Summary
פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.
Abstract
פגיעה המוחית איסכמי היא בין המצבים השכיחים וההרסניים ביותר להתפשר תפקוד מוח תקין, ולעתים קרובות מובילה למתמידים ליקויים תפקודיים בחולים שנפגעו. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, עדיין אין אפשרות טיפול יעילה זמינה המפחיתה את פגיעה עצבית ומגנה על תאי עצב באזורי איסכמי ממוות שני מעוכב. מחקר בתחום זה בדרך כלל כרוך בשימוש במודלים של בעלי חיים מורכבים ובעייתיים. תרבויות הפרוסה organotypic Entorhino-היפוקמפוס תיגר עם חמצן וקיפוח גלוקוז (OGD) הוקמו במודלים חוץ גופית המחקים איסכמיה מוחית. ההיבט החדשני של מחקר זה הוא ששינויים של כלי דם במוח נלמדים בנוסף לשינויים עצביים ואת התגובה של שניהם תא העצבי וכלי דם התא ניתן להשוות ומתואם. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה באופן משמעותי להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של אוגישת התרבות הפרוסה ganotypic. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. זאת בניגוד מוחלט לניסויים בבעלי החיים מסובכים ובעייתיים גרימת שבץ ואיסכמיה in vivo. על ידי הרחבת הניתוח לכולל את חקר התגובה של כלי הדם יכול לספק דרכים חדשות על איך לשמר ולשחזר תפקודי מוח. גישת התרבות הפרוסה המוצגת כאן עשויה להתפתח לכלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי ועשויה להיות שימושי לבדיקת אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית היא רגישה במיוחד לאובדן או הפחתה של חמצן ואספקת הגלוקוז על ידי מערכת כלי הדם. אפילו הפרעה קצרה ולא של אספקת דם למוח יכולה לגרום לאובדן קבוע של תפקוד של אזורי המוח הרלוונטיים מובילים לתסמונות שבץ טיפוסיות. בנוסף לאובדן העצבי באזורים שנפגעו העיקריים, יש בדרך כלל הוא אובדן עצבי המאוחר נוסף באמצעות נזק המשני. לרוע המזל עד עכשיו, אין טיפול נוירו להפחתת מוות עצבי המשני היה זמין 1. מאמצי מחקר לחקר המנגנונים של נזק משני מסתמכים על השימוש במודלים של בעלי החיים של איסכמיה המוחית כמו עורקים התיכון ספיגה מוחין וטכניקות שונות טרומבוטיים חסימה (לסקירה האחרונה לראות 2). במקביל, גם בשל מגבלות וחששות אתיים עם השימוש במודלים של בעלי חיים, התרבות הפרוסה organotypic של רקמות CNS השונות היה בשימוש המאפשר סטהdy של תגובות עצביות לסוג שונים של פציעות 3-5.
ללימוד התגובה העצבית בתנאים המחקים פגיעה מוחית איסכמי, מערכת המודל של חסך גלוקוז החמצן (OGD) פותחה. במודל זה, תרבויות פרוסה באופן זמני נחשפו למדיום שחסר גלוקוז וכבר equilibrated עם גז חנקן בהיעדר החמצן. עם טיפול כזה, ניתן לגרום לפגיעה עצבית ואובדן שהוא די דומה לזה שנצפה לאחר פגיעת איסכמית in vivo 6, 7. בהיפוקמפוס, טיפול כזה גורם לאיבוד עצבי במיוחד בCA1, אך לא ב אזור CA3 או gyrus המשונן של ההיפוקמפוס. בניגוד לכך, המחקר של תגובות של כלי דם בתרבויות פרוסה עד כה לא בוצע באופן נרחב. סיבה ברורה היא חוסר זרימת הדם וזלוף כלי דם במודל התרבות הפרוסה. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן לשמור בכלי lood במערכת העצבים המרכזית פורסים תרבויות במשך כמה ימים 8, 9.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לפקח לא רק את גורלם של תאי עצב לאחר OGD אבל להאריך את המחקר לגורל והשיפוץ של כלי הדם שהוא חלק חשוב מהתגובה לפציעה. עד כה מחקרים כאלה דורשים השימוש בניסויים בבעלי חיים (דה יונג et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). בפרוטוקול מובא כאן, אנו פירוט כיצד ניתן לעשות מחקרים כאלה בתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס תיגר גם עם היפוקסיה או על ידי נגעי הפעלת יתר רעילים ואחריו ניתוח של שתי תגובות הישרדות וכלי דם עצביות. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר שפורסם בעבר בנושא זה 10 ויכול להיות שימושי עבור כל מעבדה מתעניינת באינטראקציות עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 22 ספטמבר 2010 (2010/63 / איחוד אירופי) ונסקרו והתיר על ידי הרשויות שוויצרית.
.1 הגדרת תרבויות פרוסה Organotypic Entorhino-היפוקמפוס
- הכן תרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס (EHOSCs) מגורי 4 עכבר היום (P4) לאחר לידה באמצעות 4,11 שיטת הדגירה סטטי. כאן, להשתמש בעכברי C57BL6 וCB6F1.
- קח כ 30 דקות לכל גור עכבר להכנת תרבויות פרוסה, כלומר, 3 שעות להמלטה של 6 גורי עכבר. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים בזרימה שולחן עבודה מינרית עם מכשירי ניתוח עיקור.
- על מנת להימנע מהפרעות אפשריות מהעמדה של הפרוסה לאורך ציר septo-זמני, להשתמש רק בהיפוקמפוס פרוסות של חצי במחיצה. אם לא צוין אחרת, לבצע את כל הצעדים על RT.
- חותך את tהוא בראש של גור עכבר P4 עם מספריים כירורגיות. אין הרדמה נדרשת לצעד זה.
- הסר את הגולגולת סביב המוח ולזהות את הסדק שבין סוף הזנב של אונות המוח והמוח התיכון. מוציא בזהירות את החלק ממקורי המוח אל המוח התיכון, מהגולגולת ולמקם אותו במדיום הכנה קר כקרח בהיקף של MEM השלים עם טופס התייצב של L-גלוטמין.
- המשך לנתיחה תחת סטראו עם המוח להיות שקוע בבינוני הכנה קרה כקרח. הסר קרומי המוח שנותר מההמיספרות בקליפת המוח. זהה את ההיפוקמפוס במשטח הזנב המדיאלי של האונה ולהפריד אותו יחד עם קליפת entorhinal הסמוכה משאר המוח.
- העברת הרקמה לרקמת מסוק ולחתוך 400 מיקרומטר פרוסות עבות תחת רוחבי תנאי ספטית לציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס.
- מניחים את הפרוסות על ceהתרבות מוסיף ll (כ 6 פרוסות לכל הכנס) ו דגירתם ב6 צלחות גם עם 1 מ"ל לכל טוב של מדיום דגירה (47 מ"ל MEM, 25 מ"ל נשר בינוני, 25 מ"ל סרום סוס, 1 מ"ל Glutamax אני, 1 מ"ל של פתרון סטרילי 10% גלוקוז, pH 7.3) באווירת humidified עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן בכל יום אחר שלשבוע 1.
.2 במבחנה היפוקסיה והחמצן גלוקוז מניעת עם reperfusion
- ראה טבלת מס '1 ללוח זמנים מדויקים של ההליך. EHOSCs תרבות במשך 5 ימים (DIV5) לפני החשיפה להיפוקסיה או OGD. בנקודה זו בזמן לעבור בינוני ממדיום דגירה המכיל 25% בסרום סוס סרום בינוני חינם עם ההרכב הבא: בינוני Neurobasal עם 2% תוסף B27, Glutamax 1% וגלוקוז 0.1% נוספים.
- הכן את מדיום OGD כמפורט ב7 .the ריכוזים סופיים של רכיבי הפניה יהיה הבא: 0.3מ"מ CaCl 2, 70 mM NaCl, 5.25 מ"מ NaHCO 3, 70 מ"מ KCl, 1.25 סוכרוז מ"מ לאא 2 PO 4, 2 מ"מ MgSO 4, ו10 מ"מ בpH 6.8. הוסף 1 מ"ל של מדיום OGD היטב כל אחד משני לוחות תרבית רקמה 6 היטב.
- Perfuse בינוני OGD עם N 2 עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס.
- השתמש ברצועות אנאירובי כאינדיקטורים חוסר חמצן. קחו למשל את המדיום להיות חמצן חופשי כאשר את הצבע של הרצועות השתנה מורוד ללבן.
- לאינדוקציה של היפוקסיה, להשתמש בינוני סרום ללא עם גלוקוז במקום בינוני OGD. לפני השימוש, תנקב בינוני עם N 2 בתא היפוקסיה, כמפורט לעיל למדיום OGD.
- לפני פרוסות נחשפות לOGD, תנקב בינוני OGD שוב עם N 2 למשך 30 דקות. הוסף 2 μl של 1 מ"ג / מ"ל propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחררק פרוסות בריאים לניסויים כפי שצוינו על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן.
- השתמש בלוח הזמנים של חשיפת OGD וreperfusion מצויינים באיור 1. לשלול פרוסות או חמצן בלבד (היפוקסיה) או חמצן וגלוקוז (OGD) במשך 15 דקות.
- לאינדוקציה של היפוקסיה או OGD, להעביר פרוסות לתוך מדיום OGD ולשמור במשך 15 דקות בתא היפוקסיה. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD ובחזרה.
- לאחר היפוקסיה או OGD, להחליף את מדיום OGD עם מדיום סרום ללא מחומצן ותרבויות מותר להתאושש במשך 3, 24 או 48 שעות במדיום סרום ללא בחממה הרגילה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. להוסיף PI שוב לפני קיבוע לקביעת המוות של תאים.
3 טיפולים תרופתיים של תרבויות Organotypic Slice Entorhino-היפוקמפוס
- CulturEHOSCs דואר במשך 5 ימים (DIV5) במדיום דגירה לפני החשיפה לטיפולים תרופתיים. התחל טיפולים תרופתיים או במהלך OGD או מייד לאחר OGD כאשר פרוסות מועברות למדיום חופשי בסרום.
- טיפולים להגנה מפני OGD.
- הוסף 100 מיקרומטר 6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-דיונה (CNQX) או tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) למדיום התרבות במהלך האינדוקציה OGD (ל15 דקות) או מייד אחרי גיוס OGD ל30 דקות. ואז, דגירה במדיום סרום ללא normoxic ל48 שעות לפני הקיבוע.
- טיפולים לזירוז מות הפעלת יתר רעיל.
- לאחר 5 ימים בתרבויות מתג בינוני דגירה לסרום מדיום חופשי המכיל 100 מיקרומטר (RS) -α-אמינו-3-הידרוקסי 5-methyl-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) למשך 30 דקות.
- הסר את מדיום התרבות המכיל AMPA על ידי שאיפה (דואג להסיר כל מדיום שיורית על מוסיף), ולאחר מכן להעביר את הפרוסות לצלחות טריות עם מדיום סרום נורמלי חופשי ולשמור אותם ל48 שעות עד קיבעון.
.4 תרבויות Organotypic Slice קיבוע וImmunostaining של Entorhino-היפוקמפוס
- יודיד Propidium מכתים (PI).
- להוסיף PI ל30 דקות למדיום התרבות של פרוסות המתגוררות בריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל. צפה תרבויות לחיות עם מיקרוסקופ הפוך מצויד באופטיקה הקרינה ובחר פרוסות לטיפולים נוספים. עבור מכתים PI בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, להוסיף פתרון PI 30 דקות לפני הקיבוע של התרבויות.
- קיבוע של הפרוסות.
- הסר את מדיום התרבות מצלחת 6 היטב ולהוסיף 3 מ"ל של paraformaldehyde מוכן טרי 4% (PFA) זה טוב. לאחר מכן למקם את צלחת 6 היטב במקרר ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את פתרון PFA ביום שלמחרת ולשטוף את הפרוסות 3-4 פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
- הסרת פרוסות מi תרבית תאיםnsert והליך חסימת אימונוהיסטוכימיה סעיפים ריחוף ללא.
- לנתק בזהירות ולהסיר את הפרוסות מהתרבות מוסיף באמצעות מברשת צבע אמנות של הגודל 0 או קטנים יותר. העבר את כל פרוסה בודדת לתוך באר של צלחת גם 96 מלאות בחסימת מאגר (PBS עם 3% בסרום נורמלי עז (NGS) ו -2% Triton-X100). שמור את הפרוסות במאגר החסימה לשעה 2 ב RT תחת תסיסה המתמדת של שייקר מסלולית.
- Immunostaining של התרבויות הפרוסה
- לתיוג כלי דם להשתמש אנטי laminin polyclonal בדילול של 1: 200 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100.
- לנוירונים תיוג להשתמש אנטי microtubule הקשורים החלבון 2 (MAP2) בדילול של 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100.
- דגירה את הפרוסות עם נוגדנים ראשוניים ל48 שעות ב 4 ° C. עם תסיסה מתמדת. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף אותם בPBS עם 0.5% Triton-X100 ל3-4 פעמים. לדלל נוגדנים משני 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. דגירה את הפרוסות לשעה 2 ב RT בחושך עם הנוגדנים משני מצומדות fluorophore Alexa. השתמש נגד הארנב המתאים העז או נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומדת לAlexa 350 או 488.
- הסר את פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שנאגר מלוח טריס (TBS); לעלות אותם על שקופיות זכוכית וcoverslip השקופיות עם Mowiol.
- מיקרוסקופית של פרוסות המוכתמות
- צפה פרוסות המוכתמות או במיקרוסקופ רגיל עם ציוד epifluorescence או עם מיקרוסקופ confocal. קח תמונות עם מצלמה מתאימה. עבור חלק מתמונות, להפוך את ניגוד הקרינה כדי להניב כלי קדרות צבעוניים על רקע בהיר (איורים 5, 6).
.5 קביעת צפיפות כלי אזורית בתרבויות
- לכמת את vesseצפיפות l מבוססת על מעברי כלי כפי שמתואר בעיון 8.
- השתמש בפרוסות מוכתמות עבור laminin למדידות אלה. להרכיב תמונות מוקלטות של 10X הגדלה עם רשת 6 × 6, שבו כל רשת שווה לכל מ"ר 100 x 100 מיקרומטר, שדה כולל של 0.25 מ"מ 2.
- שלוש רשתות כיסוי כזה באזור CA1, CA3, DG, וEC (איור 2). לספור את כלי חוצים את הקווים של הרשת.
- לקבלת תוצאות עם רלוונטיות סטטיסטיות טובות, לבצע מדידות בלפחות 3 ניסויים בלתי תלויים, כל נתוני, כולל מ3 גורי עכבר עם 3 פרוסות לגור עכבר.
- לקבוע את הערך של מעברי כלי הממוצע מרשתות לכל אזור ולבצע ניתוח סטטיסטי על ידי ניתוח שונה עם תיקון Bonferroni כמבחן post hoc (p <0.05 המוגדרים משמעותי כ) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיפוח גלוקוז חמצן וחוסר חמצן גורמים למוות עצבי וירידה של כלי דם באופן ספציפי באזור CA1 בהיפוקמפוס.
OGD או חמצן קיפוח לבד במשך 15 דקות מושרה אינדוקציה חזקה של מוות של תאים כפי שהם נראים על ידי מכתים יודיד propidium במיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס (איור 3) הדומה כפי שתואר לעיל 7. עם סמנים כדי להמחיש את הרשת של כלי דם, נמצא כי צפיפות כלי דם והארגון הופיעו דומה לשליטה אחרי אתגר OGD ברוב חלקי התרבות למעט אזור CA1. יש צפיפות כלי דם ירד ורשת כלי דם באופן חלקי שיבשו (איור 3, E ו F). שינויים אלה נראים רק באזור שבו צביעת יודיד propidium הוגדלה.
במהלך השינויים בכלי הדם בזמן מקביל לזה של neurניוון onal.
יש לנו למדנו את הקורס של שני אובדן כלי הניוון ודם העצבי הזמן בCA1 באמצעות נקודות זמן ב3 שעות, 24 שעות ו48 שעות לאחר מחסור בחמצן (היפוקסיה). ב3 הודעה היפוקסיה שעה, לא היה מכתים יודיד propidium גלוי ולא חלו שינויים הנוכחיים בארכיטקטורת כלי דם המצביעים על כך בשלב זה לא חל שינויים היו עדיין נראים לעין (איור 4, וב '). ב24 הודעה hr היפוקסיה הייתה הופעה של מכתים יודיד propidium המציינת את ההתקדמות של מוות של תאים בCA1. בנקודה זו בזמן הרשת של כלי דם כבר הייתה מוטרדת וכלי דם אבדו באזור CA1 (איור 4, C, D). שני, מכתים יודיד propidium ואובדן של כלי דם הפכו בולטים יותר בהודעת היפוקסיה 48 שעה (איור 4, E ו F).
ושניהם מוות עצביהאובדן של כלי דם מונע על ידי חסימת עירור לאחר OGD או היפוקסיה.
כאשר אנו בשילוב OGD עם טיפולים תרופתיים שמנעו שחרור עודף גלוטמט, ניתן היה להציל את תאי עצב ממוות של תאים הנגרם על ידי OGD. טיפול עם TTX (אשר מעכב דור פעולה פוטנציאלי וכתוצאה מכך ההשתקה של מסופים מביא) או טיפול בCNQX (אשר מעכב קולטני גלוטמט AMPA-סוג) תאים פירמידליים CA1 הצילו ממוות עצבי (איור 5, D ו F). תוצאות אלו מצביעות על כך שמוות עצבי לאחר OGD מתווך על ידי פעולת הפעלת יתר רעילה של גלוטמט. לאחר טיפולים אלה, לא המוות של תאים עצביים רק נמנע, אלא גם על שלמות הספינה השתמרה והאובדן של כלי דם בCA1 נמנע (איור 5, C, E).
טיפול AMPA גורם מוות עצבי הפעלת יתר רעיל נפוץ בbu היפוקמפוסאובדן כלי t מוגבל לCA1.
OGD כשמש במחקר זה גורם מוות עצבי במיוחד בCA1. בניגוד לכך, טיפול ב100 מיקרומטר AMPA ל30 דקות מושרה איבוד עצבי נפוץ בכלל ammonis cornu של ההיפוקמפוס (CA1 וCA3) וsubiculum אך לא ברכס המשונן (איור 6 ג). מעניין, אובדן כלי דם היה מוגבל לאזור CA1, למרות איבוד עצבי דומה בCA3 לא היה הפסד של כלי דם באזור זה (איור 6 ד). ברכס המשונן לא היה לא אובדן מוות ולא כלי דם עצבי. כימות של צפיפות כלי מאשרת כי כלי דם הולכים לאיבוד בCA1, אך לא באזורים האחרים של תרבות איור 6E.
לוח זמנים איור 1 של חשיפת OGD וreperfusion. אחרי 5 ימים בתרבויות חוץ גופית חשופים לOGD, היפוקסיה או טיפול AMPA. תרבויות הם קבועים לאחר זמן הישרדות של 3 שעות, 24 שעות ו48 שעות.
כימות איור 2 של צפיפות כלי דם באזורים שונים של התרבויות הפרוסה entorhino-היפוקמפוס. Three 6 x 6 רשתות (כאן מוצגות כריבועים) הם כיסו באזור CA1, CA3, DG, וEC. כלי הדם שחצו את הקווים הפנימיים של הרשת נספרו עבור כל ריבוע.
טיפול .3 היפוקסיה איור גורם למוות עצבי ואובדן של כלי דם בCA1. (,תרבויות שליטת C, E), (תרבויות B, D, F) נתון לטיפול היפוקסיה ואחריו 48 שעות של normoxia. immunostaining Laminin בהגדלה נמוכה בירוק (A, B), מכתים PI בהגדלה גבוהה יותר באדום (ג ד), התמזג תמונות לצביעת laminin וPI ב( E) ו( F). ברים סולם ב( B ל, B) ו( F לC, D, E, F) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 כמובן זמן של שינויים ועצביים וכלי דםניוון אחרי מחסור בחמצן (היפוקסיה). צביעת PI באדום שמוצג ב( A, C, E), התמזג תמונות עבור PI מכתים וlaminin (ירוק) מוצגות ב( B, D, F). בטיפול שלאחר היפוקסיה 3 שעות, אין כתמי PI גלויים ולא חלו שינויים בכלי הדם ניכרים (A, B). לאחר 24 מכתים PI שעה עולה ואובדן של כלי דם ניכר גם (C, D). שני כתמי PI והאובדן של כלי דם להיות ברורים יותר לאחר 48 שעה (E, F). סרגל קנה מידה ב( F) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5.; אובדן מוות וכלי דם עצבי נמנעים על ידי חוסמי של עירור עצבי יישום או TTX (C, D) או CNQX (E, F) מנע שני איבוד עצבי כפי שניתן לראות עם מכתים PI (B, D, F) וכלי דם. הפסד חשף על ידי צביעת laminin (A, C, E). OGD לבד גורם גם איבוד עצבי ואובדן של כלי דם בCA1 (A, B). סרגל קנה מידה ב( F) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 עצבי מוות ואובדן של כלי דם לאחר טיפול AMPA. טיפול ב100 מיקרומטר AMPA ל30 דקות מושרה נפוץאיבוד עצבי ברוב האזורים של ההיפוקמפוס (C), אבל האובדן של כלי דם נשאר מוגבל לCA1 האזור (D). סרגל קנה מידה ב( D) = 100 מיקרומטר. כימות של כלי דם מאשרת את האובדן סלקטיבי באזור CA1 (E). עמודות מראות את המספר הממוצע של מעברי כלי, ברים שגיאה מראים SEM. הבדלים משמעותיים מסומנים עם ** לp <0.01. תוצאות נלקחו מתוך שלושה ניסויים בלתי תלויים עם שלוש תרבויות ניתחו כל אחת (n = 9) לכל אזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| זמן | פעולה |
| DIV 4 | הכן OGD או בינוני היפוקסיה |
| DIV 4 | Perfuse OGD אובינוני היפוקסיה עם N 2 עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס |
| DIV 4 | לעבור תרבויות עד בינוני סרום ללא Neurobasal + גלוקוז ממדיום דגירה, לאפשר להם לנוח O / N או 1 יום |
| DIV 5 | Perfuse הבינוני OGD שוב עם N 2 למשך 30 דקות |
| DIV 5 | הוסף 2 μl של 1 מ"ג / מ"ל propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחרו פרוסות בריאים רק לניסויים כפי שצוין על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן |
| DIV 5 | למצוץ הבינוני הרגיל ולהוסיף בינוני OGD לבארות. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD / היפוקסיה ובחזרה. העבר את הצלחת לחדר היפוקסיה |
| DIV 5 | Perfuse עם N 2 ל15 דקות בתא היפוקסיה |
| DIV 5 | הסר את הצלחת מחדר. לחזור לבינוני Neurobasal ומניח בחזרה בחממת humidified עם 5% CO 2 |
| DIV 5 | להוסיף PI ולתקן 3 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח של 3 שעות |
| DIV 6 | להוסיף PI ולתקן 24 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח 24 שעות |
| DIV 7 | להוסיף PI ולתקן 48 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח 48 שעות |
טבלת 1 רצף זמן מפורט של צעדים לטיפול OGD / היפוקסיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם השיטות שהוצגו כאן, ניתן להשתמש בתרבויות פרוסה organotypic היפוקמפוס ככלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. בעוד תרבויות הפרוסה organotypic היו בשימוש בעבר ללימוד תגובות עצביות לאחר איסכמיה 6, 7 ההיבט החדש של המחקר בו זמני של שינויים בכלי הדם משפר באופן משמעותי את היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. יתר על כן, גישת התרבות הפרוסה מאפשרת לא רק לומדת את ההשלכות של אתגר איסכמי אלא גם מאפשרת לבדיקה של אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection. תרבויות פרוסה לכן הם כלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי.
השיטה המוצגת כאן היא קלה ליישום לכל המעבדות חהוינג קצת ניסיון עם תרבויות פרוסה במערכת העצבים המרכזית. החלת OGD או היפוקסיה דורשת איזון זהיר של מדיום התרבות עם N 2 על מנת להשיג תוצאות לשחזור. כמו כן, חשוב לתרבויות פרוסה שימוש רק עם מספר נמוך של תאי PI-חיובי לפני היישום של OGD. התנאים של חוסר חמצן (כלומר, הזמן שבי היפוקסיה או OGD מיושמים) יכול להיות מגוונים ומותאם בהתאם לסוג של התרבות הפרוסה בשימוש.
בעוד תגובות עצביות לאיסכמיה נחקרו רב יש רק מעט מידע זמין על שינויים בכלי הדם לאחר פגיעה מוחית חוסר חמצן-איסכמי. מציאת שכלי דם ואפילו סמנים של מחסום דם המוח נשמרים בתרבויות פרוסה organotypic לתקופה של עד שבוע 8, 9 פתחו את ההזדמנות ללמוד שינויים של כלי הדם לאחר אתגר היפוקסיה בהגדרה של תרבויות הפרוסה organotypic היפוקמפוס 10. כמובן שזה צריךלהיות הבין שהכולים שנשמרים בתרבויות פרוסה אינם perfused. יתר על כן, יש לנו ציינו הבדלים באיבוד דם כלי קיימים מראש ולא ההיווצרות נרחבת של כלי דם רומן. מערכת מודל זה היא, לכן, סביר להניח שלא אופטימלי לחקר היווצרות כלי חדש אחרי עלבון איסכמי.
האפשרות להשתמש בתרבויות הפרוסה בהיפוקמפוס organotypic להבהרה נוספת של יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וכלי הדם פותח שדה חדש של מחקר ומבטיח לעזור השגת הבנה טובה יותר של ופיתוח אפשרויות טיפול חדשות לטיפול בהפרעות עצבים וכלי דם, באיסכמיה מוחית בפרט לאחר שבץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית מועצת יום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ונסקרו והתירו על ידי הרשויות שוויצרית. יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת באזל, המחלקה ליו, והקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_141007). מרקוס Saxer סיפק תמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
