Introduction
Der parre og regenerering af tissuesis et af themain mål for lægevidenskaben, fordi en læsion i et væv ororgan kan være invaliderende, og i nogle tilfælde dødelige. I sammenhæng er de sundhedspersonale og forskere konstant søger teknikker, metoder og værktøjer til at give ny terapeutisk alternativesto fremme der pair-regenereringsproces af beskadigede væv. Derfor har biomedicinske videnskaber fokuseret på undersøgelse af mesenchymale stamceller (MSC'er), især voksne stamceller, fordi denne celle afstamning udgør en ideel model til at studere vævsregeneration proces på grund af dens potentiale til at differentiere til ektodermal, mesodermal og endoderm celleafstamninger Men for at gøre behandling med MSC en realitet, skal karakteriseringen af thetherapeutic potentiale MSC'er ledsages af implementering af nye celledyrkningsteknikker hjælp af biomaterialer og cellulære stilladser, der sikrer den ønskede adfærd MSC'erne i værtens væv.
Protocol
Denne forskning blev udført i overensstemmelse med World Medical Associations Helsinki-erklæringen om etiske adfærd forskning med mennesker, og blev godkendt af Research Etik bestyrelse Facultad de Medicina, UNAM (projektnummer 101-2012).
1. Isolering af humane mesenchymale Stem Cell
- Fremstilling af reagens
- Forbered phosphatpufret saltopløsning (PBS) og supplere med 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning.
- Forbered Dulbeccos Modified Eagles Medium, høj glucose (HG-DMEM), og der tilsættes 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk solution.Sterilize dette dyrkningsmedium ved filtrering gennem et 0,2 um filter.
- Forbered en kollagenase II opløsning ved 100 U / ml i HG-DMEM uden FBS eller antibiotika-antimykotisk løsning.
- Steriliseres følgende kirurgiske instrumenter, som er nødvendige til isolering, ved autoklavering: standard sakss, simple Dissecting pincet, fine-point og fortandede pincet og en skalpel håndtag (# 4).
- Isolering af mesenkymale stamceller af human fosterhinde
- Hold navlestrengen med den ene hånd og med den anden hånd, løsnes fosterhinde (AM), der ligner en gennemskinnelig plade, til opnåelse af et fragment på ca. 5 cm2. Hvis chorion sektion er til stede i prøven, adskille underliggende chorion ved manuel dissektion som chorion sektion er tykkere end amnion.
- Fjerne resterende blod med tre vaske af 5 ml PBS og fjerne blodpropper med den simple pincet. Lav et lille snit i AM med skalpel for at generere fragmenter af ca. 0,5 cm2.
- Enzymatisk fordøjelse af fosterhinde
- Inkubér AM med 5 ml 0,125% trypsin / 0,5 mM EDTA-opløsning ved 37 ° C i 30 minutter i et 50 ml konisk rør ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Der centrifugeres ved 250xg og 25 ° C i 5 minutter og derefter fjerne trypsin løsning ved at kassere supernatanten.
- Der tilsættes 15 ml collagenase type II-opløsning og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære med lejlighedsvis rystning ifølge Leyva et al. 9
- Umiddelbart efter fordøjelse med collagenase II tilsættes 15 ml PBS og centrifugeres ved 250 xg og 25 ° C i 10 min.
- Supernatanten fjernes, og vaske den cellulære pellet med 15 ml PBS-opløsning, og der centrifugeres ved 250 xg og 25 ° C i 15 min. Supernatanten fjernes.
- Resuspender cellulære pellet i 10 ml HG-DMEM ved at ryste forsigtigt.
- Udvidelse af mesenkymale stamceller
- Seed 2 ml cellesuspension (1 x 10 4 celler / cm2) i dyrkningskolbe, og der tilsættes 2 ml HG-DMEM og inkuberes cellerne ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Fjerne ikke-adhærerende celler ved at ændre dyrkningsmediet efter 5-7dage.
- Efter denne tid ændre dyrkningsmediet hver 3 dage i yderligere 7-10 dage for at opnå en cellulær konfluens på 90%.
- Recover cellerne og inkuberes dem i 5 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære med 0,125% trypsin / EDTA-opløsning (trypsinbehandling).
- Umiddelbart efter trypsinisering, indsamle celler med en pipette og overføres til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 250 xg i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og resuspenderes cellulære pellet i 10 ml HG-DMEM.
- Kultur cellesuspension i to 75 cm2 dyrkningskolber (5 ml i hver kolbe), og opretholde kulturen indtil 90% konfluens.
- Gentag trin 1.4.3. til 1.4.6, indtil den 9. passage eller subkultur.
- Recover celler ved trypsinbehandling som i trin 1.4.3 til 1.4.5 til flowcytometri eller andre undersøgelser.
2. Forberedelse af de porøse Bone Matrix Disk (NKB)
- At fugte NKB diske(Diameter 12 mm, tykkelse 2 mm)., Inkubere hver skive natten over med 3 ml HG-DMEM uden FBS i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C ifølge Fassina et al 5
- Efter befugtning proces placere skiven i en 50 ml konisk rør og centrifugering ved 250 xg i 5 min for at fjerne overskydende dyrkningsmedium. Placer disken i en 24 brønds celledyrkningsplade.
- Der tilsættes 500 pi HG-DMEM og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C. Kontroller, at ingen bobler er til stede på NKB disk til at favorisere den korrekte fordeling af næringsstoffer og celler.
- Hvis bobler observeres på disken, ryst og tilsæt 300 pi af dyrkningsmedium og inkuberes i 15 minutter i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C. Efter denne tid fjernes 300 pi af dyrkningsmedium suger gennem væggen af godt cellekultur og bekræfte, at der ikke dannes bobler.
- Placer disk i en ny 24-brønds plade ved hjælp af simple pincet.
- Seed et cellulært suspension (5 x 10 05:00-hMSC'er i 100 pi HG-DMEM) fra tre subkulturer på overfladen af præ-befugtet biomateriale disk og inkuberes i 30 minutter i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C. Udfør dette trin langsomt og kontinuerligt på den øvre flade af biomaterialet at tillade cellerne at interagere med topografi alle stilladset. Bemærk: Denne procedure opnår 60% af cellerne fastgjort på biomaterialet vist i tabel 1.
- Tilføj 1,5 ml HG-DMEM ved 37 ° C og opretholde kulturen i 3 dage i en befugtet atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C. Må ikke generere turbulens i tilsætning af dyrkningsmedium for at undgå, at aflejringen af celler på bunden af dyrkningspladen skålen. Dette er første gang.
4. celleoverflademarkører Karakterisering af Flow CytomEtry
- Frigør cellerne fra 9. subkultur før podning dem på matricen disk. Brug 0,25% trypsin / 1 mM EDTA og løse dem i 30 minutter i iskold 2% formaldehyd. Efter fiksering vaskes cellerne en gang med 0,05% PBS.
- Blokere ikke-specifik binding ved inkubation af cellerne med 20% humant immunoglobulin til 3 min på is og inkuberes 0,1 x 10 6 celler portioner med phycoerythrin (PerCP) Mab mod CD73, FITC-konjugeret MAb CD90, PE-konjugeret MAb mod CD34 FITC-konjugeret MAb CD45 og PE-konjugeret MAb CD105 i 1 time ved 25 ° C i mørke. Isotype-matchet FITC-konjugeret MAb vil PE-konjugeret MAb andPerCP-konjugeret MAb tjener som negative kontroller.
- Beregn ekspressionsniveauerne af overflademarkører hjælp af software til indsamling og analyse af data.
5. Cell Adhæsion Detection af Scanning Electron Microscopy
- Skyl celle-disk prøver ved 3 dages kultur to gange med PBSog fixthe prøver med 4% (v / v) glutaraldehyd solutionin en 0,1 M Na-cacodylatbuffer (pH 7,2).
- Forberede prøverne til mikroskopisk observation som tidligere rapporteret af Rivera-N et al. 10 og iagttage ved hjælp af et scanningselektronmikroskop ved et elektrisk potentiale på 15 kV og ved en forstørrelse på 500X og 2000X.
6. celleproliferationsassay
- Til celle-disk prøver indeholdende 1,5 ml dyrkningsmedium, tilsættes 150 pi af vital farvestof (AB) ifølge producentens retningslinjer og inkuber cellerne i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C.
- Umiddelbart efter tilsætning af AB (0 timer), og hver 24 timer, indtil den når 7 dage cellekultur, måles absorbansen ved 570 nm med en reference på 600 nm.
7. kolonidannende enhed (CFU) 11
- Kultur 100 celler pr 100 mm vævskultur Diskin HG-DMEM og inkuberes i 14dage i en befugtet atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C.
- Vask kultur med PBS og pletten med 0,5% krystalviolet i methanol i 5-10 min ved stuetemperatur.
- Vask pladerne med PBS to gange og tælle de synlige kolonier ved hjælp af et hæmocytometer.
Representative Results
Humane mesenchymale stamceller isolation
Efter mekanisk adskillelse af AM fra chorion ved stump dissektion (figur 1), blev en adhærerende cellepopulation opnået ved trypsin og collagenase II fordøjelse. Disse cellepopulationer fastgjort i dyrkningsskålen Presenta fibroblastlignende cellemorfologi på 3 dage efter isolation som vist i optisk mikrografi (figur 2A) og scanningselektronmikrografi (figur 2B) .De placenta anvendt i dette arbejde blev opnået fra raske donorer mødre withprevious informeret samtykke.
Cell karakterisering ved flowcytometri
Befolkningen celle, der blev opnået fra AM var stærkt reaktiv til overfladen mesenkymale CD90 + (93,5% ± 6,85) og CD73 + og CD105 + (79% ± 3,46) og viste en negativ reaktion på hæmatopoietiske markører, såsom CD34- og CD45. SåledesAM-hMSC'er anvendes i dette arbejde var mesenkymale, ioverensstemmelse information tidligere rapporteret af Leyva et al. (figur 3). Derudover dette resultat falder sammen med de immunofænotype karakteristika, der blev fastlagt af International Society for Cellulær Terapi (ISCT) for mesenkymale stamceller.
Celleadhæsion på knoglematrix
De scanning micrographs viser adfærd AM-hMSC'er syv dage efter lagdeling på NKB. Overfladen af biomaterialet blev dækket med sfæriske celler (dag), og nogle spredning celler tilsyneladende bundet til bovin matrix overflade på den syvende dag. Ved højere forstørrelse viste spreading celler at være i tæt kontakt via filipodial processer (FL) (figur 4).
Celleproliferation på knoglematrix
Resultaterne af AB-analysen viste et lille fald i relativ absorbans u nit (RAU) af bovin matrix tilstand (+ knoglematrix) efter 1 dags inkubering og derefter på den femte dag, tilstedeværelsen af stilladset inducerer en stigning i celleproliferation statistisk signifikant i sammenligning med kulturen udføres i fravær af bovin matrix (-bone matrix) (figur 5).
Kolonidannende enhed
Den CFU er en traditionelt assay af stamceller. AM-hMSC'er isoleret i dette arbejde bevaret sin evne til at danne diskrete kolonier på 14 dage i kultur.
Figur 1: Isolering af fosterhinde. (A) navlestreng (UC) holdes med den ene hånd for at identificere den region, der er opnået fosterhinde. (B) fosterhinden (AM) ligner en gennemskinnelig film uden blod innervationer.
Figur 2:. Morfologiske karakteristika af stamceller fra det humane fosterhinde AM-hMSC kulturer ved 3 dage efter isolation blev observeret ved anvendelse af et optisk mikroskop og vist fibroblast-lignende morfologi.
Figur 3:. Flowcytometri karakterisering Cellerne fra human fosterhinde var hovedsagelig mesenchymale celler, fordi de var positive for mesenchymale markører (CD73, CD90, CD105), som vist ved forskydningen af histogrammet til højre, og negativ for hæmatopoietiske markører (CD34 og CD45), hvilket bekræftes af forskydning af histogrammet til venstre. Antigenerne er vist i rødt histogrammer, mens kontrolgruppen isotypesfor de fluorokromer PE og FITC observeressort.
Figur 4:.. Celleadhæsion om bovin knoglematrix En række SEM billeder viser binding af cellerne til porer biomaterialet (A) Panorama vision af NKB pore med flere celler adhæreret til biomaterialet i den sfæriske tilstand (CS) og fladtrykt (CF) på overfladen af biomaterialet er også muligt at værdsætte knoglen lakune indikerer som (Lac) på dag tre af kultur på bovine matrix. (B) Opformering af cellen i tilpasningen på overfladen af materialet gennem filipodial fremspring (C) Samspil mellem to celler klæbet og flad på den bovine matrix (C1, celle 1, og C2, celle 2).. Klik her for at view en større version af dette tal.
Figur 5:. Spredning af celler på bovin knoglematrix Celleproliferation blev vurderet ved AB reduktion og udtrykt i relative absorbansenheder langs 7 dage dyrkning. Resultaterne er vist indflydelsen af knoglematrix (+ knoglematrix) i AM-hMSC'er spredning, som var statistisk forskellig i sammenligning med den negative betingelse (-bone matrix). (* P <0,05)
Figur 6: CFU assay af MSC'er oprindeligt udpladet i varierende densiteter og inkuberet i 14 dage (middelværdi * / - SD, n = 10).
| Celler adhæreret | Celleadhæsion (%) | |
| Celler på bunden | 187.667 ± 1.208 | 62,47 |
| Celler på stilladset | 312.333 ± 1.208 | 37,53 |
Tabel 1:. Effektiviteten af vedhæftning på bovin matrix Cellerne klæbet til bunden af pladen skålen og cellerne klæber på stilladset blev talt ved hæmocytometer efter at være udvundet ved trypsinization.The data præsenteret i tabellen svarer til to forsøg uafhængig for tre eksemplarer ± standardafvigelse
Discussion
De stamceller, der blev opnået fra humant fostervand membran (figur 1) viste en fibroblast-lignende morfologi, svarende til mesenchymale celler (figur 2) og var hovedsagelig MSC'er. Desuden flowcytometri assays viste, at disse celler var positive for mesenchymale cellemarkører (CD73, CD90 og CD105) og negative for hæmatopoietisk linje markører (CD34, CD45) (figur 3). Også AM-hMSC'er isoleret i dette arbejde præsentere evne til at danne CFU'er (figur 6). Tilsvarende mesenkymale stamceller isoleret i denne form bibeholdt evnen til at knytte til osteoinductor biomateriale (figur 4), og proliferere på stilladset (figur 5).
Af disse grunde dyrkningsmetode af AM-hMSC'er på makroporøs knogle biomateriale, der blev anvendt i dette arbejde er en mulighed for at indsætte celler inden skadet knoglevæv og inducere dets Forskelntiation til osteoblastiske afstamning. Denne kultur kræver ikke tilsætning af osteoblastiske spoler til at opretholde osteoblastfænotypen og osteoblastisk differentiering proces, fordi NKB er en osteokonduktiv andosteoinductive materiale 8. Anvendelsen af affald væv, såsom human placenta, udgør en enkel og etisk alternativ adgang til en population af stamceller med potentiale til at differentiere til MSC'er i sammenligning med andre kilder, der ofte involverer invasive metoder eller lav celleudbytte.
Den foreslåede dyrkningsmetode kan ekstrapoleres til in vivo systemer, fordi cellerne podes i mikro-masse på den øverste overflade materiale, og cellerne koloniserer og overholde hele biomateriale overflade efter passende inkubationstider. Desuden er sofistikerede reagenser, udstyr og procedurer ikke er påkrævet, i modsætning til eksisterende metoder, når de gennemfører denne teknik er mikro-masse cultureas samtlangsomt og støt aflejring af den cellulære portion af materialet for at sikre, at cellerne fortrinsvis interagere med biomateriale og ikke med bunden af pladen. Et andet kritisk punkt er anvendelsen af præ-befugtet materiale, før dyrkning af cellerne, da dette sikrer, at cellerne vil have de nødvendige næringsstoffer fra dyrkningsmediet, når de integreres i materialet, uanset om de er på overfladen eller i porerne. Endelig er anvendelsen af en osteoinducerende biomateriale er afgørende for denne proces, fordi den undgår tilsætning af eksterne faktorer til at inducere og vedligeholde osteoblastisk differentiering. Begrænsningen af teknik er, at den er baseret på det osteoinduktive potentiale bovine matrix; imidlertid kan det foreslåede system kultur ekstrapoleres til porøst materiale med en pore distribution af 20 til 200 um. Derfor proceduren præsenteres i dette arbejde er en alternativ metode til dyrkning mesenchymstamceller i forskellige materialer that er ansat for tissue engineering, især for knogle regeneration.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender stipendiet og finansiel støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 og DGAPA IN216213; Salvador Correa fra Instituto Nacional de Perinatología om hjælp med det biologiske materiale; og Biocriss, SA de C. V for at donere Nukbone. Også tak til Ing. Héctor Martínez af IIM, UNAM og M DA C Fabiola Gonzalez af CINVESTAV til teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
