Summary
Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.
Abstract
Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.
Introduction
Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war 1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe 2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen 3-5.
Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo 6, 7 beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage 8, 9.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema 10 und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen.
1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen
- Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen.
- Nehmen Sie etwa 30 min pro Maus Welpen zur Herstellung von Schnittkulturen, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Welpen Maus. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumenten.
- Um eine mögliche Störung von der Position der Scheibe entlang der Zeitachse-septo zu vermeiden, nur Hippocampus des medialen Hälfte. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Schritte bei RT.
- Abgeschnitten ter Kopf eines P4 Maus Welpe mit chirurgischer Schere. Keine Betäubung für diesen Schritt erforderlich.
- Entfernen Sie den Schädel rund um das Gehirn und Identifizierung der Riss zwischen dem kaudalen Ende der Großhirnhemisphären und des Mittelhirns. Den Teil des Gehirns, rostral sorgfältig zu entfernen, um das Mittelhirn aus dem Schädel und legen Sie sie in eiskaltem Präparationsmedium, bestehend aus MEM mit einer stabilisierten Form von L-Glutamin.
- Fahren Sie mit der Präparation unter einem Stereomikroskop mit dem Gehirn in der eiskalten Herstellungsmedium eingetaucht. Entfernen Sie verbleibende Hirnhäute aus den kortikalen Hemisphären. Identifizierung der Hippocampus auf der medialen Schwanzfläche der Halbkugel und trennen sie zusammen mit dem benachbarten entorhinalen Kortex vom Rest des Gehirns.
- Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer Gewebe Chopper und geschnitten 400 um dicke Scheiben unter aseptischen Bedingungen quer zur septo-zeitliche Achse des Hippocampus.
- Legen Sie die Scheiben auf cell Kultureinsätzen (ca. 6 Scheiben pro Platte) und inkubieren sie in 6-Well-Platten mit 1 ml pro Vertiefung Inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle-Medium, 25 ml Pferdeserum, 1 ml Glutamax I, 1 ml einer sterile 10% Glucose-Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C aufweist. Ändern Sie den nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag bis zu 1 Woche das Medium.
2. In-vitro-Hypoxie und Sauerstoff-Glukose-Entzug mit Reperfusion
- Siehe Tabelle 1 für eine genaue Zeitplan des Verfahrens. Kultur EHOSCs für 5 Tage (DIV5) vor der Einwirkung von Hypoxie oder OGD. Zu diesem Zeitpunkt schaltet das Medium vom Inkubationsmedium, enthaltend 25% Pferdeserum-freiem Medium mit der folgenden Zusammensetzung Serum: Neurobasalmedium mit 2% B27 Supplement, 1% Glutamax und zusätzlich 0,1% Glucose.
- Bereiten Sie die OGD Medium wie in Referenz 7 .Der endgültigen Konzentrationen der Komponenten detailliert beschrieben wird, die folgenden: 0.3mM CaCl 2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 und 10 mM Saccharose bei pH 6,8. 1 ml der OGD Medium zu jeder Vertiefung von zwei 6-Well-Gewebekulturplatten.
- Versorgen die OGD-Medium mit N 2 für 1 Stunde in einem Hypoxie Kammer und dann versiegeln und zu halten O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C.
- Verwenden anaeroben Streifen als hypoxischen Indikatoren. Betrachten des Mediums, um sauerstofffrei sein, wenn die Farbe der Streifen geändert von rosa bis weiß.
- Für die Induktion von Hypoxie, verwenden Serum-freiem Medium mit Glukose statt OGD Medium. Vor der Verwendung zur Perfusion des Mediums mit N 2 in einer Hypoxie Kammer wie oben für OGD Medium beschrieben.
- Bevor die Scheiben auf OGD ausgesetzt ist, versorgen die OGD Medium wieder mit N 2 für 30 min. Add 2 ul einer 1 mg / ml Propidiumiodid (PI)-Lösung pro Vertiefung (bei einer Endkonzentration von 2 ug / ml) mit den Scheiben für 30 min und wählennur gesunde Scheiben für Experimente wie die geringen Zahlen der PI-positiven Zellen angegeben.
- Verwenden Sie den Zeitplan für die OGD-Exposition und Reperfusion in Abbildung 1 angegeben. Berauben Scheiben entweder Sauerstoff nur (Hypoxie) oder Sauerstoff und Glukose (OGD) für 15 min.
- Für die Induktion der Hypoxie oder OGD, übertragen Scheiben in OGD Medium und halten Sie für 15 Minuten in der Kammer Hypoxie. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes bleiben weg abgesaugt wenn die Kulturen von normalen Medium OGD Medium und zurück geschaltet.
- Nach Hypoxie oder OGD, ersetzen Sie die OGD Medium mit sauerstoff Serum-freiem Medium und Kulturen dürfen für 3, 24 oder 48 Stunden in Serum-freiem Medium in der regulären Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu erholen. PI hinzuzufügen wieder vor der Fixierung für die Bestimmung von Zelltod.
3. pharmakologische Behandlungen von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen
- CulturE EHOSCs für 5 Tage (DIV5) in Inkubationsmedium vor der Belichtung mit pharmakologischen Behandlungen. Starten pharmakologische Behandlungen entweder während oder unmittelbar nach der OGD OGD, wenn Scheiben, um Serum freien Medium übertragen.
- Behandlungen zum Schutz vor OGD.
- Mit 100 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) und 1 uM Tetrodotoxin (TTX) zu dem Kulturmedium während der Induktions OGD (für 15 min) oder unmittelbar nach OGD Induktion für 30 min. Dann, Inkubation in normoxischen Serum freien Medium für 48 Stunden vor der Fixierung.
- Behandlungen für die Induktion von exzitotoxische Tod.
- Nach 5 Tagen in Inkubationsmedium Schalter Kulturen freien Medium, das 100 um (RS) -α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) 30 min Serum.
- Entfernen Sie das Kulturmedium mit AMPA durch Aspiration (Vorsicht, um restliche Medium, auf Einsätze zu entfernen), dann übertragen Sie die Scheiben auf frische Platten mit normalen Serum-freiem Medium undhalten sie für 48 Stunden, bis Fixierung.
4. Fixierung und Immunfärbung von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen
- Propidiumiodid (PI)-Färbung.
- Hinzufügen PI für 30 min in das Kulturmedium von lebenden Scheiben in einer Konzentration von 2 ug / ml. Live-View-Kulturen, die mit einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-Optik ausgestattet und wählen Scheiben für weitere Behandlungen. Für eine PI-Färbung in Kombination mit Immunhistochemie, fügen PI-Lösung 30 min vor der Fixierung der Kulturen.
- Fixierung der Scheiben.
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 6-Well-Platte und 3 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung. Dann legen Sie die 6-Well-Platte in einem Kühlschrank und fixieren O / N bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die PFA-Lösung am nächsten Tag und waschen die Scheiben 3-4 mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Entfernen der Scheiben aus dem Zellkultur insert und Blockierverfahren für die Immunhistochemie von frei schwebenden Abschnitte.
- Vorsichtig lösen und entfernen Sie die Scheiben von den Kulturplatten mit Hilfe eines Kunst Pinsel der Größe 0 oder kleiner. Übertragen jedes einzelne Stück in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit Blockierungspuffer (PBS mit 3% normalem Ziegenserum (NGS) und 2% Triton-X100) gefüllt. Halten der Scheiben in Blockierungspuffer für 2 h bei RT unter ständigem Rühren mit einem Orbitalschüttler.
- Immunfärbung der Schnittkulturen
- Für die Markierung der Blutgefäße verwenden polyklonalen Anti-Laminin in einer Verdünnung von 1: 200 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100.
- Zur Markierung Neuronen verwenden anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2) in einer Verdünnung von 1: 500 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100.
- Die Scheiben mit primären Antikörpern für 48 Stunden Inkubieren bei 4 ° C unter konstantem Rühren. Nach der Inkubationszeit, waschen Sie sie in PBS mit 0,5% Triton-X100 für 3-4 mal. Verdünnte sekundäre Antikörper 1: 500 in PBS, 1% NGS und 0,5% Triton-X100. Bebrüten die Scheiben für 2 h bei RT im Dunkeln mit den Alexa Fluorophor konjugiert Sekundärantikörper. Verwenden Sie die entsprechende Ziege-Anti-Kaninchen-oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa 350 oder 488 konjugiert.
- Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen die Scheiben dreimal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS); montieren sie auf Glasobjektträger und Deckglas die Folien mit Mowiol.
- Mikroskopie der gefärbten Scheiben
- Informieren Sie sich über die gefärbten Scheiben entweder auf einem Standardmikroskop mit Epifluoreszenz Ausrüstung oder mit einem konfokalen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit einer geeigneten Kamera. Für einige Bilder, invertieren die Fluoreszenzkontrast, um dunkel gefärbte Gefäße auf einem hellen Hintergrund zu erhalten (5 und 6).
5. Bestimmung der regionalen Gefäßdichte in den Kulturen
- Quantifizierung der vessel Dichte basierend auf Schiff Gänge wie im Referenz 8 beschrieben.
- Verwenden Scheiben für Laminin für diese Messungen gefärbt. Lagern aufgezeichneten Bilder der 10-facher Vergrößerung mit einem 6 x 6 Raster, wobei jedes Gitter gleich 100 x 100 um pro Quadratmeter, Gesamtfeld von 0,25 mm 2 ist.
- Overlay drei solcher Netze in der CA1-Region, CA3, DG, und EG (Abbildung 2). Zählen Sie die Schiffe überqueren die Linien des Gitters.
- Für den Erhalt einer guten Ergebnisse mit statistischer Relevanz, machen Messungen in mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils Daten von drei Welpen Maus mit 3 Scheiben pro Maus Welpen.
- Bestimmen Sie den Mittelwert des Schiffes Übergänge von den Gittern für jede Region und führen eine statistische Analyse durch ANOVA mit Bonferroni-Korrektur als Post-hoc-Test (p <0,05 definiert als signifikant) mit entsprechenden Statistik-Software.
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Representative Results
Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region.
OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschien ähnlich zu der Steuerung nach OGD Herausforderung in den meisten Teilen der Kultur mit der Ausnahme der Region CA1. Es wurde der Blutgefäßdichte verringert und die Blutgefäßnetzwerk wurde teilweise aufgebrochen (3, E und F). Diese Änderungen wurden nur in dem Bereich, wo die Propidiumiodid-Färbung erhöht wurde gesehen.
Der zeitliche Verlauf der Gefäßveränderungen parallel zu der von nehmeronal Degeneration.
Wir haben den zeitlichen Verlauf sowohl der neuronalen Degeneration und Gefäßverlust in CA1 mit Zeitpunkten bei 3 h, 24 h und 48 h nach der Sauerstoffmangel (Hypoxie) untersucht. Bei 3 h nach der Hypoxie, es gab keine Propidiumiodidfärbung sichtbar und es gab keine Veränderungen in der Blutgefäß-Architektur vorhanden darauf hinweist, dass in dieser Zeit keine Veränderungen sichtbar waren noch (Abbildung 4, A und B). 24 Stunden nach der Hypoxie war Erscheinungsbild Propidiumiodid-Färbung, die die Progression des Zelltodes in CA1. Zu diesem Zeitpunkt das Netz der Blutgefäße wurde bereits gestört und der Blutgefäße wurden in der CA1-Region (Abbildung 4, C und D) verloren. Sowohl Propidiumiodid-Färbung und Gefäßverlust verstärkte sich nach 48 h nach der Hypoxie (4, E und F).
Beide neuronalen Tod undBlutgefäß Verlust durch Blockierung Anregung nach OGD oder Hypoxie verhindert.
Wenn wir in Verbindung mit OGD pharmakologische Behandlungen, die überschüssige Glutamatfreisetzung verhindert wird, war es möglich, Neuronen aus OGD-induzierten Zelltod zu retten. Behandlung mit TTX oder die Behandlung mit CNQX (die AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren hemmt) gerettet CA1-Pyramidenzellen von neuronalen Tod (Abbildung 5, D und F) (die Aktionspotentialerzeugung, was zur Inaktivierung des zuführenden Anschlüssen hemmt). Diese Ergebnisse zeigen, dass neuronale Tod nach OGD wird durch exzitotoxische Wirkung von Glutamat vermittelt. Nach diesen Behandlungen wurde nicht nur neuronale Zelltod verhindert, sondern auch die Behälterintegrität bewahrt wurde und der Verlust von Blutgefäßen in CA1 verhindert wurde (Figur 5, C und E).
AMPA-Behandlung induziert verbreitet exzitotoxische neuronalen Tod in den Hippocampus but Schiff Verlust wird auf CA1 beschränkt.
OGD in dieser Studie verwendeten neuronalen Tod induziert spezifisch in CA1. Dagegen führte die Behandlung mit 100 uM AMPA für 30 Minuten führte zu einer weit verbreiteten Neuronenverlust im gesamten Ammonshorn des Hippocampus (CA1 und CA3) und dem subiculum aber nicht im Gyrus dentatus (6C). Interessanterweise Blutgefß Verlust in der Region CA1 beschränkt, trotz ähnlicher Verlust von Neuronen in CA3 es kein Blutgefäß Verlust in diesem Bereich (Figur 6D). Im Gyrus dentatus es weder neuronalen Tod noch Blutgefß Verlust. Die Quantifizierung der Gefäßdichte bestätigt, dass Blutgefäße in CA1 verloren, aber nicht in den anderen Bereichen der Kultur 6E.
Abbildung 1. Spielplan der OGD-Exposition und reperfusion. Nach 5 Tagen in vitro Kulturen werden auf OGD, Hypoxie oder AMPA-Behandlung unterzogen. Die Kulturen werden nach einer Überlebenszeit von 3 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden festgelegt.
Abbildung 2. Quantifizierung der Blutgefäßdichte in den verschiedenen Regionen der entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen. Three 6 x 6 Raster (hier als Quadrate dargestellt) sind in der CA1-Region, CA3, DG, EG und überlagert. Die Blutgefäße, die die Binnen Linien des Gitters wurden für jeden Quadratmeter gezählt.
Abbildung 3. Hypoxie Behandlung induziert neuronalen Tod und Gefäßverlust in CA1. (A,C, E) Kontrollkulturen (B, D, F) Kulturen von Hypoxie-Behandlung, gefolgt von 48 h Normoxie unterworfen. Laminin-Immunfärbung bei geringer Vergrößerung in grün (A, B), PI-Färbung bei höherer Vergrößerung in rot (C D) fusioniert Bilder für Laminin und PI-Färbung in (E) und (F). Maßstabsbalken in (B für A, B) und (F für C, D, E, F) = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Zeitlicher Verlauf der Gefäßveränderungen und neuronalenDegeneration nach Sauerstoffmangel (Hypoxie). PI-Färbung in Rot in (A, C, E) gezeigt, verschmolzen Bilder für PI-Färbung und Laminin (grün) in (B, D, F) gezeigt. Nach 3 h nach der Hypoxie Behandlung gibt es keine PI-Färbung sichtbar und keine vaskulären Veränderungen sind offensichtlich (A, B). Nach 24 Stunden PI-Färbung entsteht und Gefäßverlust ist auch offensichtlich, (C, D). Sowohl PI-Färbung und der Blutgefäße Verlust werden nach 48 h (E, F) deutlicher. Balken in (F) = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5.; Neuronalen Tod und Gefäßverlust durch Blocker der neuronalen Erregung verhindert Anwendung entweder TTX (C, D) oder CNQX (E, F) verhindert sowohl neuronale Verlust mit PI-Färbung (B, D, F) und das Blutgefäß zu sehen. Verlust von Laminin-Färbung (A, C, E) ergab. OGD allein induziert sowohl Neuronenverlust und den Verlust von Blutgefäßen in CA1 (A, B). Balken in (F) = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. neuronalen Tod und Gefäßverlust nach AMPA-Behandlung. Behandlung mit 100 uM AMPA für 30 min induziert weit verbreitetNeuronenverlust in den meisten Bereichen des Hippocampus (C), aber der Verlust von Blutgefäßen weiterhin eingeschränkt, um der CA1 (D). Balken in (D) = 100 um. Die Quantifizierung von Blutgefäßen bestätigt den selektiven Verlust in der CA1-Bereich (E). Säulen zeigen die mittlere Anzahl der Behälter Kreuzungen, Fehlerbalken, die die SEM. Signifikante Unterschiede sind mit ** für p <0,01 angegeben. Die Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten mit drei Kulturen analysiert abgeleitet jeder (n = 9) für jede Region. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zeit | Aktion |
| DIV 4 | Bereiten OGD oder Hypoxie Medium |
| DIV 4 | Versorgen die OGD oderHypoxie-Medium mit N 2 für 1 h in einem Hypoxie Kammer und dann abzudichten und zu halten O / N in einem Inkubator bei 37 ° C |
| DIV 4 | Schalten Sie die Kulturen Neurobasal Serum freien Medium + Glucose aus Inkubationsmedium, damit sie O / N oder 1 Tag ruhen |
| DIV 5 | Versorgen die OGD Medium wieder mit N 2 für 30 min |
| DIV 5 | Add 2 ul einer 1 mg / ml Propidiumiodid (PI)-Lösung pro Vertiefung (bei einer Endkonzentration von 2 ug / ml) mit den Scheiben für 30 min und wählen nur gesunde Scheiben für Experimente durch geringe Zahl der PI-positiven Zellen angegeben |
| DIV 5 | Abzusaugen regelmäßigen Medium und fügen OGD Medium in die Vertiefungen. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes bleiben weg abgesaugt wenn die Kulturen von normalen Medium OGD / Hypoxie Medium geschaltet und zurück. Übertragen Sie die Platte an der Hypoxie Kammer |
| DIV 5 | Perfusion mit N 2 für 15 min in die Kammer Hypoxie |
| DIV 5 | Entfernen Platte von der Kammer. Wechseln Sie zurück zu Neurobasalmedium und legen wieder befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 |
| DIV 5 | Fügen PI und fixieren 3 h nach OGD / Hypoxie 3 Stunden Intervall |
| DIV 6 | Fügen PI und beheben 24 h nach OGD / Hypoxie für 24 Stunden-Intervall |
| DIV 7 | Fügen PI und beheben 48 h nach OGD / Hypoxie für 48 Stunden-Intervall |
Tabelle 1. Detaillierte zeitliche Abfolge von Schritten zur OGD / Hypoxie-Behandlung.
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Discussion
Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie 6, 7 der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Weiterhin ermöglicht die Schnittkultur Ansatz nicht nur die Untersuchung der Folgen eines ischämischen Herausforderung, sondern ermöglicht die Prüfung der potentiellen therapeutischen Maßnahmen bei der Neuroprotektion gerichtet. Schnittkulturen daher eine attraktive und wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von ischämischer Hirnverletzung.
Die hier vorgestellte Methode ist einfach zu implementieren für alle Labore haVing einige Erfahrung mit ZNS-Schnittkulturen. Aufbringen der OGD oder Hypoxie erfordert eine sorgfältige Gleichgewicht des Kulturmediums mit N 2, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Es ist auch wichtig, nur den Einsatz Scheibe Kulturen mit einer geringen Anzahl von PI-positive Zellen vor der Anwendung der OGD. Die Bedingungen der Hypoxie (dh die Zeit, während der Hypoxie oder OGD angewendet werden) variiert und entsprechend der Art der Schnittkultur optimiert werden.
Während neuronale Reaktionen auf Ischämie untersucht ausgiebig gibt es nur wenige Informationen über Gefäßveränderungen nach hypoxisch-ischämischen Hirnverletzung. Der Befund, dass die Blutgefäße und sogar Marker der Blut-Hirn-Schranke in organotypischen Schnittkulturen gepflegt für bis zu einer Woche 8, 9 hat die Möglichkeit, Änderungen des Gefäßsystems nach Hypoxie Herausforderung in der Einstellung des Hippocampus organotypischen Kulturen studieren 10 eröffnet. Natürlich muss eserkannte, dass die Schiffe, die in Schnittkulturen gehalten werden, sind nicht durchblutet werden. Darüber hinaus haben wir Unterschiede in der Verlust von bereits bestehenden Blutgefäßen lieber als umfangreiche Bildung von neuen Blutgefäßen beobachtet. Dieses Modellsystem ist daher wahrscheinlich nicht optimal für die nach einem ischämischen Insult Untersuchung neuer Gefäßbildung.
Die Möglichkeit, organotypischen hippokampalen Schnittkulturen für die weitere Aufklärung der komplexen Interaktion zwischen Nervenzellen zu verwenden und das Gefäßsystem öffnet sich ein neues Forschungsgebiet und verspricht zu helfen, ein besseres Verständnis für und die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für neurovaskuläre Erkrankungen, insbesondere nach zerebraler Ischämie Schlaganfall.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) durchgeführt und wurden von Schweizer Behörden überprüft und zugelassen. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin, und dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_141007) unterstützt. Markus Saxer leistete technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
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