Cellekulturmodeller give detaljerede kontrol over miljøforhold og dermed give en stærk platform til at belyse mange aspekter af neuronal cellebiologi. Vi beskriver en hurtig, billig og pålidelig metode til at isolere, dissociere og kultur sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Nærmere oplysninger om substrata forberedelse og immuncytokemi er også til rådighed.
Neuroner er mangesidede celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, motorisk bevægelse, læring og hukommelse. At studere neuroner in vivo kan være en udfordring på grund af deres kompleksitet, deres varierede og dynamiske miljøer, og tekniske begrænsninger. Af disse grunde kan studere neuroner in vitro vise sig gavnlig at optrævle de komplekse mysterier neuroner. Den veldefineret karakter cellekulturmodeller giver detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. Her beskriver vi, hvordan du isolerer, dissociere og kultur primære neuroner fra kyllingefostre. Denne teknik er hurtig, billig, og genererer robust voksende sensoriske neuroner. Proceduren konsekvent fremstiller kulturer, der er stærkt beriget med neuroner og har meget få ikke-neuronale celler (mindre end 5%). Primære neuroner ikke klæber godt til ubehandlet glas eller vævskulturplast derfor detaljerede procedurer for at skabe to Distinct, er veldefinerede laminin-holdige substrater til neuronal plettering beskrevet. Kulturperler neuroner er meget modtagelig til flere cellulære og molekylære teknikker, herunder co-immunopræcipitation, levende celler forestille, RNAi, og immuncytokemi. Procedurer for dobbelt immunocytokemi på disse dyrkede neuroner er blevet optimeret og beskrevet her.
Neuroner er komplekse celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, vision, motor bevægelse, læring og hukommelse. Unik fra andre celletyper neuroner strækker arm-lignende processer, kaldet axoner til dannelse af væsentlige neurale veje for kommunikation. Under udvikling specialiserede rum placeret på spidsen af voksende axoner, kaldet vækstkegler, navigere gennem en koncert af ekstracellulære stikord til at lede Axon til dens korrekte destination. De indviklede molekylære mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle navigation er ikke fuldt forstået. For bedre at forstå disse mekanismer, har forskere brugt cellekulturmodeller at studere neuroner i en defineret og forenklet in vitro-miljø. Studere neuroner i kultur 1 har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af neuronal cellebiologi herunder: neuronal differentiering 2, cytoskeletale dynamik, endocytose og menneskehandel, dendritcellerregulering 3,4, axonal regenerering 5, og kliniske tilstande, såsom neuropatier 6. Desuden dyrkede neuroner er meget modtagelig for en bred vifte af forskning teknikker herunder immuncytokemi celleoverflade co-immunfældning, western blot, transfektion, RNAi og levende billeddannelse såsom Timelapse analyse af vækst kegle motilitet. Således dyrkning primære neuroner er en kraftfuld metode til at belyse mange aspekter af cellebiologi af neuroner.
Cellekulturen modellen giver efterforskerne med detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. For eksempel kan substrater, som neuroner udplades (og vokse på) nemt manipuleres. Her giver vi detaljerede instruktioner til at generere to særskilte substrater, den ene med en lav laminin-1-koncentration og den anden med mættende koncentrationer af laminin-1. Overraskende kan forskellige koncentrationer af det samme molekyle have dramatiske virkningerden indre tilstand af neuroner samt deres celleoverflade sammensætning. For eksempel intracellulære niveauer af cAMP og overflade niveauer af integriner er væsentligt forskellige i neuroner belagt på disse to substrater 7,8. Yderligere undersøgelser har vist, at andre molekyler, herunder fibronectin og chondroitinsulfat-proteoglycaner, virkninger på ekspression af celleoverflademolekyler og neuronal motilitet 7-11. Desuden opløselige molekyler, såsom neurotrophiner og neurotropins også påvirke sammensætningen cellemembranen og neuronal motilitet 12-16 og kan være let og præcist manipuleres i en cellekultur-model.
Her beskriver vi metoder til at isolere og kultur dissocieret sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Denne procedure er blevet anvendt til at foretage betydelige gennembrud i neurobiologi, herunder axon udvækst 5,7,8,10,11,16-21 og blev ændret fra en procedure, designet til at isolere gangliecellerne 22. Der erflere fordele ved denne fremgangsmåde. Først mange funktioner i chick Dorsalrodsganglieceller (DRG) udvikling godt karakteriseret, herunder tidsrammen for fødslen, Axon udvidelse, og protein udtryk profiler 2,23-28, hvilket giver en lærerig grundlag for at bygge oplysende in vitro forsøg. For det andet adskilles neuronkulturer tillader investigator mere direkte studere neuroner i forhold til alternative fremgangsmåder ved hjælp af intakte DRG-eksplantater (som indeholder neuroner og ikke-neuronale celler) og / eller blandede kulturer indeholdende både dissocierede neuroner og ikke-neuronale celler. For det tredje, den her beskrevne procedure er ligetil, billig og modtagelig for bachelorstuderende. Derfor kan denne teknik anvendes til forskning samt til undervisningsformål. Desuden bør mindre ændringer af denne protokol giver hurtig, højt udbytte oprensning af neuroner fra andre end DRG kilder. For eksempel kan denne procedure modificeres til at give neuronalt Enriched kulturer fra andre væv, såsom embryonale forhjernen eller rygmarven.
Immuncytokemi protokoller er blevet optimeret for disse dissocierede neuronale kulturer, og er beskrevet i detaljer her. Proceduren for dobbelt immuncytokemi mod neural celleadhæsionsmolekyle (NCAM) og β1-integriner er tilvejebragt. Data genereret fra disse immunocytokemiske metoder er blevet anvendt til at undersøge den rumlige mønster og intensitet af flere molekyler i dyrkede neuroner 8,16.
Her præsenterer vi detaljerede protokoller til isolering og dyrkning dissocieret sensoriske neuroner fra en kyllingeembryo. Denne procedure genererer en beriget population af håndfast voksende neuroner in vitro 7,8,10,16. Talrige cellulære og molekylære teknikker kan anvendes på disse dyrkede neuroner, herunder immuncytokemi, der er beskrevet her. Denne protokol blev for nylig anvendt til kvantitativt at vurdere intensiteten af immunolabeled aktiverede integriner i sensoriske vækstkegler 8…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Alison Philbrook, Belinda Barbagallo og Michael Francis for indsigtsfulde kommentarer til dette dokument. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af en R15 OMRÅDE award 1R15NS070172-01A1 tildelt MLL.
sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
Immunocytochemistry Reagents Table | |||
Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
microscope slides | VWR | 16004-430 | |
Primary Antibody Table | |||
Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
Seconday Antibody Table | |||
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |