Summary
Ett protokoll för entorhino-hippocampus organotypisk slice kulturer, vilket gör det möjligt att återge många aspekter av ischemisk hjärnskada, presenteras. Genom att studera förändringar av neurovasculature utöver förändringar i neuronerna, är detta protokoll ett mångsidigt verktyg för att studera plast förändringar i neural vävnad efter skada.
Abstract
Ischemisk hjärnskada är bland de vanligaste och förödande villkor äventyrar korrekt hjärnfunktion och leder ofta till bestående funktions underskott i de drabbade patienterna. Trots intensiva forskningsinsatser, finns det fortfarande ingen effektiv behandling alternativet som minskar nervskada och skyddar nervceller i de ischemiska områden från fördröjd sekundär död. Forskning inom detta område innebär normalt användning av genomarbetade och problematiska djurmodeller. Entorhino-hippocampus organotypisk slice kulturer utmanade med syre och glukos deprivation (OGD) är etablerade in vitro-modeller som efterliknar cerebral ischemi. Den nya aspekten av denna studie är att förändringar av hjärnans blodkärl studeras förutom neuronala förändringarna och reaktionen av både det neuronala utrymmet och det vaskulära utrymmet kan jämföras och korreleras. De metoder som presenteras i detta protokoll avsevärt bredda potentiella tillämpningar av ellerganotypic bit kultur strategi. Induktion av OGD eller ensam hypoxi kan appliceras med ganska enkla medel i organotypiska slice kulturer och leder till tillförlitlig och reproducerbar skada i nervvävnad. Detta står i skarp kontrast till de komplicerade och problematiska djurförsök inducerar stroke och ischemi in vivo. Genom att bredda analysen till att omfatta studier av reaktionen av kärlsystemet kan ge nya sätt på hur att bevara och återställa hjärnfunktioner. Ansatsen bit kultur presenteras här kan utvecklas till en attraktiv och viktigt verktyg för studier av ischemisk hjärnskada och kan vara användbart för att testa potentiella terapeutiska åtgärder för neuroprotektion.
Introduction
Det centrala nervsystemet är särskilt känslig för förlust eller minskning av syre och glukostillförseln genom kärlsystemet. Även en ganska kort avbrott i blodtillförseln till hjärnan kan framkalla en permanent förlust av funktion av relevanta områden i hjärnan som leder till de typiska stroke syndrom. Förutom den neuronala förlusten i de primära drabbade områdena, är det typiskt ytterligare fördröjd neuronal förlust genom sekundär skada. Tyvärr hittills, ingen nervskyddande behandling för att minska sekundära neuronal död var tillgängliga 1. Forskningsinsatser för att studera mekanismerna för sekundära skador förlita sig på användningen av djurmodeller av cerebral ischemi som mellersta hjärnartären ocklusion och olika trombotiska ocklusion tekniker (för senaste översyn se 2). Parallellt också på grund av begränsningar och etiska frågor med hjälp av djurmodeller, organotypic bit kultur av olika CNS-vävnader har använts som gör att study av neuronala reaktioner på olika typer av skador 3-5.
För att studera neuronal reaktion under betingelser som efterliknar ischemisk hjärnskada, har modellsystemet av syre glukosbrist (OGD) utvecklats. I denna modell är slice kulturer temporärt exponeras för ett medium som saknar glukos och har jämviktats med kvävgas i frånvaro av syre. Med en sådan behandling är det möjligt att inducera neuronal skada och förlust som är ganska lik den en observerad efter ischemisk skada in vivo 6, 7. I hippocampus, inducerar sådan behandling neuronal förlust specifikt i CA1, men inte i CA3 område eller gyrus dentatus av hippocampus. Däremot studiet av vaskulära reaktioner i slice kulturer hittills har inte varit allmänt genomförts. En uppenbar orsak är bristen på cirkulation och blodkärl genomblödning i bit kultur-modellen. Vi har dock visat tidigare att det är möjligt att upprätthålla bdärvarande fartyg i CNS slice kulturer i flera dagar 8, 9.
Det övergripande målet med denna metod är att inte bara övervaka öde nervceller efter OGD men utöka studien till ödet och ombyggnad av kärlsystemet, som är en viktig del av skadan svar. Hittills sådana studier krävs användningen av djurförsök (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). I protokollet presenteras här, vi kommer detalj hur sådana studier kan göras i entorhino-hippocampus organotypiska slice kulturer utmanas antingen med hypoxi eller genom excitotoxiska lesioner följt av analys av både neuronala överlevnad och blodkärlsreaktioner. Protokollet bygger på en tidigare publicerad studie i ämnet 10 och kan vara användbar för alla laboratorier intresserade av neurovaskulära interaktioner i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 22 september 2010 (2010/63 / EU) och har granskats och godkänts av schweiziska myndigheter.
1 Ställa in Organotypic Entorhino-hippocampus Slice kulturer
- Förbered entorhino-hippocampus organotypiska slice kulturer (EHOSCs) från postnatal dag 4 (P4) mus valpar med hjälp av statiska inkubation metoden 4,11. Här använder C57BL6 och CB6F1 möss.
- Ta ca 30 min per mus valp för beredning av slice kulturer, dvs 3 timmar för en kull på 6 valpar mus. Utför alla steg under sterila förhållanden i ett laminärt flöde arbetsbänk med steriliserade kirurgiska instrument.
- För att undvika en eventuell störning från position snitt längs septo-temporala axeln, använd endast hippocampus skivor av septal halvan. Om inte annat anges, genomföra alla steg vid RT.
- Klipp av than chef för en P4 mus valp med kirurgisk sax. Ingen anestesi krävs för detta steg.
- Ta skallen runt hjärnan och identifiera spricka mellan den bakre änden av hjärnhalvorna och mellanhjärnan. Ta försiktigt bort den del av hjärnan rostralt till mellanhjärnan från skallen och placera den i iskall förberedelse medium bestående av MEM kompletterat med en stabiliserad form av L-glutamin.
- Fortsätt dissektion under ett stereomikroskop med hjärnan vara nedsänkt i det iskalla beredningen medium. Ta bort kvarvarande hjärnhinnor från kortikala hjärnhalvorna. Identifiera hippocampus vid mediala kaudala ytan av halvklotet och separera den tillsammans med den intilliggande entorhinal cortex från resten av hjärnan.
- Överför vävnaden till en vävnad chopper och skär 400 nm tjocka skivor under aseptiska förhållanden tvärgående till septo-temporala axeln i hippocampus.
- Placera skivorna på cell kultur lägg (ca 6 skivor per insats) och inkubera dem i 6-brunnars plattor med 1 ml per brunn av inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml hästserum, 1 ml glutamax I, 1 ml av en steril 10% glukoslösning, pH 7,3) i en fuktad atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C. Ändra mediet nästa dag och sedan varannan dag upp till 1 vecka.
2 In vitro Hypoxia och Oxygen-glukosbrist med Reperfusion
- Se tabell 1 för en exakt tidsplan för förfarandet. Kultur EHOSCs för 5 dagar (DIV5) före exponering för hypoxi eller OGD. Vid denna tidpunkt byta mediet från inkubationsmediet innehållande 25% hästserum till serumfritt medium med följande sammansättning: Neurobasal-medium med 2% B27 supplement, 1% glutamax och ytterligare 0,1% glukos.
- Förbered OGD mediet som beskrivs i referens 7 .De slutliga koncentrationerna av komponenterna kommer att vara följande: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCOs 3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4, och 10 mM sackaros vid pH 6,8. Tillsätt 1 ml OGD-medium till varje brunn i två 6-brunnars vävnadsodlingsplattor.
- BEGJUTA OGD medium med N2 under 1 h i en hypoxi kammaren och sedan försegla och hålla O / N i en inkubator vid 37 ° C.
- Använd anaeroba remsor som hypoxiska indikatorer. Betrakta mediet vara syrefri när färgen av remsorna ändrades från rosa till vit.
- För induktion av hypoxi, använd serumfritt medium med glukos istället för OGD medium. Före användning, BEGJUTA mediet med N2 i en hypoxi kammare enligt ovan för OGD medium.
- Innan skivorna utsätts för OGD, BEGJUTA OGD mediet åter med N2 under 30 min. Lägg 2 | il av en 1 mg / ml propidiumjodid (PI)-lösning per brunn (för en slutlig koncentration av 2 | ig / ml) till skivorna för 30 min och väljendast friska skivor för experiment som indikeras av lågt antal PI-positiva celler.
- Använd schemat för OGD exponering och reperfusion anges i figur 1. Beröva skivor av antingen syre endast (hypoxi) eller syre och glukos (OGD) i 15 min.
- För induktion av hypoxi eller OGD, överföra skivor i OGD medium och hålla i 15 minuter i hypoxi kammaren. Se till att alla vätskor som finns kvar på sidorna av insatsen aspireras bort när kulturerna kopplas från vanlig medium till OGD medium och tillbaka.
- Efter hypoxi eller OGD, ersätta OGD medium med syresatt serumfritt medium och kulturerna tilläts återhämta sig under 3, 24 eller 48 h i serumfritt medium i det reguljära inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Lägg PI igen före fixering för bestämning av celldöd.
3. farmakologiska behandlingar av Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer
- Culture EHOSCs för 5 dagar (DIV5) i inkubationsmedium före exponering för farmakologisk behandling. Börja farmakologiska behandlingar antingen under OGD eller omedelbart efter OGD när skivorna överförs till serumfritt medium.
- Behandlingar för skydd mot OGD.
- Lägg 100 pM 6-cyano-7-nitrokinoxalin-2.3-dion (CNQX) eller 1 uM tetrodotoxin (TTX) till odlingsmediet under OGD induktion (för 15 min) eller omedelbart efter OGD induktion för 30 min. Sedan inkubera i normoxisk serumfritt medium under 48 timmar före fixering.
- Behandlingar för induktion av excitotoxisk död.
- Efter 5 dagar i inkubationsmediet switch kulturerna till serumfritt medium innehållande 100 | iM (RS) -α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) under 30 min.
- Avlägsna odlingsmediet innehållande AMPA genom aspiration (ta hand för att avlägsna eventuellt kvarvarande medium på skär), sedan överföra skivorna till färska plattor med normalt serumfritt medium ochhålla dem under 48 timmar tills fixering.
4. Fixering och immunfärgning av Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer
- Propidiumjodid (PI)-färgning.
- Lägg PI i 30 min till odlingsmediet levande skivor i en koncentration av 2 mikrogram / ml. Se levande kulturer med ett inverterat mikroskop utrustat med fluorescensoptik och väljer skivor för ytterligare behandlingar. För PI färgning i kombination med immunohistokemi, till PI lösning 30 minuter före fixering av kulturerna.
- Fixering av skivorna.
- Avlägsna odlingsmediet från 6-brunnar och tillsätt 3 ml nyberedd 4% paraformaldehyd (PFA) till varje brunn. Placera sedan 6-brunnar i kylskåp och fixa O / N vid 4 ° C.
- Avlägsna PFA lösning följande dag och tvätta skivorna 3-4 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Avlägsnande av skivorna från cellkulturen insert och blockering förfarande för immunohistokemi av fritt flytande sektioner.
- Försiktigt loss och ta bort skivorna från odlingsinsatser med hjälp av en konst pensel storlek 0 eller mindre. Överför varje enskild skiva i en brunn i en 96 brunnars platta fylldes med blockeringsbuffert (PBS med 3% normalt getserum (NGS) och 2% Triton-X100). Håll skivorna i blockeringsbuffert under 2 h vid rumstemperatur under konstant omröring genom orbitalskak.
- Immunfärgning av slice kulturer
- För märkning blodkärl använda polyklonala anti laminin vid en utspädning av 1: 200 i PBS innehållande 1% NGS och 0,5% Triton-X100.
- För märkning nervceller använda anti-mikrotubuli associerat protein 2 (MAP2) vid en spädning 1: 500 i PBS innehållande 1% NGS och 0,5% Triton-X100.
- Inkubera skivor med primära antikroppar för 48 h vid 4 ° C med konstant omrörning. Efter inkubationstiden, tvätta dem i PBS med 0,5% Triton-X100 för 3-4 gånger. Späd sekundära antikroppar 1: 500 i PBS innehållande 1% NGS och 0,5% Triton-X100. Inkubera skivor för 2 h vid RT i mörker med Alexa fluoroforenheter konjugerade sekundära antikroppar. Använd lämplig get-anti-kanin eller getantimus sekundär antikropp konjugerad med Alexa 350 eller 488.
- Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta skivorna tre gånger med Tris-buffrad saltlösning (TBS); montera dem på objektglas och täckglas glasen med Mowiol.
- Mikroskopi av de färgade skivor
- Visa de färgade skivorna antingen på en standardmikroskop med epifluorescens utrustning eller med en konfokalmikroskop. Ta bilder med en lämplig kamera. För vissa bilder, invertera fluorescens kontrast för att ge mörkt färgade fartyg på en ljus bakgrund (figur 5 och 6).
5. Fastställande av regionala fartygs Densitet i kulturer
- Kvantifiera Vessel täthet baserad på fartygskorsningar som beskrivits i referens 8.
- Använd skivor som färgats för laminin för dessa mätningar. Överlagra inspelade bilder av 10X förstoring med en 6 x 6 rutnät, där varje galler är lika med 100 x 100 ^ m per kvadratmeter, totalt fält av 0,25 mm 2.
- Overlay tre sådana nät i CA1, CA3, GD, och EG-region (Figur 2). Räkna fartygen passerar linjerna i rutnätet.
- För att nå resultat med en bra statistisk relevans, göra mätningar i minst 3 oberoende experiment, varje inklusive data från tre mus valpar med 3 skivor per mus valp.
- Bestäm medelvärdet av fartygskorsningar från gallren för varje region och utföra en statistisk analys med ANOVA med Bonferroni korrektion som post hoc test (p <0,05 definieras som signifikant) med hjälp av lämpliga statistikprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syre glukos deprivation och hypoxi inducerar nervcellsdöd och minskning blodkärl specifikt i hippocampus CA1 regionen.
OGD eller syre-deprivation ensamt under 15 minuter inducerade en stark induktion av celldöd såsom ses genom propidiumjodidfärgning specifikt i CA1-området i hippocampus (figur 3) liknande som beskrivits tidigare 7. Med markörer för att visualisera nätverket av blodkärl, visade det sig att blodkärlet täthet och organisation verkade liknar kontrollen efter OGD utmaning i de flesta delar av kultur med undantag för CA1 regionen. Det blodkärlsdensiteten minskas och blodkärlsnätet var delvis störde (fig 3, E och F). Dessa förändringar sågs endast i det område där den propidiumjodidfärgning ökades.
Tidsförloppet för de kärlförändringar paralleller som neuronal degeneration.
Vi har studerat tidsförloppet för både neuronal degeneration och blodkärl förlust i CA1 använder tidpunkter på 3 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter syrebrist (hypoxi). Vid 3 timmar efter hypoxi, fanns det ingen propidiumjodidfärgning synlig och det fanns inga förändringar som finns i blodkärl arkitekturen tyder på att vid denna tid inga förändringar var synliga men ändå (Figur 4, A och B). Vid 24 timmar efter hypoxi fanns utseende propidiumjodidfärgning anger utvecklingen av celldöd i CA1. Vid denna tidpunkt det nätverk av blodkärl redan störd och blodkärl gick förlorade i CA1-regionen (Figur 4, C och D). Både, propidiumjodidfärgning och blodkärl förlust blev mer uttalad vid 48 timmar efter hypoxi (Figur 4, E och F).
Både nervcellsdöd ochblodkärl förlust förhindras genom att blockera excitation efter OGD eller hypoxi.
När vi kombinerat OGD med farmakologisk behandling som hindrade skjutande glutamat release, var det möjligt att rädda nervceller från OGD-inducerad celldöd. Behandling med TTX (som hämmar aktionspotential generation vilket resulterar i att tysta afferenta terminaler) eller behandling med CNQX (som hämmar AMPA-typ glutamatreceptorer) räddade CA1 pyramidala celler från nervcellsdöd (Figur 5, D och F). Dessa resultat indikerar att nervcellsdöd efter OGD förmedlas genom excitotoxiska verkan av glutamat. Efter dessa behandlingar, var inte bara neuronal celldöd förhindras, men också fartygets integritet bevarades och förlusten av blodkärl i CA1 hindrades (Figur 5, C och E).
AMPA behandling inducerar omfattande excitotoxisk nervcellsdöd i hippocampus but fartyg förlusten är begränsad till CA1.
OGD som användes i denna studie inducerar nervcellsdöd specifikt i CA1. I kontrast, behandling med 100 jiM AMPA till 30 min inducerades en utbredd neuronal förlust i hela Cornu Ammonis av hippocampus (CA1 och CA3) och subiculum men inte i gyrus dentatus (figur 6C). Intressant nog blodkärl förlust begränsad till CA1-regionen, trots en liknande neuronal förlust i CA3 fanns det ingen blodkärl förlust i denna region (figur 6D). I gyrus dentatus fanns varken nervcellsdöd eller blodkärl förlust. Kvantifieringen av fartygets täthet bekräftar att blodkärl går förlorade i CA1, men inte i andra delar av kulturen Figur 6E.
Figur 1 Schema över OGD exponering och reperfusion. Efter 5 dagar in vitro kulturer utsätts för OGD, hypoxi eller AMPA behandling. Kulturer är fasta efter en överlevnadstid på 3 timmar, 24 timmar och 48 timmar.
Figur 2 Kvantifiering av blodkärlstätheten i olika regioner av entorhino-hippocampus slice kulturer. Tre 6 x 6 galler (här visas som fyrkanter) överlagras i CA1, CA3, GD, och EG-region. Blodkärlen passage av de inre linjerna i rutnätet räknades för varje ruta.
Figur 3 Hypoxi behandling inducerar nervcellsdöd och blodkärl förlust i CA1. (A,C, E) kontrollkulturer, (B, D, F) kulturer utsätts för hypoxi behandling följt av 48 timmar av normoxi. Laminin immunfärgning vid låg förstoring i grönt (A, B), PI färgning vid högre förstoring i rött (C. D), sammanslagna bilder för laminin och PI färgning i (E) och (F). Skala barer i (B för A, B) och (F för C, D, E, F) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Tidsförlopp för vaskulära förändringar och neuronaldegeneration efter syrebrist (hypoxi). PI färgning i rött visas i (A, C, E), sammanslagna bilder för PI färgning och laminin (grön) som visas i (B, D, F). Vid 3 h efter hypoxi behandling, finns det ingen PI-färgning synlig och inga kärlförändringar är uppenbara (A, B). Efter 24 h PI färgning framträder och blodkärl förlust är också uppenbart (C, D). Både PI färgning och blodkärl förlust bli mer uppenbart efter 48 h (E, F). Skala bar i (F) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5.; Neurondöd och blodkärl förlust förhindras av blockerare av neuronala excitation Tillämpning av antingen TTX (C, D) eller CNQX (E, F) förhindrade både neuronal förlust ses med PI färgning (B, D, F) och blodkärl. förlust avslöjades av laminin färgning (A, C, E). OGD inducerar ensam både neuronal förlust och förlust av blodkärl i CA1 (A, B). Skala bar i (F) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Neurondöd och blodkärl förlust efter AMPA behandling. Behandling med 100 iM AMPA 30 min inducerade utbreddneuronal förlust i de flesta områden i hippocampus (C), men förlusten av blodkärl förblev begränsat till området CA1 (D). Scale bar in (D) = 100 um. Kvantifieringen av blodkärl bekräftar selektiv förlust i CA1-området (E). Kolumnerna visar det genomsnittliga antalet fartygskorsningar, felstaplar visar SEM. Signifikanta skillnader är markerade med ** för p <0,01. Resultaten kommer från tre oberoende försök med tre analyserade kulturer var (n = 9) för varje region. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tid | Åtgärd |
| DIV 4 | Förbered OGD eller hypoxi mediet |
| DIV 4 | BEGJUTA OGD ellerhypoxi medium med N2 under 1 h i en hypoxi kammaren och sedan försegla och hålla O / N i en inkubator vid 37 ° C |
| DIV 4 | Slå kulturerna till Neurobasal serumfritt medium + glukos från inkubationsmedium, låta dem vila O / N eller 1 dag |
| DIV 5 | BEGJUTA OGD mediet åter med N2 under 30 min |
| DIV 5 | Tillsätt 2 l av en 1 mg / ml propidiumjodid (PI)-lösning per brunn (till en slutkoncentration av 2 mikrogram / ml) till skivorna i 30 min och bara välja sunda skivor för experiment som indikeras av lågt antal PI-positiva celler |
| DIV 5 | Suck utanför den ordinarie medium och lägg OGD medium till brunnarna. Se till att alla vätskor som finns kvar på sidorna av insatsen aspireras bort när kulturerna kopplas från vanlig medium till OGD / hypoxi medium och tillbaka. Överför plattan till hypoxi kammaren |
| DIV 5 | BEGJUTA med N2 under 15 min i hypoxi kammaren |
| DIV 5 | Ta bort plattan från kammaren. Byt tillbaka till Neurobasal medium och placera tillbaka i fuktad inkubator med 5% CO2 |
| DIV 5 | Lägg PI och fixa 3 h efter OGD / hypoxi under 3 timmar intervall |
| DIV 6 | Lägg PI och fixa 24 timmar efter OGD / hypoxi under 24 h intervall |
| DIV 7 | Lägg PI och fixa 48 timmar efter OGD / hypoxi under 48 timmar intervall |
Tabell 1 Detaljerad tid sekvens av steg för OGD / hypoxi behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de metoder som presenteras här, kan hippocampus organotypiska slice kulturer användas som ett mångsidigt verktyg för att studera plast förändringar i nervvävnad efter skada. Medan organotypiska slice kulturer har använts tidigare för att studera neuronala reaktioner efter ischemi 6, 7 den nya aspekten av samtidiga studier av kärlförändringar avsevärt förbättrar de potentiella tillämpningar av denna metod. Induktion av OGD eller ensam hypoxi kan appliceras med ganska enkla medel i organotypiska slice kulturer och leder till tillförlitlig och reproducerbar skada i nervvävnad. Dessutom tillåter bit kultur strategi inte bara studera konsekvenserna av ischemisk utmaning men också medger provning av potentiella terapeutiska åtgärder för neuroprotektion. Slice kulturer är därför ett attraktivt och viktigt verktyg för studier av ischemisk hjärnskada.
Den metod som presenteras här är lätt att genomföra för alla laboratorier hektarving viss erfarenhet av CNS-slice kulturer. Applicering av OGD eller hypoxi kräver en noggrann ekvilibrering av odlingsmediet med N 2 i syfte att uppnå reproducerbara resultat. Det är också viktigt att endast använda slice kulturer med låg antalet PI-positiva celler före applicering av OGD. Villkoren för hypoxi (dvs den tid för vilken hypoxi eller OGD tillämpas) kan varieras och optimeras beroende på vilken typ av skiva kultur används.
Medan neuronala reaktioner på ischemi har studerats ingående finns det bara lite information om kärlförändringar efter hypoxisk-ischemisk hjärnskada. Upptäckten att blodkärl och till och med markörer för blodhjärnbarriären bibehålls i organotypiska slice kulturer i upp till en vecka 8, 9 har öppnat möjligheten att studera förändringar i kärlsystemet efter hypoxi utmaning i inställningen av hippocampus organotypiska slice kulturer 10. Naturligtvis behövervara medveten om att de fartyg som hålls i slice kulturer inte perfusion. Vidare har vi observerat skillnader i förlust av redan existerande blodkärl snarare än omfattande bildning av nya blodkärl. Detta modellsystem är därför antagligen inte optimala för att studera nya fartyget bildning efter en ischemisk skada.
Möjligheten att använda organotypic hippocampus slice kulturer för ytterligare belysning av det komplexa samspelet mellan nervceller och kärlsystemet öppnar ett nytt ämnesområde och lovar att bidra till att uppnå en bättre förståelse för och utveckling av nya behandlingsalternativ för neurovaskulära sjukdomar, särskilt cerebral ischemi efter stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurförsök genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 24 november 1986 (86/609 / EEG) och har granskats och godkänts av schweiziska myndigheter. Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av universitetet i Basel, Institutionen för biomedicin, och Schweiziska National Science Foundation (31003A_141007). Markus Saxer lämnade tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
