Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo
Summary
Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.
Abstract
Las neuronas son las células multifacéticos que llevan la información esencial para una variedad de funciones incluyendo la sensación, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. El estudio de las neuronas in vivo puede ser un reto debido a su complejidad, sus variados y dinámicos ambientes, y las limitaciones técnicas. Por estas razones, el estudio de las neuronas in vitro puede resultar beneficioso para desentrañar los complejos misterios de neuronas. La naturaleza bien definida de modelos de cultivo celular ofrece un control detallado de las condiciones ambientales y variables. Aquí se describe cómo aislar, se disocian, y las neuronas de cultivo primario de embriones de pollo. Esta técnica es rápida, de bajo costo, y genera robustamente creciente neuronas sensoriales. El procedimiento produce consistentemente culturas que son altamente enriquecido para las neuronas y tiene muy pocas células no neuronales (menos de 5%). Neuronas primarias no se adhieren bien al vidrio sin tratar o de cultivo de plástico de tejido, por lo tanto, los procedimientos detallados para crear dos Distinct, sustratos que contiene laminina-bien definido para chapado neuronal se describen. Neuronas cultivadas son altamente susceptibles de múltiples técnicas celulares y moleculares, incluyendo co-inmunoprecipitación, imaginación de células vivas, RNAi, y inmunocitoquímica. Procedimientos para la doble inmunocitoquímica en estas neuronas cultivadas se han optimizado y descrito aquí.
Introduction
Las neuronas son las células complejas que llevan la información esencial para una variedad de funciones, incluyendo la sensibilidad, la visión, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. Único de otros tipos de células, las neuronas extienden procesos como brazos, llamadas axones, para formar carreteras neuronales esenciales para la comunicación. Durante compartimentos de desarrollo especializada ubicados en las puntas de los axones en crecimiento, llamada conos de crecimiento, navegar a través de un concierto de señales extracelulares para liderar el axón hasta su destino apropiado. Los mecanismos moleculares que subyacen a la navegación intrincados cono de crecimiento no se entienden completamente. Para entender mejor estos mecanismos, los investigadores han utilizado modelos de cultivo celular para estudiar las neuronas en un entorno in vitro definido y simplificado en. Neuronas que estudian en la cultura 1 ha dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión de la biología de las células neuronales incluyendo: la diferenciación neuronal 2, la dinámica del citoesqueleto, la endocitosis y el tráfico, dendritaregulación de 3,4, la regeneración axonal 5, y las condiciones clínicas tales como neuropatías 6. Además, las neuronas cultivadas son altamente susceptibles a una amplia gama de técnicas de investigación incluyendo la inmunocitoquímica, las células superficie de co-inmunoprecipitación, inmunotransferencia de tipo Western, transfección, RNAi y de imágenes en vivo tales como el análisis de la motilidad timelapse cono de crecimiento. Por lo tanto, el cultivo de neuronas primarias es un enfoque poderoso para dilucidar numerosos aspectos de la biología celular de las neuronas.
El modelo de cultivo celular proporciona a los investigadores con un control detallado de las condiciones ambientales y variables. Por ejemplo, los sustratos sobre los que se sembraron las neuronas (y crecen a) puede ser fácilmente manipulada. Aquí, se proporcionan instrucciones detalladas para la generación de dos sustratos distintos, uno con una baja concentración de laminina-1 y el otro con saturar las concentraciones de laminina-1. Sorprendentemente, diferentes concentraciones de la misma molécula pueden tener efectos dramáticosen el estado interno de las neuronas, así como su composición de la superficie celular. Por ejemplo, los niveles intracelulares de cAMP y superficiales niveles de integrinas son significativamente diferentes en las neuronas chapada en estos dos sustratos 7,8. Estudios adicionales han demostrado que otras moléculas, incluyendo fibronectina y proteoglicanos de sulfato de condroitina, el impacto de la expresión de moléculas de superficie celular y la motilidad neuronal 7-11. Además, las moléculas solubles, tales como las neurotrofinas y neurotropins también impacto composición de la membrana celular y la motilidad neuronal 12-16 y puede ser manipulado fácilmente y con precisión en un modelo de cultivo celular.
Aquí se describen los métodos para aislar y cultura disocian neuronas sensoriales de los embriones de pollo. Este procedimiento se ha utilizado para hacer avances significativos en la neurobiología, incluyendo axón resultado 5,7,8,10,11,16-21 y fue modificada a partir de un procedimiento diseñado para aislar células ganglionares 22. Hayvarias ventajas de este enfoque. En primer lugar, muchas características de chick ganglio de la raíz dorsal (DRG) de desarrollo están bien caracterizados incluyendo el marco de tiempo para el nacimiento, la extensión del axón, y los perfiles de expresión de la proteína 2,23-28, proporcionando así una base instructiva sobre la cual construir informativa en experimentos in vitro. En segundo lugar, los cultivos neuronales disociadas permiten que el investigador para estudiar más directamente las neuronas en comparación con enfoques alternativos utilizando explantes de DRG intactas (que contienen neuronas y células no neuronales) y / o cultivos mixtos que contienen tanto las neuronas disociadas y células no neuronales. En tercer lugar, el procedimiento descrito aquí es sencillo, barato y susceptible de estudiantes universitarios. Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para la investigación, así como para fines de enseñanza. Además, variaciones menores de este protocolo deben permitir la purificación rápida, de alto rendimiento de las neuronas de fuentes distintas de los GRD. Por ejemplo, este procedimiento puede ser modificado para proporcionar neuronalmente ENRculturas iched de otros tejidos como el cerebro anterior de embriones o de la médula espinal.
La inmunocitoquímica protocolos han sido optimizados para estos cultivos neuronales disociadas y se describen en detalle aquí. Se proporciona el procedimiento para el doble inmunocitoquímica contra la molécula de adhesión celular neural (NCAM) y las integrinas β1. Los datos generados a partir de estos métodos inmunocitoquímicos se han utilizado para examinar el patrón espacial y la intensidad de varias moléculas en las neuronas cultivadas 8,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos protocolos detallados para el aislamiento y cultivo disociados neuronas sensoriales de un embrión de pollo. Este procedimiento genera una población enriquecida de neuronas robusto crecimiento in vitro 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares y moleculares se pueden aplicar a estas neuronas cultivadas, incluyendo inmunocitoquímica, que se describe aquí. Este protocolo se utilizó recientemente para evaluar cuantitativamente la intensidad de las integrinas activadas inmunomarcadas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo y Michael Francis para perspicaces comentarios sobre este documento. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por un premio R15 ÁREA 1R15NS070172-01A1 adjudicado a MLL.
Materials
| sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
| sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
| sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
| glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
| HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
| 15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
| PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
| Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Seconday Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
