, cells pelleteras för att stänga av dem i PBS eller media. Innan du lägger PBS eller media, kan volymen av cellerna uppskattas genom att jämföra pelleten med rör fyllda med olika volymer av media. Därefter cellvolymen kan subtraheras från den avsedda medievolymen, i enlighet med följande formel:
Volym media som måste läggas = Beräknat volym - Cell volym
Reagens som används i protokollet kan påverka resultatet av experimentet; Därför protokollet bör justeras i enlighet beroende på frågeställningen. Till exempel, om experimentet syftar till att belysa den roll som ett membranprotein i tumörprogression, kan trypsinering resultera i nedbrytning av membranprotein och orsaka artefakter 9. Om detta är ett bekymmer, med hjälp buffrade EDTA-lösning eller skrapa cellerna är ett alternativ att lösgöra cellerna. Som nämnts ovan, kan celler återsuspenderas i media, PBS eller matrigel for injektion. Bland dessa är matrigel ett bekvämt alternativ som matrigel polymeriserar i fettkudden, vilket minimerar celler läcker ut ur fatpad. Dessutom kan engraftment i närvaro av matrigel öka tumörtillväxt och metastatiska potentialen hos vissa cellinjer, såsom bröstcancer cellinjen MDA-MB-435 2, humant submandibulär karcinom A253, humant epidermoidkarcinom Kb och mus melanom B16F10-celler 7. Observera att vissa Matrigel preparat innehåller tillväxtfaktorer som potentiellt påverkar de experimentella resultaten. Dock är tillgängliga från olika leverantörer tillväxtfaktor-utarmat matrigel. Dessutom fungerar matrigel som en extracellulär matrix (ECM) och aktiverar grin delmängder. Således, om frågeställningen handlar roll grinfunktion i tumörtillväxt, bör man använda media eller PBS som bärare för bröstcancerceller.
I vår experimentuppställning, injicerade vi humana bröstcancerceller (MDA-MB-231) in ijuverfett dyna av NSG möss. Användningen av immundefekta möss gör naturligtvis det svårare att studera delaktighet immungener i cancerutveckling. Det är dock viktigt att notera att denna teknik kan även användas i möss med intakt immunsystem om cellerna som måste injiceras har musen ursprung 23. Dessutom är MDA-MB-231 cellinje östrogenreceptor negativ (ER-) Därför är effekten av hormoner i bröstcancerutveckling saknas. Ändå visade vårt tidigare arbete att denna teknik är också möjligt för ER + bröstcancerceller såsom MCF-7 13. Papers utnyttjar denna metod för att studera tumörtillväxt av vanliga cellinjer bröstcancer listas nedan:
Förfarandet i sig innehåller några kritiska steg också. Till skillnad från subkutana injektioner, orthotopic injektioner involverar kirurgiska ingrepp på möss. Därför bör kirurgiska verktyg rengöras väl och autoklaveras. Notera implantation av mänskliga celler imammary fettkuddar kräver användning av immundefekta möss (t.ex. NOD / SCID). Därför injektioner bör helst utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp, med hjälp av sterila instrument. Dessutom under injektionen, nålen bör hållas i rätt vinkel med nålen öppningen uppåt. Håll nålen i detta läge minskar läckage och på detta sätt lyckad injektion kan verifieras genom att observera svullnad av bröstfettkudden. Dessutom, när de utför kirurgi, är det viktigt att göra ett snitt en bit bort från bröstfettkudden, för att undvika störningar av sårläkningsprocessen med tumörtillväxt. Emellertid bör snittet inte göras alltför avlägset från bröstfettkudden heller, eftersom exponering av bröstfettkudden kan vara svårt.
Enligt förfarandet, bör djuren kontrolleras regelbundet. På grund av operationen och exponering för narkos kan möss uppleva betydande obehag eller ensdö. Således är den första veckan efter ingreppet kritisk och möss bör övervakas noga. Beroende på tillväxten av de implanterade cellerna, kan tumörvolymen mätas upp till 4 gånger i veckan. De injicerade cellerna kan också märkas med ett fluorescerande protein eller luciferas, möjliggör spårning av primära och metastatiska tumörceller, med användning av en ljuskänslig kamera. Tumörer får aldrig tillåtas nå extremt stora storlekar som sår kan uppstå att skador tumörvävnaden. Detta kan försvåra korrekt immunhistokemiska analyser av tumörvävnaden. När tumören skördas, skulle man kunna tänka mals tumören och odla de spridda tumörceller för att skapa en ny bröstcancer cellinje för att undersöka skillnader mellan föräldrarnas och mammay fett pad passerade (mfp) cellinjer 11.
Sammanfattningsvis är det orthotopic bröstcancer implantation som vi skisseras i denna uppsats ett mycket användbart verktyg för att studera cancerrelaterade processer. En can manipulera genomet hos de injicerade cellerna antingen upregulating eller nedreglera genen av intresse och kontrollera dess effekt på primär tumörtillväxt, angiogenes eller metastaser. Detta tillvägagångssätt är användbart för att studera proto-onkogener, tumör supressors eller gener som är involverade i EMT. Dessutom kan de cellinjer injiceras genetiskt modifierade möss för att undersöka effekten av stromal fack i cancerutveckling. Vi rekommenderar att användningen av orthotopic injektionsteknik över ovannämnda bröstcancer modeller på grund av dess höga rekapitulation av patofysiologisk process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
