Summary
En protokol til entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer, som gør det muligt at gengive mange aspekter af iskæmisk hjerneskade, er præsenteret. Ved at studere ændringer i neurovasculature udover ændringer i neuroner denne protokol er et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade.
Abstract
Iskæmisk hjerneskade er blandt de mest almindelige og ødelæggende betingelser, som forringer korrekt hjernens funktion og ofte fører til vedvarende funktionelle mangler i de berørte patienter. Trods intensiv forskning, er der stadig ingen effektiv behandling til rådighed, der reducerer neuronal skade og beskytter neuroner i iskæmiske områder fra forsinket sekundær død. Forskning på dette område involverer typisk brugen af kunstfærdige og problematiske dyremodeller. Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer udfordret med ilt og glukose afsavn (OGD) er etableret in vitro modeller, der efterligner cerebral iskæmi. Det hidtil ukendte aspekt ved denne undersøgelse er, at ændringer i hjernens blodkar undersøgt i tillæg til neuronale ændringer og omsætning af både neuronale rum og det vaskulære rum kan sammenlignes og korreleret. De metoder, der præsenteres i denne protokol væsentligt udvide de potentielle anvendelser af ellerganotypic skive kultur tilgang. Induktionen af OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske skive kulturer og fører til en pålidelig og reproducerbar skader i nervevæv. Dette er i skarp kontrast til de komplicerede og problematiske dyreforsøg inducerer slagtilfælde og iskæmi in vivo. Ved at udvide analysen til også at omfatte undersøgelse af reaktionen af karrene kunne give nye måder om, hvordan at bevare og genoprette hjernens funktioner. Den skive kultur strategi, der fremlægges her, kan udvikle sig til et attraktivt og vigtigt redskab for studiet af iskæmisk hjerneskade og kan være nyttig til at teste potentielle terapeutiske foranstaltninger med henblik på neuroprotektion.
Introduction
Det centrale nervesystem er særlig følsomt over for et tab eller reduktion af ilt og glukose levering fra karrene. Selv en forholdsvis kort afbrydelse af blodforsyning til hjernen kan inducere et permanent tab af funktion af de relevante områder i hjernen, der fører til de typiske slagtilfælde syndromer. Ud over den neuronale tab i de primære berørte områder, der typisk er yderligere forsinket neuronal tab gennem sekundær skade. Desværre indtil nu, ingen neurobeskyttende behandling til reduktion af sekundær neuronal død var tilgængelig 1. Forskningsindsatsen for at studere de mekanismer for sekundær skade stole på brugen af dyremodeller for cerebral iskæmi som mellem-cerebral arterieokklusion og forskellige trombotiske okklusion teknikker (for en nylig se 2). Parallelt hermed på grund af begrænsninger og etiske betænkeligheder ved brug af dyremodeller, organotypisk skive kultur af flere forskellige CNS væv også have været brugt som tillader study af neuronale reaktioner på forskellige typer af skader 3-5.
For at studere den neuronale reaktion under betingelser, der efterligner iskæmisk hjerneskade, har modelsystemet af ilt glucosemangel (OGD) blevet udviklet. I denne model er skivekulturer midlertidigt udsat for et medium, der mangler glukose og er blevet ækvilibreret med nitrogengas i fravær af oxygen. Med en sådan behandling, er det muligt at inducere neuronal skade og tab, som er temmelig svarer til den observeret efter iskæmisk skade in vivo 6, 7. I hippocampus sådan behandling inducerer neurontab specifikt i CA1, men ikke i CA3-området eller gyrus dentatus i hippocampus. I modsætning hertil, undersøgelse af vaskulære reaktioner i skivekulturer hidtil ikke blevet bredt iværksat. En oplagt årsag er den manglende cirkulation og blodkar perfusion i skive kultur modellen. Men vi har tidligere vist, at det er muligt at opretholde bLood fartøjer i CNS skivekulturer i flere dage 8, 9.
Det overordnede mål med denne metode er at ikke blot overvåge skæbnen af neuroner efter OGD men udvide undersøgelsen til skæbne og ombygning af karrene, som er en vigtig del af den skade respons. Indtil nu sådanne undersøgelser har krævet brugen af dyreforsøg (De Jong et al, 1999;. Cavaglia m.fl., 2001.). I protokollen fremlagt her, vil vi beskrive, hvordan sådanne undersøgelser kan udføres i entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer udfordret, enten med hypoxi eller excitotoksiske læsioner efterfulgt af analyse af både neuronal overlevelse og blodkar reaktioner. Denne protokol er baseret på en tidligere offentliggjort undersøgelse om dette emne 10 og kan være nyttige for alle laboratorier interesseret i neurovaskulære interaktioner i centralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 22. september 2010 (2010/63 / EU) og blev revideret og godkendt af de schweiziske myndigheder.
1. Opsætning Organotypiske Entorhino-hippocampus skivekulturer
- Forbered entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer (EHOSCs) fra postnatal dag 4 (P4) museunger ved hjælp af den statiske inkubation metode 4,11. Her, brug C57BL6 og CB6F1 mus.
- Tage cirka 30 minutter pr mus hvalp til fremstilling af skive kulturer, dvs 3 timer til et kuld på 6 museunger. Udfør alle trin under sterile betingelser i en laminar strømning arbejdsbord med steriliserede kirurgiske instrumenter.
- For at undgå en eventuel indblanding fra positionen af skive langs septo-temporale akse, kun bruge hippocampus skiver af septal halvdel. Hvis ikke andet er anført, at udføre alle trin på RT.
- Skær than leder af en P4 mus hvalp med kirurgisk saks. Ingen anæstesi er påkrævet for dette trin.
- Fjern kraniet omkring hjernen og identificere revne mellem den caudale ende af cerebral hjernehalvdele og midthjernen. Fjern forsigtigt den del af hjernen rostralt for midthjernen fra kraniet og placere den i iskoldt forberedelse medium bestående af MEM suppleret med en stabiliseret form af L-glutamin.
- Fortsæt dissektion under et stereomikroskop med hjernen at blive nedsænket i iskold forberedelse medium. Fjern de resterende meninges fra kortikale halvkugle. Identificer hippocampus ved den mediale caudale overflade halvkugle og adskille den sammen med det tilstødende entorinale bark fra resten af hjernen.
- Overfør væv til en vævshakker og sender 400 um tykke skiver under aseptiske forhold, tværgående til septo-temporale akse hippocampus.
- Placer skiver på cell kultur indsatser (ca. 6 skiver per skær) og inkubere dem i 6-brønds plader med 1 ml per brønd af inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle-medium, 25 ml hesteserum, 1 ml glutamax I 1 ml af en steril 10% glucose, pH 7,3) i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Skift mediet næste dag og derefter hver anden dag op til 1 uge.
2. In vitro Hypoxi og Ilt-glucosemangel med Reperfusion
- Se Tabel 1 for en nøjagtig tidsplan for proceduren. Kultur EHOSCs for 5 dage (DIV5) før eksponering for hypoxi eller OGD. På dette tidspunkt skifter mediet fra inkubationsmedium indeholdende 25% hesteserum til serum-frit medium med følgende sammensætning: Neurobasal medium med 2% B27 supplement, 1% Glutamax og yderligere 0,1% glucose.
- Forbered OGD medium som beskrevet i Henvisning 7 .De endelige koncentrationer af komponenter vil være følgende: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5,25 mM NaHCO3, 70 mM KCI, 1,25 mM NaH 2 PO4, 2 mM MgSO4 og 10 mM sucrose ved pH 6,8. Der tilsættes 1 ml OGD medium til hver brønd i to 6-brønds vævskulturplader.
- Perfundere OGD medium med N2 i 1 time i en hypoxi kammer og derefter forsegle og holde O / N i en inkubator ved 37 ° C.
- Brug anaerobe strimler som hypoxiske indikatorer. Overvej mediet at være oxygenfrit når farven af strimlerne ændret fra lyserød til hvid.
- Til induktion af hypoxi bruge serumfrit medium med glucose i stedet for OGD medium. Før brug perfuse mediet med N2 i en hypoxi kammer som beskrevet ovenfor for OGD medium.
- Før skiverne udsættes for OGD, perfundere OGD mediet igen med N2 i 30 minutter. Tilsæt 2 pi af en 1 mg / ml propidiumiodid (PI) opløsning per brønd (til en slutkoncentration på 2 ug / ml) til skiver i 30 minutter, og vælgkun raske udsnit til eksperimenter som indikeret ved lave antal af PI positive celler.
- Brug tidsplanen for OGD eksponering og reperfusion angivet i figur 1. Fratage skiver af enten ilt kun (hypoxi) eller ilt og glukose (OGD) i 15 min.
- Til induktion af hypoxi eller OGD overføre skiverne i OGD mellemstore og holde i 15 min i hypoxi kammer. Sørg for, at alle væsker, der forbliver på siderne af indsatsen er suget væk, når kulturerne skiftet fra almindelig medium til OGD mellemlang og ryg.
- Efter hypoxi eller OGD, erstatte OGD medium med oxygeneret serumfrit medium og kulturer får lov til at komme sig i 3, 24 eller 48 timer i serumfrit medium i den regelmæssige inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Tilføj PI igen før fiksering til bestemmelse af celledød.
3. farmakologisk behandling af Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer
- Culture EHOSCs for 5 dage (DIV5) i inkubationsmedium før eksponering for farmakologiske behandlinger. Start farmakologiske behandlinger hverken under OGD eller umiddelbart efter OGD når skiver overføres til serum-frit medium.
- Behandlinger for beskyttelse fra OGD.
- Tilføj 100 uM 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dion (CNQX) eller 1 pM tetrodotoxin (TTX) til dyrkningsmediet under OGD induktion (i 15 minutter) eller umiddelbart efter OGD induktion i 30 minutter. Derefter inkuberes i normoxisk serumfrit medium i 48 timer før fiksering.
- Behandlinger for induktion af excitotoksisk død.
- Efter 5 dage i inkubationsmediet switch kulturer til serumfrit medium indeholdende 100 pM (RS) -α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) i 30 min.
- Fjern dyrkningsmediet indeholdende AMPA ved aspiration (sørge for at fjerne eventuelle medie på indlæg), og derefter overføre skiver til friske plader med normal serum-frit medium ogholde dem i 48 timer indtil fiksering.
4. Fiksering og immunfarvning af Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer
- Propidiumiodid (PI) farvning.
- Tilføj PI i 30 minutter til dyrkningsmediet af levende skiver i en koncentration på 2 ug / ml. Se levende kulturer med et inverteret mikroskop udstyret med fluorescens optik og vælg udsnit til yderligere behandlinger. For PI-farvning i kombination med immunhistokemi, tilføje PI opløsning 30 minutter før fiksering af kulturerne.
- Fiksering af skiverne.
- Fjern kulturmediet fra 6-brønds plade og tilsæt 3 ml frisk fremstillet 4% paraformaldehyd (PFA) til hver brønd. Derefter placere den 6-brønds plade i et køleskab og løse O / N ved 4 ° C.
- Fjern PFA løsning den følgende dag og vaske skiverne 3-4 gange med phosphatbufret saltvand (PBS).
- Fjernelse af skiverne fra cellekultur Insert og blokering procedure for immunhistokemi af frit svævende sektioner.
- Løsn forsigtigt og fjern skiver fra kulturen indlæg med en kunst pensel størrelse 0 eller mindre. Overfør hver enkelt skive i en brønd på en plade med 96 brønde fyldt med blokerende buffer (PBS med 3% normalt gedeserum (NGS) og 2% Triton-X100). Hold udsnit i blokerende puffer i 2 timer ved stuetemperatur under konstant omrøring ved en orbitalryster.
- Immunfarvning af skivekulturer
- Ved mærkning blodkar bruger polyklonalt anti-laminin i en fortynding på 1: 200 i PBS indeholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100.
- Til mærkning af neuroner bruge anti-mikrotubuli associeret protein 2 (MAP2) i en fortynding på 1: 500 i PBS indeholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100.
- Inkubér skiver med primære antistoffer i 48 timer ved 4 ° C med konstant omrøring. Efter inkubationstiden, vaske dem i PBS med 0,5% Triton-X100 til 3-4 gange. Fortyndet sekundære antistoffer 1: 500 i PBS indeholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100. Inkubér skiver i 2 timer ved stuetemperatur i mørke med Alexa fluoroforen konjugeret sekundære antistoffer. Brug den relevante gede-anti-kanin-eller gede-anti-muse-sekundært antistof konjugeret til Alexa 350 eller 488.
- Fjern det sekundære antistof opløsning og vaske skiver tre gange med Tris-bufret saltvand (TBS); montere dem på objektglas og dækglas dias med Mowiol.
- Mikroskopi af de farvede skiver
- Se de farvede skiver enten på en standard mikroskop med epifluorescens udstyr eller med en konfokal mikroskop. Tag billeder med en passende kamera. For nogle billeder vendes fluorescens kontrast for at give mørktfarvede skibe på en lys baggrund (figur 5 og 6).
5. Bestemmelse af regional kardensitet i Cultures
- Kvantificere vessel tæthed baseret på fartøjernes overfarter, som beskrevet i reference 8.
- Brug skiver farvet for laminin for disse målinger. Læg over optagede billeder af 10X forstørrelse med en 6 x 6 gitter, hvor hver tavle er lig med 100 x 100 um per kvadrat, samlet felt på 0,25 mm 2.
- Overlay tre sådanne net i CA1, CA3, GD, og EF-region (figur 2). Tæl fartøjer krydser linjerne i gitteret.
- For at opnå resultater med en god statistisk relevans, foretage målinger i mindst 3 uafhængige forsøg, der hver herunder data fra 3 museunger med 3 skiver per mus hvalp.
- Bestem den gennemsnitlige værdi af fartøjet overfarter fra nettene for hver region og udføre en statistisk analyse ved ANOVA med Bonferroni korrektion som post hoc-test (p <0,05 defineret som signifikant) ved hjælp af passende statistiske software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ilt glucosemangel og hypoxi fremkalde neuronal død og reduktion blodkar specifikt i hippocampus CA1 regionen.
OGD eller oxygen-berøvelse alene i 15 min inducerede en stærk induktion af celledød, som ses ved propidiumiodidfarvning specifikt i CA1-området i hippocampus (figur 3), som svarer som tidligere beskrevet 7. Med markører at visualisere netværk af blodkar, blev det konstateret, at blodkar tæthed og organisation at være lig kontrollen efter OGD udfordring i de fleste dele af kulturen med undtagelse af CA1-regionen. Der blodkarret densitet blev nedsat, og blodkarret net blev delvist forstyrret (figur 3, E og F). Disse ændringer blev observeret kun i det område, hvor propidiumiodidfarvning blev forøget.
Tidsforløbet for de vaskulære ændringer paralleller det neuronal degeneration.
Vi har undersøgt tidsforløbet for både neuronal degeneration og blodkar tab i CA1 ved hjælp tidspunkter på 3 timer, 24 timer og 48 timer efter iltmangel (hypoxi). Ved 3 timer efter hypoxi, var der ingen propidiumiodidfarvning synlige og der var ingen ændringer til stede i blodkarret arkitektur tyder på, at på dette tidspunkt ingen ændringer var synlige endnu (Figur 4 A og B). Ved 24 timer efter hypoxi der var udseendet af propidiumiodidfarvning indikerer progression af celledød i CA1. På dette tidspunkt netværk af blodkar allerede forstyrret og blodkar blev tabt i CA1-regionen (figur 4, C og D). Både propidiumiodidfarvning og blodkar tab blev mere udtalt ved 48 timer efter hypoxi (Figur 4, E og F).
Både neuronal død ogblodkar tab forhindres ved at blokere excitation efter OGD eller hypoxi.
Når vi kombineret OGD farmakologiske behandlinger, der forhindrede overskydende glutamatfrigivelse, var det muligt at redde neuroner fra OGD-induceret celledød. Behandling med TTX (som inhiberer virkningspotentiale generation resulterer i nedregulering af afferente terminaler) eller behandling med CNQX (som inhiberer AMPA-type glutamatreceptorer) reddet CA1 pyramideformede celler fra neuronal død (figur 5, D og F). Disse resultater indikerer, at neuronal død efter OGD medieres af excitotoksisk virkning af glutamat. Efter disse behandlinger blev ikke kun neuronal celledød forhindres, men også fartøjets integritet blev bevaret og tabet af blodkar i CA1 blev forhindret (figur 5, C og E).
AMPA behandling inducerer udbredt excitotoksisk neuronal død i hippocampus but fartøj tab er begrænset til CA1.
OGD som anvendt i denne undersøgelse inducerer neuronal død specifikt i CA1. I modsætning hertil resulterede behandling med 100 uM AMPA i 30 min induceret en udbredt neuronalt tab i hele Cornu ammonis af hippocampus (CA1 og CA3) og subiculum, men ikke i den tandede gyrus (figur 6C). Interessant nok blev blodkar tab begrænset til CA1-regionen, på trods af en tilsvarende neurontab i CA3 var der ingen blodkar tab i dette område (figur 6D). I dentatgyrus var der hverken neuronal død eller blodkar tab. Kvantificering af kardensitet bekræfter, at blodkarrene bliver tabt i CA1, men ikke i de øvrige regioner i kulturen Figur 6E.
Figur 1. Tidsplan for OGD eksponering og reperfusion. Efter 5 dages in vitro-kulturer underkastes OGD, hypoxi eller AMPA-behandling. Kulturer er fastsat efter en overlevelsestid på 3 timer, 24 timer og 48 timer.
Figur 2. Kvantificering af blodkar tæthed i forskellige regioner af entorhino-hippocampus skivekulturer. Tre 6 x 6 riste (her vist som firkanter) overlejres i CA1, CA3, GD, og EF-region. Blodkarrene krydser de indre linjer i risten blev talt for hver firkant.
Figur 3. Hypoxi behandling inducerer neuronal død og blodkar tab i CA1. (A,C, E) kontrol kulturer (B, D, F) kulturer udsat for hypoxi behandling efterfulgt af 48 timer af normoxi. Laminin immunfarvning ved lav forstørrelse i grøn (A, B), PI farvning ved højere forstørrelse i rød (C. D), fusionerede billeder til laminin og PI farvning i (E) og (F). Skalapanelerne i (B for A, B) og (F for C, D, E, F) = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Tidsforløb af vaskulære ændringer og neuronaledegeneration efter ilt afsavn (hypoxi). PI farvning i rød vist i (A, C, E), fusionerede billeder for PI-farvning og laminin (grøn) som vist i (B, D, F). Ved 3 timer efter hypoxi behandling, er der ingen PI-farvning synlig, og ingen vaskulære ændringer er indlysende (A, B). Efter fremgår 24 timers PI-farvning og blodkar tab er også indlysende (C, D). Både PI farvning og blodkar tab blevet mere synlige efter 48 timer (E, F). Målestokken i (F) = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.; Neurondødsfald og blodkar tab forhindres ved blokkere af neuronal excitation Anvendelse af enten TTX (C, D) eller CNQX (E, F) forhindrede både neurontab som set med PI farvning (B, D, F) og blodkar. tab afsløret af laminin-farvning (A, C, E). OGD alene inducerer både neurontab og tab af blodkar i CA1 (A, B). Målestokken i (F) = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Neurondødsfald og blodkar underskud efter AMPA behandling. Behandling med 100 uM AMPA i 30 min induceret udbredtneurontab i de fleste områder af hippocampus (C), men tabet af blodkar forblev begrænset til området CA1 (D). Målestokken i (D) = 100 um. Kvantificeringen af blodkar bekræfter den selektive tab i CA1-området (E). Kolonner viser det gennemsnitlige antal fartøjsejere krydsninger, fejlsøjler viser SEM. Signifikante forskelle er angivet med ** til p <0,01. Resultaterne blev afledt fra tre uafhængige forsøg med tre analyserede kulturer hver (n = 9) for hver region. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tid | Handling |
| DIV 4 | Forbered OGD eller hypoxi medie |
| DIV 4 | Perfundere OGD ellerhypoxi medium med N2 i 1 time i en hypoxi kammer og derefter forsegle og holde O / N i en inkubator ved 37 ° C |
| DIV 4 | Skift kulturerne til Neurobasal serumfrit medium + glukose fra inkuberingsmedium, give dem mulighed for at hvile O / N eller 1 dag |
| DIV 5 | Perfundere OGD mediet igen med N2 i 30 min |
| DIV 5 | Tilsæt 2 pi af en 1 mg / ml propidiumiodid (PI) opløsning per brønd (til en slutkoncentration på 2 ug / ml) til skiver i 30 minutter og kun vælge sunde udsnit til eksperimenter som indikeret ved et lavt antal af PI-positive celler |
| DIV 5 | Sug rabat på den almindelige mellemstore og tilføje OGD medium til brøndene. Sørg for, at alle væsker, der forbliver på siderne af indsatsen er suget væk, når kulturerne skiftet fra almindelig medium til OGD / hypoxi mellemlang og tilbage. Overfør pladen til hypoxi kammer |
| DIV 5 | Perfundere med N2 i 15 min i hypoxi kammer |
| DIV 5 | Fjern pladen fra kammeret. Skift tilbage til Neurobasal mellemstore og sted tilbage i befugtet inkubator med 5% CO2 |
| DIV 5 | Tilføj PI og løse 3 timer efter OGD / hypoxi i 3 timer interval |
| DIV 6 | Tilføj PI og fix 24 timer efter OGD / hypoxi i 24 timer interval |
| DIV 7 | Tilføj PI og fix 48 timer efter OGD / hypoxi i 48 timer interval |
Tabel 1. Detaljeret tid sekvens af trin til OGD / hypoxi behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de metoder, der præsenteres her, hippocampus organotypiske skive kulturer anvendes som et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade. Mens organotypiske skive kulturer er blevet anvendt i fortiden for at studere neuronale reaktioner efter iskæmi 6, 7, nyt aspekt af den samtidige undersøgelse af vaskulære ændringer forbedrer de potentielle anvendelser af denne metode. Induktionen af OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske skive kulturer og fører til en pålidelig og reproducerbar skader i nervevæv. Endvidere gør den skive kultur fremgangsmåde ikke blot at studere konsekvenserne af iskæmisk udfordring, men giver også mulighed for afprøvning af potentielle terapeutiske foranstaltninger med henblik på neuroprotektion. Slice kulturer er derfor et attraktivt og vigtigt redskab til undersøgelse af iskæmisk hjerneskade.
Metoden præsenteres her er let at implementere for alle laboratorier haVing nogle erfaringer med CNS skivekulturer. Anvendelse af OGD eller hypoxi kræver en omhyggelig ækvilibrering af dyrkningsmediet med N2 for at opnå reproducerbare resultater. Det er også vigtigt kun at bruge skivekulturer med et lavt antal PI-positive celler før påføring af OGD. Betingelserne for hypoxi (dvs. den tid, hvor hypoxi eller OGD anvendes) kan varieres og optimeres i overensstemmelse med den type skive kultur anvendes.
Mens neuronale reaktioner på iskæmi er blevet undersøgt grundigt er der kun få oplysninger om vaskulære ændringer efter hypoxisk-iskæmisk hjerneskade. Konstateringen af, at blodkar og endda markører for blodhjernebarrieren holdes i organotypiske skive kulturer i op til en uge 8, har 9 åbnet mulighed for at studere ændringer i karrene efter hypoxi udfordring i fastsættelsen af hippocampus organotypiske skive kulturer 10. Selvfølgelig er det nødvendigt atrealiseres, at de fartøjer, der vedligeholdes i skivekulturer ikke perfunderet. Desuden har vi observeret forskelle i tabet af allerede eksisterende blodkar snarere end omfattende dannelse af nye blodkar. Denne model system er derfor sandsynligvis ikke optimale for at studere nye fartøj dannelse efter en iskæmisk fornærmelse.
Muligheden for at anvende organotypiske hippocampus skivekulturer til yderligere belysning af det komplekse samspil mellem neuroner og karret åbner en ny fagområde og lover at bidrage til at opnå en bedre forståelse af og udvikle nye behandlingsmuligheder for neurovaskulære lidelser, især cerebral iskæmi efter slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 24. november 1986 (86/609 / EØF) og blev revideret og godkendt af de schweiziske myndigheder. Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af universitetet i Basel, Institut for Biomedicin, og den schweiziske National Science Foundation (31003A_141007). Markus Saxer ydet teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
