ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Summary

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。

Abstract

ニューロンは、感覚、運動、移動、学習、およびメモリを含むさまざまな機能のために重要な情報を運ぶ多面細胞である。 生体内で神経細胞を研究することは、それらの複雑さ、彼らの多様かつ動的な環境、そして技術的な限界に挑戦することができます。これらの理由により、in vitroでニューロンを研究することは神経細胞の複雑な謎を解明することが有益で証明することができます。細胞培養モデルの明確に定義された性質は、環境条件および変数を詳細に制御を提供する。ここでは、隔離解離、およびニワトリ胚由来の培養一次ニューロンする方法について説明します。この技術は、迅速で安価であり、ロバスト感覚ニューロンを成長生成する。手順は、一貫して非常に神経細胞について濃縮された培養物を生成し、非常に少数の非神経細胞（5％未満）を有している。一次ニューロンは、したがって詳細な手順二つディスタンを作成するために、未処理のガラスまたは組織培養プラスチックによく接着しないCT、ニューロンのメッキ用の、明確に定義されたラミニン含有基質が記載されている。培養したニューロンは、共免疫沈降、生細胞想像、RNAiを、および免疫細胞化学を含む複数の細胞および分子技術、に非常に適している。これらの培養神経細胞をダブル免疫細胞化学のための手順は、最適化されており、ここに記載されている。

Introduction

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化^2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化¹に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション^3,4、軸索再生^5、そのような神経障害⁶などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチである。

細胞培養モデルは、環境条件や変数を詳細に制御した研究者を提供しています。例えば、ニューロンがメッキ（および上に成長）された基質は、容易に操作することができる。ここでは、二つの異なる基質、低ラミニン-1濃度が1およびラミニン-1の飽和濃度で他を生成するための詳細な手順を提供する。驚くべきことに、同じ分子の異なる濃度は、劇的な効果を持つことができ内部のニューロンの状態だけでなく、それらの細胞表面組成に。例えば、インテグリンのcAMPおよび表面レベルの細胞内レベルは、これらの2つの基層^7,8上にめっきニューロンが有意に異なっている。追加の研究は、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む他の分子は、細胞表面分子の発現および神経運動性^7-11に影響^を与えることが示されている。また、このようなニューロトロフィンおよびニューロトロピン等の水溶性分子はまた、細胞膜の組成および神経運動性^12-16に影響^を及ぼし、容易かつ正確に細胞培養モデルで操作することができる。

ここでは、単離するための方法が記載されているし、培養ニワトリ胚から感覚ニューロンを解離さ。この手順は、軸索伸長^{5,7,8,10,11,16-21}含む神経生物学における重要なブレークスルーを製造するために使用されており、神経節細胞^22を分離するように設計された手順を改変した。ありこの手法にはいくつかの利点。まず、ひよこ後根神経節（DRG）の開発の多くの機能はよく出産、軸索伸長のための時間枠を含む特徴とし、タンパク質発現は、このように試験管内実験で有益構築するための有益な基礎を提供し^{、2,23-28プロファイル} 。第二に、神経細胞培養は研究者がより直接的に（神経細胞および非神経細胞を含む）は、無傷のDRG外植片および/または解離神経細胞および非神経細胞の両方を含む混合培養を用いて別のアプローチと比較して、神経細胞を研究することを可能に解離。第三に、ここで説明する手順は、簡単で安価で学部生に適している。したがって、この技術は、研究ならびに教育目的のために使用することができる。さらに、このプロトコルのマイナーバリエーションはDRGを以外のソースからのニューロンの速い、高収率の精製を可能にする必要があります。例えば、この手順はneuronally ENRを提供するために修正することができるそのような胚前脳や脊髄などの他の組織からの文化をiched。

免疫細胞化学プロトコールは、これらの解離ニューロン培養のために最適化されており、ここでは詳細に記載されている。神経細胞接着分子（NCAM）及びβ1インテグリンに対する二重免疫細胞化学のための手順が提供される。これらの免疫細胞化学的方法から生成されたデータは、培養ニューロン^8,16のいくつかの分子の空間パターニングおよび強度を調べるために使用されてきた。

Protocol

1。カバースリップの準備：アシッドウォッシュと焼く解剖（ステップ2）の前に少なくとも2日間、カバーガラスを準備するには、次の手順を開始します。オイル、徹底的にきれいなカバースリップを除去するための酸洗浄ステップを実行します。 縦にカバースリップを配置して互いに接触するのを防ぐ磁器ホルダーに用紙をカバースリップ。 2 M塩酸（HCl）を充填したガラス組…

Representative Results

ここで説明するプロトコルは、文化に非常に少ない（ 例えば 、<5％）非神経細胞7,8,10,16と解離胚性感覚ニューロンの濃縮集団を研究者を可能にします。多数のDRGを腰仙部、胸部および頸部から得ることができる。治験責任医師の必要に応じて、これらの異なる解剖学的領域からのDRGを容易に単離することができる。たとえば、 図1は、図1Cおよび1Dお…

Discussion

ここでは、単離するための詳細なプロトコールを提示し、培養ニワトリ胚からの感覚ニューロンを解離さ。この手順では、in vitro ^7,8,10,16 におけるロバスト成長ニューロンの濃縮集団を生成します。多数の細胞および分子技術がここに記述されている免疫細胞を含む、これらの培養ニューロンに適用することができる。このプロトコルは、最近、定量的感覚成長円錐^8,…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036