Summary
En protokoll for entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer, som lar reprodusere mange aspekter av iskemisk hjerneskade, blir presentert. Ved å studere forandringer i neurovasculature i tillegg til endringer i neuroner, er denne protokollen et allsidig verktøy for å studere forandringer i plast neural vev etter skade.
Abstract
Iskemisk hjerneskade er blant de vanligste og ødeleggende forhold kompromitterende riktig hjernens funksjon og ofte fører til vedvarende funksjonelle underskudd i de berørte pasientene. Til tross for intensiv forskningsinnsats, er det fortsatt ingen effektiv behandling alternativet tilgjengelig som reduserer nerveskader og beskytter nevroner i de iskemiske områder fra forsinket sekundær død. Forskning på dette området innebærer vanligvis bruk av forseggjorte og problematiske dyremodeller. Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer utfordret med oksygen og glukose deprivasjon (OGD) er etablert in vitro modeller som etterligner cerebral iskemi. Det nye aspekt ved denne studien er at endringer av hjerneblodårer blir undersøkt i tillegg til neuronal endringer og reaksjonen av både den neuronale rommet og vaskulær rommet kan sammenlignes og korreleres. Metodene som presenteres i denne protokollen vesentlig utvide de potensielle anvendelser av ellerganotypic skive kultur tilnærming. Induksjonen av OGD eller hypoksi alene kan påføres med ganske enkle midler i organotypic skive kulturer og fører til pålitelig og reproduserbar skade på nervevevet. Dette står i sterk kontrast til de kompliserte og problematiske dyreforsøk som induserer slag og iskemi in vivo. Ved å utvide analyse å inneholde studiet av reaksjonen av vaskulaturen kan gi nye måter å opprettholde og gjenopprette hjernefunksjoner. Stykket kultur tilnærming som presenteres her kan utvikle seg til en attraktiv og viktig verktøy for studiet av iskemisk hjerneskade og kan være nyttig for å teste potensielle terapeutiske tiltak rettet mot nevro.
Introduction
Det sentrale nervesystem er spesielt følsomme for tap eller reduksjon av oksygen og glukose tilførsel av vaskulaturen. Selv en relativt kort avbrudd av blodtilførsel til hjernen, kan indusere et permanent tap av funksjon av de relevante områder av hjernen som fører til de typiske slagsyndromer. I tillegg til den neuronale tap i primær berørte områdene, er det vanligvis mer forsinket neuronal tap gjennom sekundære skader. Dessverre finnes det inntil nå ikke neurobeskyttende behandling for reduksjon av sekundær neuronal død var tilgjengelig en. Forskningsinnsats for å studere mekanismene for sekundære skader stole på bruk av dyremodeller av cerebral iskemi som midten cerebral arterie okklusjon og ulike trombotisk okklusjon teknikker (for en fersk gjennomgang se 2). Parallelt, også på grunn av begrensninger og etiske problemer med bruk av dyremodeller, organotypic skive kultur av forskjellige CNS-vev har blitt brukt som tillater study nevrale reaksjoner på ulike type skader 3-5.
For å studere den neuronale reaksjonen under betingelser som etterligner iskemisk hjerneskade, har modellsystem av oksygen glukosemangel (OGD) blitt utviklet. I denne modellen blir skive kulturer midlertidig utsettes for et medium som mangler glukose og har blitt ekvilibrert med nitrogengass i fravær av oksygen. Med en slik behandling, er det mulig å indusere neuronal skade og tap som er ganske lik den som ble observert etter iskemisk skade in vivo 6, 7. I hippocampus, induserer en slik behandling nevronale tap spesielt i CA1, men ikke i CA3 området eller dentate gyrus av hippocampus. I kontrast, studiet av vaskulære reaksjoner i skive kulturer så langt ikke har vært mye foretatt. En åpenbar årsak er mangelen på sirkulasjon og blodårer perfusjon i stykket kulturmodell. Vi har imidlertid tidligere vist at det er mulig å opprettholde bLood fartøy i CNS skjære kulturer i flere dager 8, 9.
Det overordnede målet med denne metoden er å ikke bare overvåke skjebnen til nevroner etter OGD men utvide studien til skjebnen og ombygging av blodkar som er en viktig del av skaden respons. Inntil nå slike studier har krevd bruk av dyreforsøk (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). I protokollen som presenteres her, vi vil detalj hvordan slike studier kan gjøres i entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer utfordret enten med hypoksi eller ved eksitotoksiske lesjoner etterfulgt av analyse av begge nevronale overlevelse og blodkar reaksjoner. Denne protokollen er basert på en tidligere publisert studie på dette emnet 10, og kan være nyttig for en hvilken som helst laboratorium interessert i nevrovaskulære interaksjoner i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble utført i samsvar med europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 22. september-2010 (2010/63 / EU), og ble anmeldt og tillatt av sveitsiske myndigheter.
1. Sette opp organotypic Entorhino-hippocampus skive kulturer
- Forbered entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer (EHOSCs) fra postnatal dag 4 (P4) museunger ved hjelp av statisk inkubasjon metoden 4,11. Her bruker C57Bl6 og CB6F1 mus.
- Ta ca 30 min per mus valp for utarbeidelse av skive kulturer, dvs. 3 timer for et kull på seks museunger. Utføre alle trinnene under sterile betingelser i en laminær strømningsbenk med steriliserte kirurgiske instrumenter.
- For å unngå en mulig forstyrrelse fra stillingen stykket langs Septo-temporal akse, bruker bare hippocampus skiver av septal halvdel. Hvis ikke annet er angitt, å utføre alle trinn ved RT.
- Avskåret than leder for en P4 mus valp med kirurgiske saks. Ingen anestesi er nødvendig for dette trinn.
- Fjern skallen rundt hjernen og identifisere sprekken mellom hale slutten av hjernehemisfærene og midthjernen. Fjern forsiktig den delen av hjernen rostral til midthjernen fra skallen og legg den i iskaldt forberedelse medium bestående av MEM supplert med en stabilisert form av L-glutamin.
- Fortsett disseksjon under et stereomikroskop med hjernen å være midt i det iskalde forberedelse medium. Fjern gjenværende hjernehinnene fra hjernebark halvkuler. Identifiser hippocampus på den mediale kaudale overflate av halvkulen og separer den sammen med den tilstøtende entorhinal cortex fra resten av hjernen.
- Overfør vevet til en vev chopper og kutte 400 mikrometer tykke skiver under aseptiske betingelser transversal til Septo-temporale aksen av hippocampus.
- Plasser stykker på cell kultur innsatser (ca. 6 stykker pr sett) og inkuber dem i 6-brønns plater med 1 ml per brønn av inkubasjonsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml hesteserum, 1 ml glutamax I, 1 ml av en steril 10% glukoseoppløsning, pH 7,3) i en fuktet atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Endre medium neste dag og deretter annenhver dag opp til en uke.
2. In Vitro Hypoksi og Oxygen-glukose deprivasjon med Reperfusjon
- Se tabell 1 for en eksakt tidsplan av prosedyren. Kultur EHOSCs for 5 dager (DIV5) før eksponering for hypoksi eller OGD. Ved dette tidspunkt bryter mediet fra inkuberingsmediet inneholdt 25% hesteserum til serumfritt medium med den følgende sammensetning: Neurobasal medium med 2% B27 supplement, 1% glutamax og ytterligere 0,1% glukose.
- Klargjør OGD medium som beskrevet i Reference 7 .De endelige konsentrasjoner av komponentene vil være følgende: 0.3mM CaCl 2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4, og 10 mM sukrose ved pH 6,8. Tilsett 1 ml av OGD medium til hver brønn av to seks-brønns vevskulturplater.
- Perfuse den OGD medium med N2 i 1 time i en hypoksi kammer og deretter forsegle og holde O / N i en inkubator ved 37 ° C.
- Bruk anaerobe strimler som hypoksiske indikatorer. Tenk på medium til å være oksygenfritt når fargen på stripene endret fra rosa til hvitt.
- For induksjon av hypoksi, bruker serumfritt medium med glukose i stedet for OGD medium. Før bruk, perfuse mediet med N 2 i en hypoksi kammer som beskrevet ovenfor for OGD medium.
- Før skivene er utsatt for OGD, perfuse den OGD mediet igjen med N2 i 30 min. Tilsett 2 pl av en 1 mg / ml propidium jodid (PI)-løsning per brønn (for en endelig konsentrasjon på 2 ug / ml) til de skiver i 30 min og velgerbare sunne skiver for eksperimentering som indikert av lavt antall PI positive celler.
- Bruke planleggings av OGD eksponering og reperfusjon indikert i figur 1. Frata skiver av enten oksygen bare (hypoksi) eller oksygen og glukose (OGD) for 15 min.
- For induksjon av hypoksi eller OGD, overføre skivene i OGD medium og holde i 15 min i hypoksi kammeret. Påse at alle væsker som forblir på sidene av innsatsen er aspirert bort når kulturer er byttet fra vanlig medium til OGD medium og tilbake.
- Etter hypoksi eller OGD, erstatte OGD medium med oksygenrikt serumfritt medium, og kulturene har lov til å komme seg i 3, 24 eller 48 timer i serumfritt medium i det faste inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Legg PI igjen før fiksering for bestemmelse av celledød.
3. farmakologisk behandling av Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer
- Culture EHOSCs for 5 dager (DIV5) i inkuberingsmediet før eksponering for farmakologisk behandling. Begynn farmakologisk behandling enten under OGD eller umiddelbart etter OGD når skiver overføres til serumfritt medium.
- Behandlinger for beskyttelse mot OGD.
- Tilsett 100 mM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dion (CNQX) eller 1 uM tetrodotoxin (TTX) til kulturmediet i løpet av OGD induksjon (i 15 min), eller straks etter 30 min etter OGD induksjon. Deretter inkuberes i normoksiske serumfritt medium i 48 timer før fiksering.
- Behandlinger for induksjon av eksitotoksisk død.
- Etter 5 dager i inkuberingsmediet bryter kulturer til serumfritt medium inneholdende 100 uM (RS) -α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre (AMPA) i 30 min.
- Fjern kultur medium som inneholder AMPA ved aspirasjon (ta vare å fjerne eventuelle rester av medium på inserts), deretter overføre skivene til ferske plater med normal serumfritt medium ogholde dem i 48 timer før fiksering.
4. Fiksering og Immunostaining av Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer
- Propidium jodid (PI) farging.
- Legg PI i 30 min til kulturmediet av levende skiver ved en konsentrasjon på 2 pg / ml. Se live kulturer med en invertert mikroskop utstyrt med fluorescens optikk og velg skiver for videre behandling. For PI farging i kombinasjon med immunhistokjemi, tilsett PI-løsning 30 min forut for fiksering av kulturene.
- Fiksering av skivene.
- Fjern kulturmediet fra 6-brønns plate og tilsett 3 ml nylaget 4% paraformaldehyd (PFA) til hver brønn. Deretter plasserer seks-brønns plate i et kjøleskap og fikse O / N ved 4 ° C.
- Fjern PFA løsning påfølgende dag og vaske skivene 3-4 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjerning av skivene fra cellekultur insert og blokkerer prosedyre for immunhistokjemi av frittflytende seksjoner.
- Forsiktig løsne og fjerne skivene fra kulturinnsatser ved hjelp av en art pensel i størrelse 0 eller mindre. Overfør hver enkelt skive i en brønn av en 96 brønns plate som er fylt med blokkeringsbuffer (PBS med 3% normalt geitserum (NGS) og 2% Triton-X100). Hold skivene i den blokkerende buffer i 2 timer ved RT under konstant omrøring ved en orbital shaker.
- Farging av skive kulturer
- For merking blodkar bruke polyklonale anti-laminin ved en fortynning på 1: 200 i PBS inneholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100.
- For merking av neuroner bruke anti-mikrotubuli assosiert protein 2 (MAP2) ved en fortynning på 1: 500 i PBS inneholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100.
- Inkuber skiver med primære antistoffer i 48 timer ved 4 ° C med konstant omrøring. Etter inkubasjonsperioden, vaske dem i PBS med 0,5% Triton-X100 i 3-4 ganger. Fortynn sekundære antistoffer 1: 500 i PBS inneholdende 1% NGS og 0,5% Triton-X100. Inkuber skiver i 2 timer ved RT i mørket med Alexa fluoroforen konjugerte sekundære antistoffer. Bruk riktig geite-anti-kanin eller geit-anti-mus-sekundært antistoff konjugert til Alexa 350 eller 488..
- Fjern det sekundære antistoff-oppløsning og vaske skivene tre ganger med Tris-bufret saltvann (TBS); montere dem på glassplater og dekk lysbildene med Mowiol.
- Mikroskopi av de fargede skiver
- Vis de fargede skiver enten på en standard mikroskop med epifluorescence utstyr eller med en konfokal mikroskop. Ta bilder med et passende kamera. For enkelte bilder, invertere fluorescens kontrast for å gi mørkfargede fartøy på en lys bakgrunn (figurene 5 og 6).
5. Fastsettelse av Regional Vessel Kulturens tetthet
- Kvantifisere Vessel tetthet basert på fartøyets overganger som er beskrevet i referanse 8..
- Bruk skiver farget for laminin for disse målingene. Legg over registrerte bilder av 10X forstørrelse med en 6 x 6 rutenett, der hver rute er lik 100 x 100 mikrometer pr kvadrat, totalfeltet på 0,25 mm 2.
- Overlay tre slike tavler i CA1, CA3, DG og EF-regionen (figur 2). Count skipene krysser linjene i rutenettet.
- For å få resultater med en god statistisk relevans, foreta målinger i minst tre uavhengige eksperimenter, hver inkludert data fra 3 muse unger med tre skiver per mus valp.
- Bestem den gjennomsnittlige verdien av fartøyet overganger fra nett for hver region og utføre en statistisk analyse av ANOVA med Bonferroni korreksjon som post hoc test (p <0,05 definert som signifikant) ved hjelp av egnet statistikk programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oksygen glukosemangel og hypoxia forårsake neuronal død og redusert blodkar spesielt i hippocampus CA1 regionen.
OGD eller oksygenmangel alene i 15 min induserte en sterk induksjon av celledød som sett av propidium jodid farging spesielt i CA1 området av hippocampus (Figur 3) tilsvarende som beskrevet tidligere 7.. Med markører for å visualisere nettverket av blodårer, ble det funnet at blodkartettheten og organisasjon først på lik kontroll OGD etter utfordring i de fleste deler av kulturen med unntak av CA1 regionen. Det blodkartettheten ble redusert og blodkarnettet ble delvis avbrutt (figur 3, E og F). Disse endringene ble bare sett i området der propidium iodide farging ble økt.
Tidsforløpet av de vaskulære endringer paralleller at av NEURonal degenerasjon.
Vi har studert tidsforløpet for både neuronal degenerasjon og blodkar tap i CA1 ved hjelp tidspunkter på 3 timer, 24 timer og 48 timer etter at oksygenmangel (hypoksi). Ved 3 timers etter hypoksi, var det ingen propidium jodid flekker synlige, og det var ingen endringer som er tilstede i blodkaret arkitektur som indikerer at på dette tidspunkt ingen endringer var synlige, men (figur 4, A og B). Ved 24-timers post hypoksi var der utseendet av propidium-jodid flekker som indikerer progresjon av celledød i CA1. På dette tidspunkt nettverket av blodårer ble allerede forstyrret og blodkar ble tapt i CA1-regionen (figur 4, C og D). Begge, propidium jodid farging og blodkar tapet ble mer uttalt i 48 timer etter hypoksi (figur 4, E og F).
Både neuronal død ogblodåre tap er forhindret ved å blokkere eksitasjon etter OGD eller hypoksi.
Når vi kombinert OGD med farmakologisk behandling som hindret overflødig glutamat utgivelsen, var det mulig å redde nerveceller fra OGD-indusert celledød. Behandling med TTX (som inhiberer aksjonspotensialet generasjon resulterer i stanse av afferente terminaler) eller behandling med CNQX (som inhiberer AMPA-type glutamat-reseptorer) reddet pyramidale CA1 celler fra neuronal død (figur 5, D og F). Disse resultatene indikerer at neuronal død etter OGD er mediert av eksitotoksiske virkningen av glutamat. Etter disse behandlinger, ble ikke bare neuronal celledød hindres, men også fartøyet integritet ble bevart, og tapet av blodårer i CA1 ble forhindret (figur 5, C og E).
AMPA behandling induserer utbredt eksitoksiske nerve død i hippocampus but tap av fartøyet er begrenset til CA1.
OGD som anvendt i denne studien induserer neuronal død spesifikt i CA1. I kontrast, behandling med 100 uM AMPA i 30 min indusert en utbredt nevronale tap i det hele ove ammonis av hippocampus (CA1 og CA3) og subiculum men ikke i den dentate gyrus (figur 6C). Interessant nok var tapet blodkar begrenset til CA1 regionen, til tross for en lignende nevronale tap i CA3 var det ingen blodkar tap i denne regionen (figur 6D). I dentate gyrus var det verken neuronal død eller blodkar tap. Kvantifisering av fartøy tetthet bekrefter at blodårene går tapt i CA1, men ikke i de andre regionene i kulturen Figur 6E.
Figur 1. Oversikt over OGD eksponering og reperfusion. etter 5 dager in vitro kulturer blir utsatt for OGD, hypoksi eller AMPA-behandling. Kulturer blir fast etter en overlevelsestiden på 3 timer, 24 timer og 48 timer.
Figur 2. Kvantifisering av blodkar tetthet i ulike regioner av entorhino-hippocampus skive kulturer. Three 6 x 6 nett (her vist som firkanter) er kledde i CA1, CA3, DG og EF-regionen. Blodårene som krysser de interne linjene i rutenettet ble talt for hver rute.
Figur 3. Hypoksi behandling induserer neuronal død og blodkar tap i CA1. (A,C, E) kontrollkulturer, (B, D, F) kulturer kastes hypoksi behandling etterfulgt av 48 timer av normoksiske. Laminin farging ved lav forstørrelse i grønt (A, B), PI farging ved høyere forstørrelse i rødt (C. D), fusjonerte bilder for laminin og PI flekker i (E) og (F). Scale barer i (B for A, B) og (F for C, D, E, F) = 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tid løpet av vaskulære endringer og nevronaledegenerasjon etter oksygenmangel (hypoksi). PI flekker i rødt vist i (A, C, E), fusjonerte bilder for PI farging og laminin (grønn) vist i (B, D, F). Ved 3 timers etterbehandling hypoksi, er det ingen PI flekker synlig og ingen vaskulære endringer er innlysende (A, B). Etter 24 timers PI flekker dukker opp og tap blodkar er også tydelig (C, D). Både PI farging og blodkar tapet blir mer tydelig etter 48 timer (E, F). Scale bar i (F) = 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5., Neuronal død og blodkar tapet blir forhindret ved blokkering av neuronal eksitasjon Anvendelse av enten TTX (C, D) eller CNQX (E, F) forhindret både nevronale tap som sett med PI-farging (B, D, F) og blodkar. tap åpenbart av laminin farging (A, C, E). OGD alene induserer både nevronale tap og tap av blodårer i CA1 (A, B). Scale bar i (F) = 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Neuronal død og blodkar tap etter AMPA behandling. Behandling med 100 uM AMPA i 30 min indusert utbredtneuronal tap i de fleste områder av hippocampus (C), men tapet av blodkar forble begrenset til området CA1 (D). Skala bar i (D) = 100 mikrometer. Kvantifiseringen av blodkar bekrefter den selektive tap i CA1-området (E). Søylene viser gjennomsnittlig antall fartøy kryssinger, feilfelt som viser SEM. Signifikante forskjeller er markert med ** for p <0,01. Resultatene ble avledet fra tre uavhengige eksperimenter med tre analyserte kulturer hver (n = 9) for hver region. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tid | Handling |
| DIV 4 | Forbered OGD eller hypoksi medium |
| DIV 4 | Perfuse den OGD ellerhypoksi medium med N2 i 1 time i en hypoksi kammer og deretter forsegle og holde O / N i en inkubator ved 37 ° C |
| DIV 4 | Bryter kulturene til Neurobasal serumfritt medium + glukose fra inkuberingsmediet, tillate dem å hvile O / N eller 1 dag |
| DIV 5 | Perfuse den OGD mediet igjen med N2 i 30 min |
| DIV 5 | Tilsett 2 pl av en 1 mg / ml propidium jodid (PI)-løsning per brønn (for en endelig konsentrasjon på 2 ug / ml) til de skiver i 30 min og velger kun friske skiver for eksperimentering som indikert ved lave antall av pi-positive celler |
| DIV 5 | Suge av den vanlige medium og tilsett OGD medium til brønnene. Påse at alle væsker som forblir på sidene av innsatsen er aspirert bort når kulturer er byttet fra vanlig medium til OGD / hypoksi medium og tilbake. Overfør platen til hypoksi kammeret |
| DIV 5 | Perfuse med N2 i 15 min i hypoksi kammeret |
| DIV 5 | Fjern plate fra kammeret. Bytt tilbake til Neurobasal medium og plassere tilbake i fuktet inkubator med 5% CO 2 |
| DIV 5 | Legg PI og fikse 3t etter OGD / hypoksi i 3 timer intervall |
| DIV 6 | Legg PI og fikse 24 timer etter OGD / hypoksi for 24-timers intervall |
| DIV 7 | Legg PI og fikse 48 timer etter OGD / hypoksi i 48 timer intervall |
Tabell 1. Detaljert tidssekvens av trinn for OGD / hypoksi behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de fremgangsmåter som er presentert her, kan hippocampus organotypic skive kulturer anvendes som en allsidig verktøy for å studere forandringer i plast neural vev etter skade. Mens organotypic skive kulturer har blitt brukt tidligere for å studere nevrale reaksjoner etter iskemi 6, 7 den nye aspekt av den samtidige studie av vaskulære endringer vesentlig bedre de potensielle anvendelser av denne metoden. Induksjonen av OGD eller hypoksi alene kan påføres med ganske enkle midler i organotypic skive kulturer og fører til pålitelig og reproduserbar skade på nervevevet. Videre gir skive kultur tilnærmingen ikke bare studere konsekvensene av iskemisk utfordring, men også gir mulighet for testing av potensielle terapeutiske tiltak rettet mot nevro. Skive kulturer derfor er en attraktiv og viktig verktøy for studiet av iskemisk hjerneskade.
Metoden som presenteres her er enkel å implementere for alle laboratorier hektartreråvare litt erfaring med CNS skive kulturer. Anvendelse av den OGD eller hypoksi krever en nøye ekvilibrering av kulturmediet med N 2 for å oppnå reproduserbare resultater. Det er også viktig å bare bruke skive kulturer med et lavt antall PI-positive celler før påføring av OGD. Betingelsene for hypoksi (dvs. den tid som hypoksi eller OGD anvendes) kan varieres og optimaliseres i henhold til den type skive kultur brukes.
Mens nevrale reaksjoner på iskemi har blitt studert er det bare lite informasjon tilgjengelig om vaskulære forandringer etter hypoksisk-iskemisk hjerneskade. Oppdagelsen av at blodårene og til og med markører i blod-hjerne barrieren er opprettholdt i organotypic skive kulturer i opptil en uke 8, har ni åpnet muligheten til å studere endringer i blodkar etter hypoksi utfordring i innstillingen av hippocampus organotypic skive kulturer 10. Selvfølgelig det er behov for åvære klar over at fartøyene som blir vedlikeholdt i skive kulturer ikke er perfundert. Videre har vi observert forskjeller i tap av pre-eksisterende blodkar i stedet for omfattende dannelse av nye blodkar. Dette modellsystem er derfor sannsynligvis ikke optimal for å studere nytt fartøy dannelse etter en ischemisk skade.
Muligheten til å bruke organotypic hippocampus skive kulturer for den videre klarlegging av det komplekse samspillet mellom nevroner og blodkar åpner en ny fagfelt og lover å hjelpe oppnå en bedre forståelse av og utvikling av nye behandlingstilbud for nevrovaskulære lidelser, spesielt cerebral iskemi etter hjerneslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dyreforsøk ble utført i samsvar med europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24. november 1986 (86/609 / EEC) og ble anmeldt og tillatt av sveitsiske myndigheter. Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Universitetet i Basel, Institutt for biomedisin, og den sveitsiske National Science Foundation (31003A_141007). Markus Saxer gitt teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
