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Neuroscience

लड़की भ्रूण से अलगाव और Dissociated संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृति

Published: September 24, 2014 doi: 10.3791/51991
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Assumption College

Summary

सेल संस्कृति मॉडल पर्यावरण की स्थिति अधिक विस्तृत नियंत्रण प्रदान करते हैं और इस प्रकार न्यूरोनल कोशिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए एक सशक्त मंच प्रदान करते हैं. हम लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स, अलग अलग कर देना, और संस्कृति के लिए एक, तेजी से सस्ती और विश्वसनीय विधि का वर्णन. Substrata तैयारी और immunocytochemistry का विवरण भी उपलब्ध कराए गए हैं.

Abstract

न्यूरॉन्स सनसनी, मोटर आंदोलन, शिक्षा, और स्मृति सहित कार्यों की एक किस्म के लिए आवश्यक जानकारी ले कि बहुमुखी कोशिकाओं रहे हैं. Vivo में न्यूरॉन्स के अध्ययन के कारण उनकी जटिलता, उनके विविध और गतिशील वातावरण, और तकनीकी सीमाओं के चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इन कारणों से, इन विट्रो में न्यूरॉन्स का अध्ययन न्यूरॉन्स के जटिल रहस्यों को जानने के लिए फायदेमंद साबित हो सकता है. सेल संस्कृति मॉडल की अच्छी तरह से परिभाषित प्रकृति पर्यावरण की स्थिति और चर पर विस्तृत नियंत्रण प्रदान करता है. यहाँ हम अलग अलग कर देना, और लड़की भ्रूण से संस्कृति प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए क्या करते हैं. इस तकनीक को तेजी से सस्ती है, और robustly संवेदी न्यूरॉन्स बढ़ रही उत्पन्न करता है. प्रक्रिया लगातार अत्यधिक न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध है कि संस्कृतियों पैदा करता है और बहुत कुछ गैर neuronal कोशिकाओं (कम से कम 5%) है. प्राथमिक न्यूरॉन्स इसलिए विस्तृत प्रक्रियाओं दो distin बनाने के लिए, इलाज कांच या टिशू कल्चर प्लास्टिक के लिए अच्छी तरह से पालन नहीं करतेसीटी, न्यूरोनल चढ़ाना के लिए अच्छी तरह से परिभाषित laminin युक्त substrata वर्णित हैं. सभ्य न्यूरॉन्स सह immunoprecipitation, लाइव सेल कल्पना, आरएनएआई, और immunocytochemistry सहित कई सेलुलर और आणविक तकनीक, के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं. इन सभ्य न्यूरॉन्स पर डबल immunocytochemistry के लिए प्रक्रिया अनुकूलित और यहां वर्णित किया गया है.

Introduction

न्यूरॉन्स सनसनी, दृष्टि, मोटर आंदोलन, शिक्षा, और स्मृति सहित कार्यों की एक किस्म के लिए आवश्यक जानकारी ले कि जटिल कोशिकाओं रहे हैं. अन्य प्रकार की कोशिकाओं से अद्वितीय, न्यूरॉन्स संचार के लिए आवश्यक तंत्रिका राजमार्गों के लिए फार्म, हाथ की तरह प्रक्रियाओं, कहा जाता है axons का विस्तार. बढ़ रही axons की युक्तियों पर स्थित विकास विशेष डिब्बों के दौरान, इसकी उचित गंतव्य के लिए अक्षतंतु नेतृत्व करने के लिए बाह्य संकेत के एक संगीत कार्यक्रम के माध्यम से नेविगेट, विकास शंकु कहा जाता है. विकास शंकु नेविगेशन आबाद कि जटिल आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. बेहतर इन तंत्र को समझने के लिए, जांचकर्ताओं एक परिभाषित और सरलीकृत विट्रो वातावरण में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है. Neuronal भेदभाव 2, cytoskeletal गतिशीलता, endocytosis और तस्करी, डेन्ड्राइट: संस्कृति 1 में अध्ययन न्यूरॉन्स सहित neuronal सेल जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए प्रेरित कियाविनियमन 3,4, axonal उत्थान 5, और इस तरह के न्यूरोपैथी 6 के रूप में नैदानिक ​​स्थितियों. इसके अलावा, सभ्य न्यूरॉन्स immunocytochemistry, कोशिका की सतह सह immunoprecipitation, पश्चिमी धब्बा, अभिकर्मक, आरएनएआई, और इस तरह के विकास शंकु गतिशीलता के timelapse विश्लेषण के रूप में रहते इमेजिंग सहित अनुसंधान तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं. इस प्रकार, प्राथमिक न्यूरॉन्स संवर्धन न्यूरॉन्स की कोशिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.

सेल संस्कृति मॉडल पर्यावरण की स्थिति और चर पर विस्तृत नियंत्रण के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स चढ़ाया (और पर बढ़ने) कर रहे हैं जिस पर substrata आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है. यहाँ, हम दो अलग substrata, एक कम laminin -1 एकाग्रता के साथ एक और laminin-1 की सांद्रता saturating के साथ अन्य पैदा करने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं. हैरानी की बात है, एक ही अणु के विभिन्न सांद्रता नाटकीय प्रभाव हो सकता हैआंतरिक न्यूरॉन्स के राज्य के साथ ही उनके सेल सतह की संरचना पर. उदाहरण के लिए, integrins की छावनी और सतह के स्तर के intracellular स्तर इन दो substrata 7,8 पर चढ़ाया न्यूरॉन्स में काफी अलग हैं. अतिरिक्त अध्ययन फ़ाइब्रोनेक्टिन और chondroitin सल्फेट proteoglycans, प्रभाव कोशिका की सतह अणुओं की अभिव्यक्ति और neuronal गतिशीलता 7-11 सहित कि अन्य अणुओं, पता चला है. इसके अलावा, इस तरह के भी कोशिका झिल्ली संरचना और neuronal गतिशीलता 12-16 प्रभाव और आसानी से और सही एक सेल संस्कृति मॉडल में हेरफेर किया जा सकता Neurotrophins और neurotropins के रूप में घुलनशील अणु.

यहाँ, हम तरीकों को अलग करने और संस्कृति लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स अलग वर्णन. यह प्रक्रिया अक्षतंतु परिणाम 5,7,8,10,11,16-21 सहित तंत्रिका जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण सफलताओं बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 22 अलग करने के लिए बनाया गया एक प्रक्रिया से संशोधित किया गया था. वहांइस दृष्टिकोण के लिए कई फायदे. सबसे पहले, लड़की पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के विकास की कई सुविधाएँ अच्छी तरह से जन्म, अक्षतंतु विस्तार के लिए समय सीमा सहित विशेषता है, और प्रोटीन अभिव्यक्ति इस प्रकार इन विट्रो प्रयोगों में जानकारीपूर्ण निर्माण करने के लिए जिस पर एक शिक्षाप्रद आधार प्रदान करने, 2,23-28 प्रोफाइल. दूसरा, neuronal संस्कृतियों अन्वेषक अधिक सीधे अलग न्यूरॉन्स और गैर neuronal कोशिकाओं दोनों युक्त (न्यूरॉन्स और गैर neuronal कोशिकाओं होते हैं) बरकरार DRG explants और / या मिश्रित संस्कृतियों का उपयोग वैकल्पिक तरीकों की तुलना में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देने के अलग. तीसरा, यहां वर्णित प्रक्रिया, सरल, सस्ता और स्नातक से नीचे के लिए उत्तरदायी है. इसलिए, इस तकनीक अनुसंधान के लिए और साथ ही शिक्षण उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की मामूली बदलाव DRGs के अलावा अन्य स्रोतों से न्यूरॉन्स की तेजी, उच्च उपज शुद्धि की अनुमति चाहिए. उदाहरण के लिए, इस प्रक्रिया Enr neuronally प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैऐसे भ्रूण अग्रमस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के रूप में अन्य ऊतकों से iched संस्कृतियों.

Immunocytochemistry प्रोटोकॉल इन अलग neuronal संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है और यहां विस्तार से वर्णन किया गया हैं. तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) और β1 integrins के खिलाफ डबल immunocytochemistry के लिए प्रक्रिया प्रदान की जाती है. इन immunocytochemical तरीकों से उत्पन्न डेटा सभ्य न्यूरॉन्स 8,16 में स्थानिक patterning और कई अणुओं की तीव्रता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

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Protocol

1 Coverslip तैयारी: एसिड धोने और सेंकना

  1. कम से कम 2 दिन पहले विच्छेदन (चरण 2) को, coverslips तैयार करने के लिए निम्नलिखित कदम शुरू. तेल और अच्छी तरह से साफ coverslips दूर करने के लिए एसिड धोने कदम प्रदर्शन.
  2. खड़ी coverslips पदों और एक दूसरे को छूने से उन्हें रोकता है कि चीनी मिट्टी के बरतन धारक में लोड coverslips. 2 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ भरा गिलास ऊतक विज्ञान कंटेनर में धारक और coverslips डूब. चीनी मिट्टी के बरतन धारक उपलब्ध नहीं है, तो वैकल्पिक रूप से, 100 मिमी ग्लास पेट्री डिश के नीचे कवर और 2 एम एचसीएल में coverslips डूब 20 coverslips क्षैतिज ~ फैल गया.
  3. धूआं हुड में घुमाव मेज पर (एसिड में डूबे हुए coverslips) के साथ कांच के बर्तन रखें और कमरे के तापमान पर कम से कम 5 घंटे के लिए कमाल की कोमल अनुमति देते हैं. वैकल्पिक रूप से, एसिड धोने रात भर एक ही परिस्थितियों में coverslips.
  4. चीनी मिट्टी के बरतन धारक लोड स्थानांतरित द्वारा आसुत एच 2 ओ (DH 2 हे) के साथ coverslips धो लेंDH 2 ओ से भरा एक साफ ग्लास ऊतक विज्ञान कंटेनर के लिए 2 एम एचसीएल से coverslips साथ वैकल्पिक रूप से, coverslips साथ कांच पेट्री डिश से 2 एम एचसीएल छानना और DH 2 ओ के साथ फिर से भरना
  5. फिर DH 2 हे decanting और ताजा DH 2 ओ के साथ कांच के बर्तन refilling से धोएं 3 त्वरित washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
  6. घुमाव पर (coverslips साथ और DH 2 हे) कांच के बर्तन लौटने से अब धोने आहार शुरू. कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के लिए अनुमति दें. फिर, DH 2 हे छानना और ताजा DH 2 ओ जोड़ना कम से कम दस washes के एक कुल के लिए दोहराएँ. वैकल्पिक रूप से, रात भर धोने जारी है.
  7. 350 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं भट्ठी में धोया coverslips रखें. चीनी मिट्टी के बरतन धारक का उपयोग करते हैं, तो dh से 2 ओ से भरे ग्लास कंटेनर धारक को हटाने और फिर सीधे भट्ठी में coverslips साथ धारक जगह है. एक गिलास पेट्री डिश का उपयोग करते हैं, तो DH 2 हे छानना और furnac में coverslips साथ गिलास पकवान जगहई.
  8. कम से कम पांच घंटे या रात भर में 350 डिग्री सेल्सियस के लिए coverslips बनाओ.
  9. पाक के पूर्ण होने पर, ठीक संदंश के साथ चीनी मिट्टी के बरतन धारक से coverslips निकालें और बाँझ 100 मिमी ग्लास पेट्री डिश में जगह है. मूल रूप से गिलास पेट्री डिश में चीनी मिट्टी के बरतन धारक में नहीं रखा गया कि coverslips छोड़ दें.

2 चिकी विच्छेदन और DRGs का अलगाव

  1. उपजाऊ निकालें, (कोमल कमाल के साथ 37-38.5 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित) इनक्यूबेटर से व्हाइट लिवोमो चूजा अंडे का मंचन किया.
    नोट: पिछले अध्ययनों DRGs 2,8,11-13,16 के अलगाव के लिए भ्रूण दिन 7-10 का इस्तेमाल किया है.
  2. लामिना का प्रवाह हुड में चयनित अंडा रखें. बाँझ समाधान और उपकरणों के साथ लामिना का प्रवाह हुड में सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में नीचे सूचीबद्ध सभी प्रक्रियाओं का संचालन. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्म सभी समाधान.
  3. एक प्लास्टिक 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे और जगह सामग्री क्रैक. एक और 100 मिमी पेट्री डिश भ्रूण स्थानांतरण के लिए मानक संदंश का प्रयोग करें.
  4. गर्म F12HS10 जोड़ें (हाम F12, 10 मिमी HEPES, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम 0.1 मिलीग्राम) गीला ऊतक रखने के लिए पाश्चर विंदुक के साथ पकवान. इसके पृष्ठीय पक्ष (चित्रा 1 ए) पर भ्रूण की स्थिति संदंश का प्रयोग करें.
  5. लामिना का प्रवाह हुड में एक दूरबीन stereovision विदारक माइक्रोस्कोप पर भ्रूण ऊतक युक्त 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश रखें. दिल, फेफड़ों और अन्य अंगों को बेनकाब करने के लिए विकास के डर्मिस pinching द्वारा गर्दन को पूंछ से एक खड़ी midline चीरा बनाने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. वैकल्पिक रूप से, आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए छोटे आँसू की एक श्रृंखला बनाते हैं.
  6. धीरे बाँझ ठीक संदंश के 2 सेट का उपयोग करें: एक) गर्दन समझ और ख) पूंछ की ओर दिल को तुरंत बेहतर महाधमनी या अन्य ऊतक समझ और खींच,पशु eviscerating.
  7. ऊतक को पाश्चर विंदुक के साथ गर्म F12HS10 लागू करें. विकासशील पसलियों, कशेरुका स्तंभ और DRGs (आंकड़े 1 बी -1 डी) को बेनकाब करने के लिए किसी भी शेष हृदय, श्वसन या पाचन अंगों को निकालने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
  8. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, आगे पसलियों को नीचा काठ कशेरुका स्तंभ, दोनों पक्षों के साथ DRGs अंगों को हटाने और इकट्ठा करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें. भ्रूण से बरकरार DRGs तोड़ द्वारा DRGs लीजिए. चुटकी और रीढ़ की हड्डी की ओर DRG से पहुंचने और परिधि या विपरीत दिशा में DRG से पहुंचता है कि विकासशील तंत्रिका लोभी कि जड़ों तोड़.
  9. गर्म F12HS10 से भरा एक 35 मिमी संस्कृति डिश में बरकरार DRGs रखें. ठीक संदंश के साथ pinching द्वारा 35 मिमी पकवान में बरकरार DRGs से, इस तरह के DRGs का पालन किया है कि हो सकता है पृष्ठीय या उदर जड़ों के रूप में, किसी भी अतिरिक्त ऊतक निकालें.
  10. काठ का क्षेत्र में बेहतर DRGs प्राप्त करने के लिए, वक्ष और cervi के उदर आधे निकालेंकाल वर्टिब्रल कॉलम. यह ऊपरी ग्रीवा क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी की धुरी और ऊपरी काठ का क्षेत्र में एक और कटौती करने के लिए खड़ा विकासशील वर्टिब्रल कॉलम में कटौती करके किया जाता है. फिर, कटौती सही और कशेरुका स्तंभ के बाईं पक्षों के साथ रीढ़ की हड्डी धुरी के समानांतर बना. उजागर रीढ़ की हड्डी (आंकड़े 1E-1F) को उजागर करता है जो भ्रूण से कशेरुका स्तंभ के उदर आधा उठा.
  11. DRGs में आसानी से प्रवेश की अनुमति देने के लिए, ठीक संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी लोभी द्वारा वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को हटा दें. वर्टिब्रल कॉलम के बाहर रीढ़ की हड्डी लिफ्ट संदंश का प्रयोग करें. एक सन्निकटन के रूप में, वक्ष रीढ़ की हड्डी पसलियों के स्तर पर है और गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र पसलियों से बेहतर है.
  12. ठीक संदंश के साथ बरकरार वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा DRGs लीजिए और अन्य DRGs के साथ गर्म F12HS10 में उन्हें जगह है. DRGs का पालन हो सकता है कि अतिरिक्त ऊतक निकालें.
  13. मदद करने के लिए F12HS10 साथ एक नई गिलास पाश्चर पिपेट का इंटीरियर कुल्लापिपेट की दीवारों से चिपके से DRGs रोकने. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब छोटे पेट्री डिश से सभी DRGs और F12HS10 हस्तांतरण और तुरंत चरण 3 पर आगे बढ़ने के लिए rinsed पिपेट का उपयोग करें.
    नोट: अतिरिक्त भ्रूण DRGs की संख्या बढ़ाने के लिए विच्छेदित किया जा सकता है. DRGs चरण 3 के लिए तैयार है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर F12HS10 में रखा जाना चाहिए.

3 हदबंदी, समृद्ध, और संवर्धन DRG न्यूरॉन्स - भाग 1

  1. बरकरार DRGs अपकेंद्रित्र में और धीरे से जगह शंक्वाकार ट्यूब में 2-3 मिनट के लिए (200 XG) स्पिन. DRGs ट्यूब के नीचे डूब है कि पुष्टि करें. यदि नहीं, तो फिर से स्पिन.
  2. एक विंदुक का प्रयोग, धीरे अबाधित DRG गोली छोड़ने, F12HS10 हटा दें. DRGs की गोली dislodging, 1x कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त (सीएमएफ) पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें. फिर स्पिन और बरकरार DRG गोली जाते वक्त सीएमएफ पीबीएस को हटा दें. अगले कदम में trypsin पाचन के साथ हस्तक्षेप करेगा जो F12HS10 में भ्रूण गोजातीय सीरम, दूर करने के लिए तीन washes के एक कुल के लिए इस धोने कदम दोहराएँ.
  3. 2 मिलीलीटर सीएमएफ पीबीएस और DRGs युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब को गरम trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 10-15 मिनट अलग कोशिकाओं में DRGs को पचाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह ट्यूब.
  4. ऊष्मायन के दौरान, F12H + पूरक युक्त मीडिया बनाने (हाम F12, 10 मिमी HEPES 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 एनजी / एमएल NT3, 10 एनजी / एमएल NGF, 200 मिमी एल glutamine और एन 2) और गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में. आमतौर पर, कुल मीडिया के 10 एमएल प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की 4-5 35 मिमी व्यंजन के लिए पर्याप्त है. इसके अलावा विगलन laminin -1 कोटिंग coverslips (चरण 4) के लिए शुरू करते हैं.
  5. नेत्रहीन धीरे महीन चुर्ण बनाना P1000 पिपेट साथ trypsin समाधान में DRGs और बरकरार DRGs के अभाव के लिए निरीक्षण किया. बरकरार DRGs नहीं रह आंखों से देखा जाता है जब तक विचूर्णन जारी रखें और / या बरकरार DRGs अलग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अब trypsin ऊष्मायन के लिए अनुमति देते हैं. , क्षति से DRG न्यूरॉन्स की रक्षा विचूर्णन दौरान हवाई बुलबुले से बचने और <30 मिनट के लिए trypsin पाचन को सीमित करने के लिए.
  6. Centrifugअलग DRGs युक्त और गोली फार्म के लिए 3-5 मिनट के लिए 200 XG पर trypsin ई ट्यूब. गोली का गठन होने तक अगर जरूरत लंबे समय तक स्पिन.
  7. ध्यान से गोली में बाधा पहुँचा के बिना trypsin aspirate. गोली F12HS10 के 2 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे एक P1000 विंदुक टिप के साथ DRGs triturate.
  8. 100 मिमी संस्कृति डिश में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से सभी सामग्री स्थानांतरण. 10 मिलीलीटर की कुल के लिए एक समय में, 2 मिलीलीटर 8 मिलीलीटर F12HS10 साथ ट्यूब कुल्ला और संस्कृति डिश को हस्तांतरण. यह rinsing कदम ट्यूब की दीवारों का पालन बने रहे हो सकता है कि कोशिकाओं को इकट्ठा मदद करता है.
  9. 100 मिमी संस्कृति पकवान प्लेस (10 मिलीलीटर F12HS10 साथ और DRG कोशिकाओं अलग) 3 घंटे के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में.
    नोट: HEPES सीओ 2 के अभाव में मीडिया पीएच buffers क्योंकि सीओ 2 इनक्यूबेटर में की आवश्यकता नहीं है. ऊष्मायन के दौरान, glial कोशिकाओं शिथिल glial बिस्तर का पालन करने के लिए करते हैं टिशू कल्चर प्लास्टिक और न्यूरॉन्स की सतह के लिए बाध्य.

4 कोटिंग एसिड धोयाLaminin-1 के साथ और बेक्ड Coverslips

  1. बर्फ पर जमे हुए laminin -1 की बाँझ aliquots पिघलना.
  2. बाँझ शर्तों के तहत, laminin -1 के 50 μl विभाज्य बाँझ 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. 280 एनएम पर laminin-1 के एक absorbance के मूल्य प्राप्त करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें. Laminin-1 की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए निम्न समीकरण में इस मान का उपयोग करें.

एबीएस 280 = (एकाग्रता मिलीग्राम / एमएल) * (प्रोटीन के विलुप्त होने के गुणांक)
laminin-1 के लिए विलुप्त होने गुणांक 0.86 है.

  1. बाँझ शर्तों के तहत, 1 मिलीग्राम / एमएल और 20 मिलीग्राम / एमएल सांद्रता प्राप्त करने के लिए 1X पीबीएस के साथ laminin-1 पतला. Laminin -1 ऊष्मायन 7,8,10 के बाद coverslip (30 एनजी / 2 सेमी और 300 एनजी / क्रमशः 2 सेमी) करने के लिए बाध्य की एक दस गुना अंतर को प्राप्त करने के लिए laminin-1 के इन दो लागू सांद्रता का प्रयोग करें.
  2. एक लामिना का प्रवाह हुड में, एक एसिड धोया और बेक्ड सी जगह ठीक संदंश का उपयोगएक 35 मिमी संस्कृति डिश के तल में overslip. जरूरत व्यंजनों की संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएँ.
  3. आगे नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए 20-30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश में coverslips अधीन. इस चरण के दौरान पकवान ढक्कन बंद रखें.
  4. प्रत्येक गिलास coverslip के लिए तैयार laminin -1 के 400 μl जोड़ें. Coverslip के पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए laminin-1 का प्रसार करने के पिपेट टिप का उपयोग करें. भूतल तनाव laminin-1 coverslip पर रहते हैं और आवश्यकता है जो संस्कृति डिश के तल पर फैल नहीं करने की अनुमति देगा.
  5. पकवान पर ढक्कन प्लेस और laminin-1 कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए सेते करने की अनुमति (3 घंटा इष्टतम है).
  6. Laminin-1 ऊष्मायन के बाद, लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ पीबीएस के साथ सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर coverslips कुल्ला. Coverslip पर समाधान निकालें और पीबीएस के 400 μl जोड़ें. 5-10 मिनट रुको. 3 rinses की कुल के लिए दोहराएँ.
  7. पिछले कुल्ला के बाद coverslip पर पीबीएस छोड़ दें. Rinsing के दौरान सतह तनाव मत तोड़ो और coverslips बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है. लतैयार है जब तक पर एवेन्यू ढक्कन coverlip पर न्यूरॉन्स अलग थाली करने के लिए.

5 हदबंदी, समृद्ध, और संवर्धन DRG न्यूरॉन्स - भाग 2

  1. ऊष्मायन के बाद, धीरे अलग DRG कोशिकाओं से युक्त 100 मिमी पकवान के नीचे कुल्ला करने के लिए एक 10 मिलीलीटर बाँझ पिपेट का उपयोग करें. फिर धीरे से लगभग 1/3 पकवान की पर 7 मिलीलीटर निष्कासित, ~ पिपेट सहायता से F12HS10 के 7 मिलीलीटर खींच, 45 डिग्री कोण ~ पर पकवान पकड़ो. धीरे न्यूरॉन्स dislodging, 5x दोहराएँ.
  2. पकवान घुमाएँ और पकवान की एक और 1/3 पर, एक और छह rinses के लिए, प्रक्रिया rinsing दोहराएँ. पकवान की 1/3 शेष के लिए फिर से दोहराने की प्रक्रिया. इस तरह, धीरे न्यूरॉन्स को दूर करने के F12HS10 साथ पकवान की पूरी तह कुल्ला.
  3. वही विंदुक का प्रयोग, 15 शंक्वाकार ट्यूब 100 मिमी पकवान से F12HS10 युक्त न्यूरॉन्स हस्तांतरण. गोली कोशिकाओं के 200 ग्राम में 5-10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  4. अबाधित गोली छोड़ने, F12HS10 निकालें. गरम F12H + खुराक की 2 मिलीलीटर के साथ resuspend गोली.
  5. वांछित चढ़ाना एकाग्रता (20 माइक्रोग्राम / एमएल laminin -1 8,16 साथ लेपित coverslips के लिए 1 ग्राम / मिलीलीटर laminin-1 और 40,000 कोशिकाओं / एमएल के साथ लेपित coverslips के लिए 120,000 कोशिकाओं / एमएल) प्राप्त करने के लिए F12H + खुराक के साथ आवश्यक के रूप में कोशिकाओं पतला.
  6. Laminin लेपित coverslips से पीबीएस निकालें और तुरंत coverslips पर कोशिकाओं के 400 μl जगह है. ध्यान से एक humidified, 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर पकवान हस्तांतरण. न्यूरॉन्स laminin -1 का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए और ऊपर सेते दें.
  7. बाँझ शर्तों के तहत, धीरे F12H + खुराक की 1.6 मिलीलीटर के साथ न्यूरॉन्स युक्त 35 मिमी व्यंजन बाढ़.
    नोट: इस समय, coverslip पर तनाव तोड़ा जा सकता है सतह. न्यूरॉन्स पर्याप्त रूप से coverslip पर laminin -1 का पालन किया है.
  8. इनक्यूबेटर और रातोंरात सेते कोशिकाओं लौटें. अगले दिन immunocytochemistry के रूप में इस तरह के प्रयोगों को पूरा करें.

6 मैंmmunocytochemistry

  1. Immunocytochemistry से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म लगानेवाला समाधान (4% paraformaldehyde, 30% sucrose 2X पीबीएस).
    नोट: कोशिकाओं फिक्सिंग से पहले, ऐसे netrin -1, करोड़ 2 +, ध्वनि हाथी, semaphorin, और ephrin 16,29-31 के रूप में विभिन्न अभिकर्मकों के साथ व्यवहार करते हैं.
  2. धीरे धीरे संस्कृति पकवान से F12H + खुराक की 2 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर हटा दें. धीरे गरम लगानेवाला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते दें.
  3. ध्यान लगानेवाला समाधान निकालने और 2 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें. पीबीएस के आवेदन की वजह से तय कोशिकाओं के संभावित dislodging से परहेज, पकवान के किनारे की ओर समाधान को लागू करें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. 5 washes के एक कुल के लिए पीबीएस धोने दोहराएँ. कोशिकाओं immunocytochemistry के किसी भी कदम के दौरान शुष्क करने की अनुमति न दें.
  5. पीबीएस निकालें. अवरुद्ध समाधान के 1 मिलीलीटर लागू करें (0.1% ट्राइटन एक्स, 1X पीबीएस, 5% सामान्य बकरी सीरम). कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. वैकल्पिक रूप से, सतह अणुओं दाग, समाधान 8 अवरुद्ध में ट्राइटन-X उपयोग नहीं करते.
  6. निर्माण की सिफारिश के अनुसार अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला. NCAM के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए 500 और β1 integrins 16 सक्रिय: 1 का प्रयोग करें. , अवरुद्ध समाधान निकालें प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1X पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं. 4 पीबीएस washes के एक कुल के लिए दोहराएँ. अगर जरूरत Washes, बढ़ाया जा सकता है.
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी 1 पतला: 1,000 अवरुद्ध समाधान में. , पीबीएस निकालें 1 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं. इस बिंदु से आगे जितना संभव अंधेरे में समाधान और कोशिकाओं रखें.
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पहले से किया जैसे, 1x पीबीएस के साथ 5x कुल्ला.
  10. Fluoromount की ~ 60-80 μl लागू करेंएक खुर्दबीन स्लाइड पर जी. ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे खुर्दबीन स्लाइड पर Fluoromount जी में पकवान और कम coverslip के बाहर coverslip उठा. हवाई बुलबुले से बचें.
  11. स्टोर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर क्षैतिज स्लाइड. 12-24 घंटे के बाद, Fluormount जी भाजन जाएगा और coverslip मजबूती खुर्दबीन स्लाइड से जुड़ी होगी. इस polymerization के कदम के बाद छवि कोशिकाओं पूरा हो गया है.

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल संस्कृति को बहुत कुछ (जैसे, <5%) गैर neuronal कोशिकाओं 7,8,10,16 साथ अलग भ्रूण संवेदी न्यूरॉन्स की एक समृद्ध आबादी जांचकर्ताओं सक्षम बनाता है. कई DRGs lumbosacral, वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा के क्षेत्रों से प्राप्त किया जा सकता है. अन्वेषक की जरूरतों पर निर्भर करता है, ये अलग संरचनात्मक क्षेत्रों से DRGs आसानी से अलग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, चित्रा 1 आंकड़े -1 सी और 1 डी और आंकड़े 1E और 1F में वक्ष DRGs में प्रकाश डाला काठ DRGs साथ विच्छेदन के विभिन्न चरणों के माध्यम से लड़की भ्रूण की छवियों से पता चलता है.

संवर्धित कोशिकाओं को आसानी immunocytochemistry द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. इधर, संवर्धित कोशिकाओं β1 Integrin और NCAM (चित्रा 2) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained रहे हैं. हैरानी की बात है, हम इन के बाद अप करने के लिए एक वर्ष के लिए फ्लोरोसेंट धुंधला कल्पना करने में सक्षम हैआईसीसी प्रक्रियाओं, स्लाइड्स 4 डिग्री सेल्सियस पर और अंधेरे में क्षैतिज रखा गया है. हालांकि, आईसीसी दाग ​​की दीर्घायु उपयोगकर्ता द्वारा और एंटीबॉडी के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए.

न्यूरॉन्स के घनत्व पर निर्भर करता है, विस्तार neurites के सुझावों पर विकास शंकु भी (आंकड़े 2 डी 2 एफ) देखे जा सकते हैं. न्यूरॉन्स 20 माइक्रोग्राम / एमएल और laminin -1 क्रमशः 1 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ लेपित coverslips पर 40,000 और 120,000 कोशिकाओं / एमएल पर चढ़ाया, 26 घंटा पोस्ट चढ़ाना अप करने के लिए कई स्वतंत्र neurites है. इन संस्कृतियों विशेष रूप से पूरे न्यूरॉन का विश्लेषण करने के अलावा विकास शंकु का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इससे पहले, इस प्रक्रिया विकास शंकु वेग और इस तरह विकास शंकु पतन 8,9,11,13,16 के रूप में व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Substrata का पालन नहीं कर रहे हैं कि मृत न्यूरॉन्स में इन coverslips परिणामों पर लोअर चढ़ाना घनत्व. प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक सटीक उचित घनत्व अन्वेषक प्रति अनुकूलित किया जाना चाहिए.

भ्रूण लड़की विच्छेदन की संख्या 1 चरणों DRGs प्राप्त करने के लिए. ए) लड़की भ्रूण अपनी पृष्ठीय पक्ष पर झूठ बोल रही है. दिल (एच), पंख (डब्ल्यू) और पैर (एल) चिह्नित कर रहे हैं. छवि के ऊपर सिर, या बेहतर (एस) की ओर है. छवि के नीचे पूंछ, या अवर (आई) की ओर है. आर जानवर के = दाएं, एल जानवर के = बाईं ओर. बाद के सभी छवियों आंतरिक अंगों वर्टिब्रल कॉलम ए में भ्रूण से हटा दिया गया है) एक ही अभिविन्यास. बी में हैं, पसलियों और DRGs देखा जाता है. सादगी के लिए, एक पसली लेबल है, तीन प्रतिनिधि DRGs काले हलकों से पहचाने जाते हैं और वक्ष और काठ का कशेरुका स्तंभ लेबल है. सी) समान लड़की भ्रूण छवि बी के रूप में क्षेत्र की पहचान एक ग्रे बॉक्स के साथ hig पर दिखाया गयाडी डी में उसके बढ़ाई) काठ कशेरुका स्तंभ (कुलपति) क्षेत्र के हायर बढ़ाई. इस दृश्य में ग्यारह DRGs के तीन धराशायी हलकों से पहचाने जाते हैं. DRGs दौर और समझाया हैं. इन सुविधाओं संदंश. ई) आंतरिक अंगों और वक्ष कशेरुका स्तंभ के उदर आधे से हटाए जाने के बाद एक लड़की भ्रूण के साथ बरकरार DRGs प्राप्त करने के लिए यह आसान बनाते हैं. ग्रे बॉक्स वर्टिब्रल कॉलम हटा दिया गया है, जहां क्षेत्र में देखा जाता है एफ एफ में उच्च आवर्धन) स्पाइनल कॉर्ड (अनुसूचित जाति) में दिखाया क्षेत्र को इंगित करता है. छवि के नीचे की ओर, काठ कशेरुका स्तंभ (कुलपति) अभी भी बरकरार है. 3 से 10 के DRGs धराशायी हलकों से पहचाने जाते हैं. DRGs पसलियों के प्रत्येक सेट के बीच में पाए जाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 संवर्धित प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स नेकां के लिए immunolabeledAM और β1 integrins. चिकी DRG न्यूरॉन्स laminin-1 की उच्च सांद्रता पर सुसंस्कृत NCAM (ए) और β1 Integrin (बी). सी) दो दाग का विलय छवि के लिए immunopositive हैं सबसे कोशिकाओं NCAM और β1 Integrin दोनों के लिए सकारात्मक रहे हैं पता चलता है. ये एवियन संवेदी न्यूरॉन्स इन मार्करों दोनों के लिए immunopositive हैं. सफेद में हालांकि, NCAM नकारात्मक और β1 Integrin सकारात्मक एक गैर neuronal सेल. लोमो) एक सुसंस्कृत संवेदी न्यूरॉन के हायर बढ़ाई साथ संगत है कि एक तारांकित द्वारा चिह्नित एक सेल, सेल शरीर से विस्तार neurites. डी वहाँ से पता चलता है) इनसेट बॉक्स एक neurite की नोक पर विकास शंकु के उच्च बढ़ाई पता चलता है.

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Discussion

यहाँ हम अलग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान और संवर्धन एक लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स अलग. यह प्रक्रिया इन विट्रो 7,8,10,16 में मजबूती बढ़ रही न्यूरॉन्स की एक समृद्ध आबादी उत्पन्न करता है. कई सेलुलर और आणविक तकनीक यहाँ वर्णित है जो immunocytochemistry, सहित इन सभ्य न्यूरॉन्स, के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल हाल ही में मात्रात्मक संवेदी विकास शंकु 8,16 में immunolabeled सक्रिय integrins की तीव्रता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन पिछले अध्ययनों में, एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम सही ढंग से विकास शंकु के बाहर 20 माइक्रोन अंत की एक रूपरेखा बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. रूपरेखा NCAM धुंधला के आधार पर बनाया गया था. न्यूरॉन्स में NCAM की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति संपूर्ण विकास शंकु के बजाय विकास शंकु के एक सीमित हिस्से की पहचान करने के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम सक्षम होना चाहिए. यह विकास शंकु रूपरेखा तो ब्याज की एक क्षेत्र है और उस regi के भीतर Integrin धुंधला तीव्रता के रूप में पहचान की थीब्याज की पर सॉफ्टवेयर द्वारा मूल्यांकन किया गया था. इस तरीके में, ब्याज की एक प्रोटीन की तीव्रता आसानी से सुसंस्कृत संवेदी न्यूरॉन्स के भीतर एक विशिष्ट क्षेत्र में मापा जा सकता है.

विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित सिफारिशें प्रदान की जाती हैं. सबसे पहले, coverslips अच्छी तरह से कदम 1.4-1.6 में एचसीएल ऊष्मायन के बाद पानी से धो रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं. अन्यथा, ऐसे laminin-1 के रूप में अणुओं coverslip पर अच्छी तरह से फैलाने नहीं होगा. दूसरा, अन्यथा कोशिकाओं के clumps बनेगी और इस न्यूरोनल शुद्धता में कमी होगी, DRGs पर्याप्त रूप से trypsin पाचन के बाद (3.5 कदम) अलग कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि. तीसरा, यह न्यूरॉन्स की एक purer आबादी प्राप्त करने के लिए एक पूर्ण 3 घंटे के लिए कदम 3.9 में DRG कोशिकाओं सेते इष्टतम है. इस ऊष्मायन कदम छोटा है, तो एक छोटा ऊष्मायन समय के बाद उखाड़ फेंकना कर रहे हैं कि गैर neuronal कोशिकाओं की संख्या को सीमित करने के लिए कदम 5.1 और 5.2 rinsing कमी. Laminin -1 और disso आवेदन करते समय चौथा, कि सतह तनाव बनाए रखा है यह सुनिश्चितcoverslips को ciated न्यूरॉन्स. सतह तनाव खो दिया है, समाधान coverslip और सूखा से परे का विस्तार होगा. यह न्यूरॉन्स मार देगा. पांचवां, इष्टतम सेल घनत्व प्रत्येक अन्वेषक द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. पिछले अध्ययनों / मिलीलीटर laminin-1 और 20 माइक्रोग्राम / एमएल laminin -1 क्रमशः 8,16, 1 ग्राम के साथ लेपित 120,00 न्यूरॉन्स / एमएल और coverslips पर 40,000 न्यूरॉन्स / एमएल चढ़ाया है. यह एकाग्रता जांचकर्ताओं मुक्त अक्षतंतु अंत (अभी तक एक न्यूरॉन के साथ जुड़ा हुआ नहीं था कि अंत) का अध्ययन करने के लिए अनुमति देने के लिए काफी कम था. छठी, immunocytochemistry दौरान, धीरे कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए कुछ खास होगा. निकाला जा रहा है या coverslip से न्यूरॉन्स बेदखल कर सकते हैं भी जल्दी समाधान को लागू करने.

इस प्रक्रिया की सीमाओं लड़की DRG विच्छेदन की कुछ हद तक सीमित समय खिड़की शामिल हैं. DRGs आसानी से भ्रूण दिन (ई) 7-10 लड़की भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है. यह पहले E7 से DRGs प्राप्त करने के लिए संभव है, यह कुछ हद तक चुनौती दे रहा है. E11 के बाद, अधिक उपास्थि पारहड्डी को itions और इस विच्छेदन और अधिक कठिन बना देता है. इस प्रकार, वयस्क न्यूरॉन्स बनाम भ्रूण की तुलना करने के उद्देश्य अध्ययन है कि इस लड़की के मॉडल के लिए आदर्श नहीं होगा, हालांकि, पिछले अध्ययनों DRGs 32 में उम्र की तुलना के लिए चूहे मॉडल का इस्तेमाल किया है. यह चूहा DRG विच्छेदन कम मजबूत, अधिक महंगा है और लड़की से तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. विचार करने के लिए एक और मुद्दा संस्कृति में समय के साथ बदलने के लिए सुसंस्कृत भ्रूण DRG न्यूरॉन्स की क्षमता है. उदाहरण के लिए, इन संवेदी न्यूरॉन्स का चयन Neurotrophins 2,30 की उपस्थिति के आधार पर 48 घंटे के भीतर रिसेप्टर्स के विभिन्न स्तरों व्यक्त करते हैं.

DRG न्यूरॉन्स की दो उपवर्गों मीडिया 2,12,30 में चयनात्मक Neurotrophins के उपयोग से समृद्ध किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और neurotrophin -3 (NT3) मुख्य रूप से त्वचा संबंधी और proprioceptive न्यूरॉन्स, क्रमशः 33 के अस्तित्व का समर्थन है. इस प्रयोग में इस्तेमाल मीडिया NGF और NT3 दोनों है, हालांकि, यह आसानी से त्वचा संबंधी या proprioceptive संवेदी न्यूरॉन्स के लिए या तो चयन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

अलग न्यूरॉन्स विकास शंकु गतिशीलता और कैल्शियम इमेजिंग के timelapse कल्पना सहित कई लाइव इमेजिंग तकनीक के लिए उत्तरदायी हैं. यह मीडिया के पीएच बफरिंग के लिए सीओ 2 की आवश्यकता नहीं है क्योंकि यहां इस्तेमाल मीडिया लाइव सेल इमेजिंग के लिए फायदेमंद है. इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं से डाटा अधिग्रहण एक गर्म मंच के साथ एक खुर्दबीन पर किया जा सकता है, लेकिन पर्याप्त सीओ 2 के स्तर के रखरखाव की आवश्यकता नहीं है. विकास शंकु वेग, पतन 8,16,30, और कैल्शियम का स्तर 17 यहाँ वर्णित तकनीक से अलग रहते प्राथमिक लड़की संवेदी न्यूरॉन्स में अध्ययन किया गया है. इसके अलावा, आरएनएआई सफलतापूर्वक सुसंस्कृत लड़की DRG न्यूरॉन्स 34 में प्रोटीन का स्तर कम कर सकते हैं.

इन विट्रो मॉडल में अच्छी तरह से परिभाषित करने से प्राप्त इनसाइट्स प्रयोगों डिजाइन करने के लिए एक आवश्यक नींव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैएक अधिक जटिल में vivo मॉडल में. उदाहरण के लिए, विभिन्न दृष्टिकोणों glial निशान के इन विट्रो मॉडल में अक्षतंतु परिणाम को प्रोत्साहित करने के लिए रजत प्रयोगशाला 35 में इस्तेमाल किया गया. इन विट्रो में परीक्षण अभिकर्मकों के विभिन्न प्रकार के केवल दो (सूजन प्रेरण और chondroitin सल्फेट proteoglycans की पाचन) अक्षतंतु उत्थान को बढ़ावा सकता है. दिलचस्प है, vivo में इन दो उपचार के संयोजन रीढ़ की हड्डी 35 में नाटकीय और कार्यात्मक अक्षतंतु उत्थान को प्रेरित किया. इस मामले में, इन विट्रो प्रयोगों अक्षतंतु परिणाम है कि वृद्धि अभिकर्मकों के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान की है. सफलतापूर्वक इन विट्रो में अक्षतंतु विकास को बढ़ावा दिया है कि अभिकर्मकों भी आगे सेल संस्कृति प्रयोगों के मूल्य का समर्थन करता है जो विवो में सफल साबित हुआ.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इस पत्र पर व्यावहारिक टिप्पणी के लिए एलिसन Philbrook, बेलिंडा Barbagallo और माइकल फ्रांसिस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान एमएलएल को सम्मानित एक R15 क्षेत्र पुरस्कार 1R15NS070172-01A1 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile small culture dishes (35 mm) Corning 430165
Sterile large culture dishes (100 mm) Falcon 353003
Sterile large Petri dishes (100 mm) VWR 89000-302
Glass Petri dish (100 mm) VWR D108962
Fine forceps Fine Science Tools 11251-10
Standard forceps Fine Science Tools 1100-12
Coverslips (22 x 22 mm) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
Porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media
HCl VWR VW3204-1 use at 2 M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution
Laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl
15 ml Conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10x Gibco 14200 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
PBS 10x Gibco 14080 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM
Penicillin/streptomyocin Sigma P0781 use 5 ml in 500 ml of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer
NGF RnD systems 256-GF Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
L-Glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Normal goat serum Life technologies PCN500
Microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated β1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 91 पृष्ठीय रूट gangia डीआरजी चिकन, एवियन laminin -1 भ्रूण प्राथमिक
लड़की भ्रूण से अलगाव और Dissociated संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृति
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Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

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