Summary
Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.
Abstract
Lesão cerebral isquêmica é uma das condições mais comuns e devastadoras que comprometem a função cerebral adequada e muitas vezes leva a persistir déficits funcionais nos pacientes afetados. Apesar dos esforços de pesquisa intensiva, ainda não existe uma opção de tratamento eficaz disponível, que reduz a lesão neuronal e protege os neurônios nas áreas isquêmicas da morte secundário atrasado. A investigação nesta área, tipicamente envolve a utilização de modelos animais e elaborados problemáticos. Culturas fatia organotípica Entorhino-hipocampal desafiados com privação de oxigênio e glicose (POG) são estabelecidos em modelos in vitro que mimetizam isquemia cerebral. O aspecto inovador deste estudo é que as alterações dos vasos sanguíneos do cérebro são estudadas, além de alterações neuronais ea reação tanto do compartimento neuronal e compartimento vascular podem ser comparados e correlacionados. Os métodos apresentados neste protocolo ampliar substancialmente as aplicações potenciais da ouabordagem da cultura fatia ganotypic. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Isto está em contraste com os experimentos em animais complexos e problemáticos induzindo acidente vascular cerebral e isquemia in vivo. Ao ampliar a análise para incluir o estudo da reação da vasculatura poderia fornecer novas maneiras de como preservar e restaurar as funções cerebrais. A abordagem da cultura fatia apresentado aqui pode se transformar em uma ferramenta atrativa e importante para o estudo da lesão isquêmica cerebral e pode ser útil para testar medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção.
Introduction
O sistema nervoso central é particularmente sensível a uma perda ou redução do fornecimento de oxigénio e glicose pela vasculatura. Mesmo um tanto curta interrupção do fornecimento de sangue para o cérebro pode induzir uma perda permanente da função das áreas cerebrais relevantes que levam às síndromes típicas tempos. Além da perda de neurônios nas áreas afetadas primários, há normalmente uma perda neuronal atraso adicional através de danos secundários. Infelizmente, até agora, nenhum tratamento neuroprotector para a redução da morte neuronal secundária estava disponível um. Os esforços de pesquisa para estudar os mecanismos de lesão secundária se baseiam na utilização de modelos animais de isquemia cerebral como a oclusão da artéria cerebral média e de várias técnicas de oclusão trombótica (para uma revisão recente ver 2). Em paralelo, também devido a limitações e preocupações éticas com o uso de modelos animais, cultura fatia organotípica de vários tecidos do sistema nervoso central têm sido utilizados que permitam o study de reações neuronais para vários tipos de lesões 3-5.
Para estudar a reacção neuronais sob condições que imitam a lesão cerebral isquémica, o sistema modelo de privação de oxigénio glicose (OGD) foi desenvolvido. Neste modelo, as culturas de fatia são temporariamente expostos a um meio que carece de glicose, tendo sido equilibrada com o gás de azoto na ausência de oxigénio. Com um tal tratamento, é possível induzir a lesão neuronal e perda, que é bastante semelhante ao observado após lesão isquémica in vivo de 6, 7. No hipocampo, um tal tratamento induz a perda neuronal em CA1 especificamente, mas não no área CA3 ou do giro dentado do hipocampo. Em contraste, o estudo de reacções vasculares em culturas de fatias até agora não tem sido amplamente realizadas. Uma razão óbvia é a falta de circulação e de vasos sanguíneos de perfusão no modelo de cultura de fatia. Contudo, mostrámos previamente que é possível manter bvasos Lood em CNS fatia culturas por vários dias 8, 9.
O objetivo geral deste método é monitorar não só o destino dos neurônios após POG, mas estender o estudo para o destino e remodelação da vasculatura que é uma parte importante da resposta a uma lesão. Até agora, os estudos têm exigido a utilização de experiências com animais (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). No protocolo apresentado aqui, vamos detalhar como tais estudos podem ser feitos em culturas fatia organotypic entorhino-hipocampal desafiou tanto a hipóxia ou por lesões excitotóxicos seguida da análise de ambos os sobrevivência e vasos sanguíneos reações neuronais. Este protocolo é baseado em um estudo publicado anteriormente sobre o assunto 10 e pode ser útil para qualquer laboratório interessado em interações neurovasculares no SNC.
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Protocol
Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram analisados e autorizados pelas autoridades suíças.
1 Configurando culturas fatia Organotípicas Entorhino-hipocampo
- Prepare entorhino-hipocampal culturas organotípicas (EHOSCs) de pós-natal filhotes dia 4 (P4) do mouse usando o método de incubação 4,11 estática. Aqui, utilizam ratinhos C57BL6 e CB6F1.
- Tome cerca de 30 min por rato filhote para a preparação de culturas fatia, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Realizar todas as etapas em condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar com instrumentos cirúrgicos esterilizados.
- A fim de evitar uma possível interferência a partir da posição do corte ao longo do eixo do septo-temporal, usar apenas o hipocampo fatias de metade do septo. Se não for indicado de outra forma, realizar todos os passos à temperatura ambiente.
- Corte tele cabeça de um filhote de cachorro P4 rato com uma tesoura cirúrgica. Sem anestesia é necessário para este passo.
- Remover o crânio em volta do cérebro e identificar a fenda entre a extremidade caudal dos hemisférios cerebrais e mesencéfalo. Cuidadosamente remover a parte do cérebro para rostral do mesencéfalo do crânio e colocá-lo no meio de preparação de gelado consistindo em MEM suplementado com uma forma estabilizada de L-glutamina.
- Continue a dissecção sob microscópio estereoscópico com o cérebro estar imerso no gelo médio preparação frio. Remover meninges remanescentes dos hemisférios corticais. Identificar o hipocampo na superfície caudal medial do hemisfério e separá-lo em conjunto com o córtex entorrinal adjacente do resto do cérebro.
- Transferir o tecido de um cortador de tecido e cortado 400 um de espessura, sob condições assépticas, transversal ao eixo septo-temporal do hipocampo.
- Coloque as fatias sobre ceinserções de cultura II (aproximadamente 6 fatias por pastilha) e incubar em placas de 6 poços com 1 ml por poço de meio de incubação (47 ml de MEM, 25 ml de Meio Eagle, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml I glutamax, 1 ml de uma solução estéril de glicose a 10%, pH 7,3) numa atmosfera húmida com 5% de CO 2, a 37 ° C. Troca da mídia no dia seguinte e, em seguida, a cada dois dias até uma semana.
2 In Vitro hipóxia e oxigênio-glicose Privação com reperfusão
- Ver Tabela 1 para um horário exato momento do procedimento. EHOSCs de cultura para 5 dias (DIV5) antes da exposição a hipoxia ou POG. Neste ponto de tempo mudar a forma de meio de incubação contendo 25% de soro de cavalo para meio isento de soro, com a seguinte composição: meio Neurobasal com suplemento B27 a 2%, 1% de glucose e glutamax adicional de 0,1%.
- Preparar o meio OGD como detalhado em 7 de referência .As concentrações finais dos componentes é a seguinte: 0,3mM de CaCl2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM de NaHCO3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM de MgSO4 e 10 mM de sacarose a pH 6.8. Adicionar 1 ml de meio a cada poço OGD de duas placas de cultura de tecidos de 6 poços.
- Perfundir a forma OGD com N 2 durante 1 hora, em uma câmara de hipoxia e, em seguida, vedar e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C.
- Use tiras de anaeróbios como indicadores de hipóxia. Considere o meio estar livre de oxigénio quando a cor das tiras mudou de rosa para branco.
- Para a indução da hipóxia, utilizar meio isento de soro com glucose, em vez de meio de OGD. Antes da utilização, o meio de perfundir com N 2, em uma câmara de hipoxia como descrito acima para o meio de OGD.
- Antes de as fatias são expostas a OGD, perfundir a forma OGD novamente com N 2 durante 30 min. Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionarapenas fatias saudáveis para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI.
- Utilizar o modelo de exposição OGD e reperfusão indicado na Figura 1. Privar fatias de oxigénio ou apenas (hipoxia) ou de oxigénio e glicose (POG), durante 15 min.
- Para a indução de hipoxia ou OGD, transferir as fatias em forma OGD e manter por 15 minutos em câmara de hipóxia. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para OGD médio e para trás.
- Após a hipoxia ou OGD, substituir o meio de OGD com meio isento de soro e oxigenado culturas são deixados a recuperar durante 3, 24 ou 48 horas em meio isento de soro na incubadora normal a 37 ° C com 5% de CO 2. Adicionar PI novamente antes da fixação para a determinação da morte celular.
3. tratamentos farmacológicos de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia
- Culture EHOSCs durante 5 dias (DIV5) em meio de incubação antes de exposição a tratamentos farmacológicos. Iniciar os tratamentos farmacológicos ou durante ou imediatamente após a OGD OGD quando fatias são transferidas para meio isento de soro.
- Tratamentos para proteção contra POG.
- Adicionar 100 | iM 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) ou 1 uM a tetrodotoxina (TTX) ao meio de cultura durante a indução OGD (durante 15 min) ou imediatamente após a indução OGD durante 30 min. Em seguida, incuba-se meio isento de soro durante 48 horas normóxica antes da fixação.
- Os tratamentos para a indução da morte excitotóxica.
- Após 5 dias de incubação em culturas de meio interruptor para meio isento de soro contendo 100 uM (RS) -α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA), durante 30 min.
- Retire o meio de cultura contendo AMPA por aspiração (ter o cuidado de remover qualquer meio residual em inserções), em seguida, transferir as fatias para placas novas com acesso médio e soro normalmantê-los por 48 horas, até a fixação.
4. Fixação e Imunocoloração de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia
- O iodeto de propídio (PI) a coloração.
- Adicionar PI durante 30 min para o meio de cultura de fatias de vida, a uma concentração de 2 ug / ml. Ver culturas vivas com um microscópio invertido equipado com óptica de fluorescência e selecione fatias para mais tratamentos. Para a coloração de PI em combinação com imuno-histoquímica, adicionar solução de PI 30 min antes da fixação das culturas.
- A fixação das fatias.
- Remover o meio de cultura da placa de 6 poços e adicionar 3 ml de preparado de fresco a 4% de paraformaldeído (PFA) a cada poço. Em seguida, colocar a placa de 6 cavidades em uma geladeira e fixar O / N a 4 ° C.
- Remover a solução de PFA no dia seguinte e as fatias de lavar 3-4 vezes com tampão fosfato salino (PBS).
- A remoção das fatias a partir da cultura de células insert e procedimento de bloqueio para imuno-histoquímica de secções de livre flutuação.
- Retirar cuidadosamente e retire as fatias das inserções de cultura utilizando uma arte pincel do tamanho 0 ou menor. Transferir cada faixa individual num poço de uma placa de 96 poços preenchidos com tampão de bloqueio (PBS com 3% de soro de cabra normal (NGS) e 2% de Triton-X100). Manter as fatias em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação constante por um agitador orbital.
- A imunocoloração das culturas de fatias
- Para a marcação dos vasos sanguíneos usar policlonal anti-laminina a uma diluição de 1: 200 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100.
- Para os neurónios rotulagem utilizar anti-microtúbulo associado proteína 2 (MAP2), a uma diluição de 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100.
- Incubar as fatias com anticorpos primários durante 48 horas a 4 ° C com agitação constante. Após o período de incubação, lavá-las em PBS com 0,5% Triton-X100 em 3-4 vezes. Dilui-se anticorpos secundários 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. Incubar as fatias durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro, com os anticorpos secundários conjugados com Alexa fluoróforo. Use de cabra anti-coelho adequado ou anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com Alexa 350 ou 488.
- Remover a solução de anticorpo secundário e lava-se as fatias de três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); montá-los em lâminas de vidro e lamela as lâminas com Mowiol.
- Microscopia das fatias coradas
- Ver as fatias manchadas ou em um microscópio padrão com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal. Tire fotos com uma câmera apropriada. Para algumas imagens, inverter o contraste de fluorescência, a fim de produzir vasos com uma coloração escura sobre um fundo claro (Figuras 5 e 6).
5 Determinação da densidade de vasos Regional nas culturas
- Quantificar o vessel com base na densidade de vasos passagens como descrito na Referência 8.
- Use fatias manchadas para laminina para essas medições. Sobreponha as imagens gravadas de aumento de 10x com uma grade 6 x 6, onde cada grade é igual a 100 x 100 mm por metro quadrado, área total de 0,25 milímetros 2.
- Sobreposição três dessas redes na região CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Conte as embarcações que cruzam as linhas do grid.
- Para a obtenção de resultados com uma boa relevância estatística, fazer medições em pelo menos três experiências independentes, cada uma das quais os dados a partir de 3 filhotes de rato com três fatias por ratinho filhote.
- Determine o valor médio das passagens de navio da grades para cada região e realizar uma análise estatística por ANOVA com correção de Bonferroni como post hoc teste (p <0,05 considerada significativa), utilizando software estatístico adequado.
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Representative Results
Oxygen privação de glicose e hipóxia induzir a morte neuronal e redução dos vasos sanguíneos, especificamente na região CA1 do hipocampo.
OGD ou privação de oxigénio e durante 15 min, sozinho induziu uma forte indução de morte celular como observado por coloração com iodeto de propídio, especificamente na área CA1 do hipocampo (Figura 3), semelhante ao descrito anteriormente 7. Com marcadores para visualizar a rede de vasos sanguíneos, verificou-se que a densidade dos vasos sanguíneos e organização parece ser similar à do controlo após desafio OGD na maioria das partes da cultura com a excepção da região CA1. Há a densidade dos vasos sanguíneos foi diminuída e a rede de vasos sanguíneos foi parcialmente interrompido (Figura 3, E e F). Estas alterações ocorreram apenas na área onde a coloração com iodeto de propídio foi aumentada.
O decurso de tempo das alterações vasculares paralelo ao da neurdegeneração onal.
Temos estudado o curso de tempo de ambos degeneração e perda de sangue navio neuronal em CA1 usando pontos de tempo em 3 horas, 24 horas e 48 horas após a privação de oxigénio (hipoxia). Em 3 horas após a hipóxia, não houve iodeto de propídio a coloração visível e não houve mudanças presentes na arquitectura do vaso sanguíneo, indicando que neste momento não há mudanças ainda eram visíveis (Figura 4, A e B). Aos 24 hr pós hipoxia houve aparecimento de iodeto de propídio que indica a coloração de progressão de morte celular em CA1. Neste ponto de tempo da rede de vasos sanguíneos que já foi perturbado e vasos sanguíneos foram perdidos na região CA1 (Figura 4, C e D). Ambos, coloração com iodeto de propídio e a perda de vasos sanguíneos tornou-se mais pronunciado a 48 hr pós hipoxia (Figura 4, E e F).
Tanto a morte neuronal eperda de vasos sanguíneos são impedidos, por bloqueio de excitação após OGD ou hipoxia.
Quando combinado com tratamentos farmacológicos OGD que impediram o excesso de libertação de glutamato, foi possível salvar neurónios da morte celular induzida por OGD. O tratamento com TTX (que inibe a acção de geração potencial resultando no silenciamento de terminais aferentes) ou tratamento com CNQX (que inibem os receptores de glutamato do tipo AMPA) células piramidais de CA1 resgatados da morte neuronal (Figura 5, D e F). Estes resultados indicam que a morte neuronal após POG é mediada pela acção excitotóxica de glutamato. Após estes tratamentos, não apenas a morte das células neuronais foi impedido, mas também a integridade do vaso foi preservada e a perda de vasos sanguíneos em CA1 foi impedido (Figura 5, C e E).
AMPA tratamento induz a morte neuronal excitotoxic generalizada nas bu hipocampoperda de t navio está restrita a CA1.
OGD, como utilizado no presente estudo induz especificamente a morte neuronal em CA1. Em contraste, o tratamento com 100 uM durante 30 min AMPA induzida uma perda neuronal generalizada em todo o cornu Ammonis do hipocampo (CA1 e CA3) e o subiculum, mas não no giro dentado (Figura 6C). Curiosamente, a perda de vasos sanguíneos foi confinada à região CA1, apesar de uma perda neuronal no CA3 semelhante não houve perda de vasos sanguíneos na região (Figura 6D). No giro denteado não havia nem a morte, nem vaso sanguíneo perda neuronal. A quantificação da densidade de vasos confirma que os vasos sanguíneos são perdidos em CA1, mas não em outras regiões de cultura Figura 6E.
Figura 1 Horário da exposição POG e reperfusion. Após 5 dias em culturas in vitro são sujeitos a OGD, a hipoxia ou tratamento de AMPA. Culturas são fixadas depois de um tempo de sobrevivência de 3 horas, 24 horas e 48 horas.
Figura 2 Quantificação da densidade de vasos sanguíneos em diferentes regiões das culturas fatia entorhino-hipocampal. Três 6 x 6 grids (aqui mostrados como quadrados) são sobrepostas na região CA1, CA3, DG e CE. Os vasos sanguíneos que atravessam as linhas internas da grade foram contadas para cada quadrado.
Figura tratamento 3. hipóxia induz a morte neuronal e perda de vasos sanguíneos em CA1. (A,C, E) culturas de controle, (B, D, F) culturas submetidas a tratamento hipóxia seguido de 48 horas de normóxia. Imunomarcação Laminin com pequeno aumento em verde (A, B), coloração PI em maior ampliação em vermelho (C. D), fundiu imagens para laminina e PI coloração em (E) e (F). Barras de escala em (B para A, B) e (F para C, D, E, F) = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Claro Tempo de alterações vasculares e neuronaldegeneração após a privação de oxigénio (hipoxia). coloração PI é mostrada na (A, C, E) vermelho, fundiu imagens para PI coloração e laminina (verde) mostrado em (B, D, F). Em 3 horas após o tratamento de hipóxia, não existe coloração PI visível e não há alterações vasculares são evidentes (A, B). Após 24 horas de coloração PI emerge e perda de vasos sanguíneos também é evidente (C, D). Ambos coloração PI e perda de vasos sanguíneos tornam-se mais evidente após 48 horas (E, F). Barra de escala em (F) = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5.; Morte neuronal e perda de vasos sanguíneos são impedidos, por bloqueadores de excitação neuronal aplicação de qualquer TTX (C, D) ou CNQX (E, F), preveniu quer a perda neuronal tal como observado com a coloração de PI (B, D, F) e dos vasos sanguíneos. perda revelado pela coloração com laminina (A, C, E). OGD sozinho induz tanto a perda neuronal e perda de vasos sanguíneos em CA1 (A, B). Barra de escala em (F) = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 morte neuronal e perda do vaso sanguíneo após tratamentos de AMPA. Tratamento com 100 uM durante 30 min AMPA induzida generalizadaperda neuronal na maioria das áreas do hipocampo (C), mas a perda de vasos sanguíneos permaneceu restrito à área CA1 (D). A barra de escala em (D) = 100 pm. A quantificação de vasos sanguíneos confirma a perda selectiva na área CA1 (E). As colunas mostram o número médio de passagens de navio, barras de erro mostram o SEM. As diferenças significativas estão indicadas com ** para p <0,01. Os resultados foram obtidos a partir de três experimentos independentes com três culturas analisadas cada (n = 9) para cada região. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo | Ação |
| DIV 4 | Prepare POG ou médio hipóxia |
| DIV 4 | Perfundir o POG oumeio hipoxia com N 2 durante 1 hora numa câmara e, em seguida, vedar hipoxia e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C |
| DIV 4 | Alterne as culturas para meio livre de soro Neurobasal + glicose do meio de incubação, que lhes permita descansar O / N ou um dia |
| DIV 5 | Perfundir a forma OGD novamente com N 2 durante 30 min |
| DIV 5 | Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionar apenas as fatias saudáveis para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI |
| DIV 5 | Chupam a forma regular e adicionar meio de OGD aos poços. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para meio POG / hipóxia e para trás. Transferir a placa para a câmara de hipóxia |
| DIV 5 | Perfundir com N 2 durante 15 minutos na câmara de hipóxia |
| DIV 5 | Retire a placa da câmara. Volte para o meio Neurobasal e coloque de volta na incubadora umidificada com 5% de CO 2 |
| DIV 5 | Adicionar PI e corrigir 3 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 3 horas |
| DIV 6 | Adicionar PI e corrigir 24 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 24 horas |
| DIV 7 | Adicionar PI e corrigir 48 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 48 horas |
Tabela 1 hora sequência detalhada das etapas de tratamento POG / hipóxia.
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Discussion
Com os métodos aqui apresentados, hipocampo culturas organotípicas de fatias pode ser utilizado como uma ferramenta versátil para estudar alterações plásticas no tecido neural após a lesão. Enquanto as culturas organotípicas de fatias tenha sido utilizado no passado para o estudo de reacções neuronais após isquemia 6, 7, o novo aspecto do estudo simultâneo de alterações vasculares aumenta significativamente as aplicações potenciais do presente método. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Além disso, a abordagem da cultura fatia permite não apenas estudar as consequências do desafio isquêmico, mas também permite o teste de medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção. Culturas de fatias, por conseguinte, são uma ferramenta atraente e importante para o estudo da lesão cerebral isquémica.
O método aqui apresentado é de fácil implementação para todos os laboratórios haVing alguma experiência com o SNC fatia culturas. Aplicando a OGD ou hipoxia requer um equilíbrio cuidadoso do meio de cultura com N 2, a fim de obter resultados reprodutíveis. É também importante a utilização apenas culturas de fatias com um baixo número de células PI-positivas antes da aplicação de OGD. As condições de hipoxia (isto é, o tempo para que a hipoxia ou POG é aplicada) pode ser variada e optimizada de acordo com o tipo de fatia de cultura utilizado.
Enquanto as reações neuronais à isquemia têm sido estudados extensivamente só existe pouca informação disponível sobre alterações vasculares após a lesão cerebral hipóxico-isquêmica. A constatação de que os vasos sanguíneos e até mesmo marcadores da barreira hemato-encefálica são mantidos em culturas fatia organotypic por até uma semana 8, 9, abriu a oportunidade de estudar as alterações da vasculatura após o desafio hipóxia na definição de culturas fatia do hipocampo organotypic 10. É claro que ele deveter em conta que os navios que são mantidos em culturas fatia não são perfundidos. Além disso, observou-se diferenças na perda de vasos sanguíneos pré-existente ao invés de extensa formação de novos vasos sanguíneos. Este modelo de sistema é, por conseguinte, provavelmente não é óptimo para estudar a formação de novos vasos após um insulto isquémico.
A possibilidade de utilizar culturas organotípicas do hipocampo para a elucidação da complexa interação entre os neurônios e vasculatura abre um novo campo de estudo e promete ajudar a conseguir uma melhor compreensão e desenvolvimento de novas opções de tratamento para distúrbios neurovasculares, em particular após a isquemia cerebral acidente vascular cerebral.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609 / CEE) e foram analisados e autorizados pelas autoridades suíças. Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, ea National Science Foundation suíço (31003A_141007). Markus Saxer prestou apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
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