Introduction
Там пара и регенерации tissuesis одной из целей themain медицинской науки, потому что поражение в ткани ororgan может быть потере трудоспособности и, в некоторых случаях, к летальному исходу. В связи с этим работники здравоохранения и ученые постоянно ищут методы, методы и инструменты, чтобы обеспечить новый терапевтический alternativesto способствовать там процесс пара-регенерации поврежденной ткани. Таким образом, биомедицинские науки были сосредоточены на изучении мезенхимальных стволовых клеток (МСК), особенно взрослых стволовых клеток, потому что эта ячейка линия представляет собой идеальную модель для изучения процесса регенерации тканей, в связи с его потенциалом дифференцироваться в эктодермального, мезодермальной и эндодермальной клеточных поколений Однако, чтобы сделать терапию с МСК реальность, характеристика thetherapeutic потенциала МСК должно сопровождаться внедрением новых методов культивирования клеток с использованием биоматериалов и клеточных каркасов, которые гарантируют желаемого поведения МСК в ткани хозяина.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с декларации Всемирной медицинской ассоциации Хельсинки в отношении этического поведения исследований с участием людей и был одобрен научно-исследовательского этического совета факультета при де Медицина, НАУ (код проекта 101-2012).
1. Выделение мезенхимальных стволовых клеток
- Подготовка реагента
- Подготовка фосфатным буфером физиологический раствор (PBS) и добавку с 1% -ным раствором антибиотика-противогрибкового.
- Подготовка модифицированной среде Дульбекко Игла, с высоким содержанием глюкозы (DMEM-HG), и добавить 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков противогрибковое solution.Sterilize этот культуральной среды путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Приготовьте раствор коллагеназы II в 100 ЕД / мл в HG-DMEM без FBS или антибиотик противогрибкового раствора.
- Стерилизовать следующие хирургические инструменты, которые необходимы для выделения, в автоклаве: стандартный ножницамис, простой Режущая щипцы, тонкая точка и зубчатые щипцы и скальпель ручки (# 4).
- Выделение мезенхимальных стволовых клеток человека амниотической мембраны
- Держите пуповину одной стороны, и с другой стороны, отсоедините амниотической мембраны (АМ), который выглядит как полупрозрачный лист, чтобы получить фрагмент примерно 5 см 2. Если секция хориона присутствует в образце, отделить лежащую хориона при ручном вскрытия в разделе хориона толще, чем амнион.
- Удалить остатки крови с тремя промывками 5 мл PBS и удалить сгустки с простыми щипцов. Сделайте небольшой надрез в AM скальпелем, чтобы генерировать фрагменты примерно 0,5 см 2.
- Переваривание ферментом амниотической мембраны
- Инкубируйте AM 5 мл 0,125% трипсина / 0,5 мМ раствора EDTA при 37 ° С в течение 30 мин в 50 мл коническую пробирку при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Центрифуга на 250XG и 25 ° С в течение 5 мин, а затем удалить раствора трипсина путем отбрасывания супернатанта.
- Добавить 15 мл раствора коллагеназы типа II и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы при периодическом встряхивании в соответствии с Лейва др. 9
- Сразу после расщепления коллагеназы II, добавить 15 мл PBS и центрифуге при 250 мкг и 25 ° С в течение 10 мин.
- Жидкость над осадком сливают и промывают клеточный осадок с 15 мл раствора PBS и центрифуге при 250 мкг и 25 ° С в течение 15 мин. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл DMEM-HG, встряхивая осторожно.
- Расширение мезенхимальных стволовых клеток
- Семян 2 мл клеточной суспензии (1 х 10 4 клеток / см 2) в культуральной колбы и добавляют 2 мл среды DMEM-HG, и инкубируют клетки при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Устранить неадгезированных ячейку путем изменения культуральной среды после 5-7дней.
- По истечении этого времени, изменение культуральной среды каждые 3 дня в течение еще 7-10 дней, чтобы получить клеточный слияния 90%.
- Восстановление клеток и инкубируют их в течение 5 мин при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы с 0,125% раствора трипсина / EDTA (трипсином).
- Сразу же после обработки трипсином, собирают клетки с помощью пипетки и переносят в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют клеточный осадок в 10 мл DMEM-HG.
- Подвеска Культура клеток в двух 75 см 2 колбах культуры (5 мл в каждую колбу), и поддерживать культуру до 90% слияния.
- Повторите шаги 1.4.3. в пункте 1.4.6, до 9 прохода или субкультуры.
- Восстановление клеток от трипсинизации, как в шагах 1.4.3 1.4.5 для проточной цитометрии или других исследований.
2. Подготовка пористой Bone матричный диск (НКБ)
- Мочить диски Нкб(Диаметр, 12 мм; толщина 2 мм)., Инкубировать каждый диск в течение ночи с 3 мл DMEM-HG без FBS в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С, в соответствии с Fassina др 5
- После процесса смачивания, поместите диск в 50 мл коническую трубку и спина при 250 мкг в течение 5 мин для удаления избытка культуральной среде. Поместите диск в клеточной культуральной пластины 24 а.
- Добавить 500 мкл DMEM-HG, и инкубируют в течение 30 мин при 25 ° С. Убедитесь, что нет пузырей присутствуют на диске NKB в пользу правильного распределения питательных веществ и клеток.
- Если пузырьки наблюдаются на диске, встряхнуть и добавить 300 мкл культуральной среды и инкубируют в течение 15 мин в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. По истечении этого времени удалить 300 мкл культуральной среды сосать через стенку культуры клеток и также подтверждают, что не образуются пузыри.
- Поместите диск в новом 24-луночного планшета с помощью простых щипцами.
- Заполнение клеточной суспензии (5 х 10 5 утра-hMSCs в 100 мкл DMEM-HG) с трех субкультур, на поверхности предварительно смачивают биоматериала диска и инкубируют в течение 30 мин в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Выполните этот шаг медленно и непрерывно на верхней поверхности биоматериала, чтобы клетки, чтобы взаимодействовать с рельефом всех строительных лесов. Примечание: Эта процедура достигает 60% клеток, прикрепленных на биоматериала, представленные в таблице 1.
- Добавить 1,5 мл DMEM-HG при 37 ° С, и поддерживать культуру в течение 3 дней в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Не генерировать турбулентность в добавлении к культуральной среде избежать осаждения клеток на дно культуры пластины тарелки. Это начальный момент времени.
4. клеточной поверхности маркеры Характеристика потоком Cytomметрия
- Открепления клеток из 9-й субкультуры перед посевом их на матричном диске. Использование 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и исправить их в течение 30 мин в ледяной 2% формальдегида. После фиксации, мыть клетки один раз с 0,05% PBS.
- Блок неспецифическое связывание путем инкубации клеток с 20% человеческого иммуноглобулина в течение 3 мин на льду и инкубировать 0,1 х 10 6 клеток аликвоты фикоэритрином (PerCP) -conjugated моноклональное антитело против CD73, FITC-конъюгированного МАТ CD90, PE-сопряженных моноклональных антител против CD34 , ФИТЦ-конъюгированное MAb CD45 и РЕ-конъюгированные МАТ CD105 в течение 1 ч при 25 ° С в темноте. Изотипа FITC-сопряженных МКА, PE-сопряженных МКА andPerCP-сопряженных МАБ будут служить в качестве отрицательного контроля.
- Рассчитать уровни экспрессии поверхностных маркеров с помощью программного обеспечения для сбора и анализа данных.
5. Сотовый обнаружения адгезии методом сканирующей электронной микроскопии
- Промыть образцы клеток диском на 3 суток культивирования дважды PBSи fixthe образцы с 4% (объем / объем) глутарового альдегида solutionin в 0,1 М Na-какодилата буфера (рН 7,2).
- Подготовка образцов для микроскопического наблюдения, как сообщалось ранее в Rivera-N и др. 10 и наблюдать с помощью сканирующего электронного микроскопа при электрическом потенциале 15 кВ и при увеличении 500X и 2000X.
6. клеточной пролиферации Пробирной
- Для образцов клеток-диск, содержащий 1,5 мл культуральной среды, добавляют 150 мкл жизненно красителя (AB) в соответствии с рекомендациями производителя и инкубировать клетки в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С.
- Сразу же после добавления AB (0 ч) и каждого 24 ч до достижения 7 дней культивирования клеток, измеряют поглощение при 570 нм с контрольной длиной волны 600 нм.
7. колониеобразующие единицы (КОЕ) 11
- Культура 100 клеток на 100 мм культуре ткани Дискин HG-DMEM и инкубировать в течение 14дней в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С.
- Промыть культуры с PBS и пятна с 0,5% кристаллическим фиолетовым в метаноле в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
- Вымойте тарелки с PBS в два раза и подсчет видимые колонии с помощью гемоцитометра.
Representative Results
Человек мезенхимальных изоляция стволовых клеток
После механической сепарации Я от хориона с использованием тупым (рис 1), приверженцем клеточной популяции было получено трипсином и коллагеназой II пищеварения. Эти клеточные популяции, прикрепленные в культуральной чашке Presenta фибробластоподобных морфологии клеток на 3 день после изоляции, как показано на оптической микрофотографии (фиг.2А) и сканирующего электронного микроскопа (Фигура 2В) .The плаценты, используемые в данной работе были получены от здоровых доноров матерей withprevious информированное согласие.
Сотовый характеристика с помощью проточной цитометрии
Клеточная популяция, который был получен из М. был сильно реагируют на CD90 поверхность мезенхимальные маркеры + (93,5% ± 6,85) и CD73 + и CD105 + (79% ± 3,46) и показали отрицательную реакцию на гемопоэтических маркеров, таких как CD34- и CD45. Таким образом,АМ-hMSCs, используемые в этой работе были мезенхимальных, в accordancewith информации ранее сообщал Лейва и др. (Рисунок 3). Кроме того, этот результат совпадает с характеристиками Иммунофенотип, которые были созданы с помощью Международного общества клеточной терапии (ISCT) для мезенхимальных стволовых клеток.
Адгезия клеток на костный матрикс
Сканирующие микрофотографии показывают поведение АМ-hMSCs семи дней после наслоения на НКБ. Поверхность биоматериала покрывалась сферических ячеек (день один), а некоторые распространяющихся клеток, по-видимому, прикрепленных к бычьей поверхности матрицы на седьмой день. В большем увеличении распространяющихся клеток оказались в тесном контакте через filipodial процессов (FL) (Рисунок 4).
Клеточная пролиферация на костный матрикс
Результаты анализа показали, AB небольшое уменьшение относительной оптической плотности у нит (РАУ) бычьего матрица состояния (+ костного матрикса) после 1 дня инкубации, а затем на пятый день, наличие строительных лесов вызывает увеличение пролиферации клеток статистически значимое по сравнению с культурой, выполняемой при отсутствии крупного рогатого скота Матрица (-bone матрицы) (фиг.5).
Колониеобразующие единицы
КОЕ является традиционно анализа стволовых клеток. АМ-hMSCs выделенные в этой работе сохранил свою способность формировать отдельные колонии на 14 дней в культуре.
Рисунок 1: Выделение амниотической мембраны. (А) пуповинной (UC) проводится с одной стороны, чтобы определить область, в которой получают амниотической мембраны. (B) амниотической мембраны (АМ) напоминает полупрозрачную пленку без иннервации крови.
Рисунок 2:. Морфологические характеристики стволовых клеток из амниотической мембраны человека АМ-hMSC культуры в 3-х дней после изоляции наблюдались с помощью оптического микроскопа и показали фибробластов-подобную морфологию.
Рисунок 3:. Проточная цитометрия характеристики Клетки из человеческой амниотической мембраны в основном мезенхимные клетки, потому что они были положительными по маркерам (мезенхимальных CD73, CD90, CD105), как показано смещение гистограммы вправо, а отрицательные для гемопоэтических маркеров (CD34 и CD45), что подтверждается смещением гистограммы слева. Антигены показаны красным цветом гистограммы, а контроль isotypesfor флуорохромов ПЭ и FITC наблюдаются вчерный.
Рисунок 4:.. Адгезия клеток на бычьего костного матрикса A серии SEM изображений, показывающих прикрепление клеток в порах биоматериала (А) Обзорный видение NKB поры с нескольких клеток, прилипших к биоматериала в сферическом состоянии (CS) и уплощенные (CF) на поверхности биоматериала, также можно оценить кости пробел указывает, как (ЛАК) на три дня культуры на бычьей матрицы. (Б) Усиление клетки в процессе адаптации на поверхности Материал через filipodial прогнозов (C) Взаимодействие между двумя ячейками придерживались и уплощенных на бычьей матрицы (C1, клетка 1, и С2, ячейка 2).. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы VМЭН большую версию этой цифры.
Рисунок 5:. Пролиферации клеток на бычьей пролиферацию костных ячейки матрицы оценивали по снижению АВ и выражается в относительных единицах оптической плотности по 7 дней культивирования. Результаты показаны влияние костного матрикса (+ костного матрикса) в пролиферации АМ-hMSCs который был статически отличается по сравнению с отрицательным условием (-bone матрицы). (* Р <0,05)
Рисунок 6: Анализ КОЕ МСК изначально высевали при различных плотностях и инкубировали в течение 14 дней (в среднем * / - SD, n = 10).
| Клетки придерживался | Адгезия клеток (%) | |
| Клетки на нижней | 187667 ± 1208 | 62.47 |
| Клетки на эшафот | 312333 ± 1208 | 37.53 |
Таблица 1:. Эффективность сцепления на бычьей матрицы Клетки прилипшие к нижней части пластины тарелки и клеток, прилипших на строительные леса подсчитывали с помощью гемоцитометра после извлекают trypsinization.The данных, представленных в таблице, соответствуют два эксперимента независимо для трех экземплярах ± стандартное отклонение
Discussion
Стволовые клетки, которые были получены от человеческой амниотической мембраны (рис 1) показал, фибробластов морфологию, похож на мезенхимальных клеток (рисунок 2) и были в основном МСК. Кроме того, проточной цитометрии анализы показали, что эти клетки были положительными на мезенхимальных клеток маркеров CD73 (CD90, CD105, и) и отрицательный для гемопоэтических клона маркеров (CD34, CD45) (фиг.3). Кроме того, AM-hMSCs выделенные в этой работе представить возможность формирования КОЕ (рисунок 6). Аналогичным образом, мезенхимальные стволовые клетки, выделенные в таком виде сохраняется возможность приложить к osteoinductor биоматериала (рис 4), и размножаться на эшафоте (рис 5).
По этим причинам, метод культура AM-hMSCs макропористого кости биоматериала, который был использован в данной работе представляет возможность вставить ячейки в пределах потерпевшей костной ткани и вызывать его differentiation к остеобластов линии. Эта система культура не требует добавления остеобластов индукторов для поддержания процесса дифференцировки остеобластов фенотипа и остеобластов, поскольку это NKB остеокондуктивных andosteoinductive материал 8. Использование отходов тканей, таких как плаценты человека, представляет собой простой и этическую альтернативу доступа к популяции стволовых клеток с потенциалом к дифференцировке в МСК, по сравнению с другими источниками, которые часто включают инвазивные методы или низкий выход клеток.
Предлагаемый способ культура может быть экстраполированы на естественных условиях систем в потому, что клетки высевают в микро-массы на верхней поверхности материала, и клетки колонизировать и придерживаться всей поверхности биоматериала после соответствующих периодов инкубации. Кроме того, современные реагенты, оборудование и процедуры не требуется, в отличие от существующих методов при реализации этого метода являются микро-масс-cultureas такжемедленный и стабильный осаждение сотовой аликвоты по материала для того, чтобы клетки преимущественно взаимодействуют с биоматериала, а не с нижней части пластины. Другим важным моментом является использование предварительно увлажненный материал перед культивированием клеток, так как это гарантирует, что клетки будут иметь необходимые питательные вещества из культуральной среды, если они интегрированы в материал независимо от того, что они находятся на поверхности или в порах. И, наконец, использование остеиндуктивным биоматериала имеет решающее значение для этого процесса, так как он позволяет избежать добавление внешних факторов, чтобы вызвать и поддерживать остеобластов дифференциации. Ограничение техники является то, что она основана на остеиндуктивным потенциала бычьей матрицы; Однако, предлагаемая система культуры могут быть экстраполированы на любой пористый материал с распределением пор от 20 до 200 мкм. Таким образом, процедура представлена в этой работе является альтернативным методом для культивирования мезенхимальных стволовых клеток из различных материалов тшляпа используются для тканевой инженерии, особенно для регенерации костной ткани.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем стипендию и финансовую поддержку, оказанную совету по борьбе Насьональ де Ciencia у Tecnología (КОНАСИТ No.49887), Facultad де Медицина-НАУ DGAPA IN201510 и DGAPA IN216213; Сальвадор Корреа Instituto Nacional де Perinatología за помощью с биологическим материалом; и Biocriss, SA де С. V за предоставление Nukbone. Также благодарим Ing. Эктор Мартинес ММВ, НАУ и M EN C Фабиола Гонсалес CINVESTAV для оказания технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
