Summary
一种协议，用于entorhino，海马脑片培养，允许再生缺血性脑损伤的多个方面，提出了。通过研究，除了在神经血管的变化，以改变神经元，该协议是一个多功能的工具损伤后，研究塑料改变神经组织。
Abstract
缺血性脑损伤中最常见的和毁灭性的条件影响正常的脑功能，常常导致持续的功能缺陷，在受影响的病人。尽管密集的研究努力，但仍可以减少神经元损伤，并保护在从延迟次级死亡的缺血区的神经元用没有有效的治疗选择。这方面的研究通常涉及使用复杂的和有问题的动物模型。挑战与氧和葡萄糖剥夺（OGD）Entorhino，海马脑片培养是建立在模仿脑缺血体外模型。本研究的新颖的方面是，对脑血管的变化进行了研究，除了神经元的变化和两者的神经隔腔和血管隔室中的反应可以进行比较和相关性。在这个协议中提出的方法，大大拓宽了潜在的应用程序或ganotypic切片培养方法。 OGD或单独缺氧诱导可以通过在器官切片培养物，而简单的装置来施加，并导致在神经组织可靠和可再现的损伤。与此形成鲜明对比的是复杂的和有问题的动物实验中诱发中风和缺血体内 。通过扩大分析，包括血管可以提供关于如何保护和恢复大脑功能的新途径反应的研究。这里介绍的切片培养方法可能发展成一个有吸引力的和重要的工具，缺血性脑损伤的研究，并可能是用于测试目的的神经保护潜力的治疗措施是有用的。
Introduction
中枢神经系统是特别敏感的损失或减少的氧和葡萄糖的供应通过脉管。血液供应到大脑，即使是很短的中断能引起领导的典型中风病证的相关脑区的功能永久性丧失。除了在主影响区域的神经元丧失，存在通常是通过二次伤害附加迟发性神经元损失。遗憾的是到现在为止，没有任何神经保护治疗继发性神经元死亡的减少是可用1。学习继发性损害的机制研究工作依赖于使用脑缺血就像大脑中动脉闭塞和各种血栓闭塞技术的动物模型（对于最近的综述见2）。同时，也由于限制和使用动物模型，各种中枢神经系统组织器官切片文化的伦理问题已使用，允许STUDY神经元的反应不同类型的伤害3-5的。
对于学习，模仿缺血性脑损伤的条件下神经元的反应，已经开发了氧糖剥夺模型系统（OGD）。在这个模型中，切片培养物暂时暴露在缺乏葡萄糖，并已达到平衡，用氮气在不存在氧的平台。通过这样的处理，因此能够诱导神经元损伤和损失，这是相当一个类似于体内 6,7缺血性损伤后观察到的，在海马，这种处理诱导的神经元损失特别是在CA1区，而不是在CA3区和海马齿状回。与此相反，在切片培养血管反应的研究至今还没有得到广泛开展。一个显而易见的原因是在切片养殖模式，缺乏循环和血管的灌注。然而，我们已经有可能保持b前面所示lood血管中枢片培养了好几天8,9。
这种方法的总体目标是，不仅可以监测神经元缺氧缺糖后的命运，但延长的研究，这是损伤反应的重要组成部分血管的命运和重塑。直至现在这样的研究需要使用动物实验（德容等人，1999;卡瓦利亚等人，2001）。在该协议在这里提出，我们将详细介绍如何这样的研究可以做到entorhino，海马脑片培养的挑战无论是与缺氧或兴奋毒性损伤后两个神经元的存活和血管反应的分析。该协议是基于先前发表的研究报告对这个问题10，并且可以为有意在中枢神经系统的神经血管的相互作用任何实验室用。
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Protocol
动物实验是按照2010年9月22日的欧盟理事会指令（2010/63 /欧盟）和进行了审查，并通过瑞士当局允许的。
1，建立器官Entorhino，海马切片培养
- 使用静态培养法4,11日龄4（P4），鼠幼仔准备entorhino，海马脑片培养（EHOSCs）。在这里，使用C57BL6和CB6F1小鼠。
- 以每只小鼠幼崽大约30分钟的片培养的准备， 即 3小时为6小鼠幼崽一窝。进行无菌条件下的所有步骤中的层流工作台中用无菌手术器械。
- 为了避免从沿隔 - 时间轴的切片的位置的可能的干扰，只能使用海马室间隔上半年的切片。如果没有另外说明，进行所有的步骤在RT。
- 切断吨他头一台P4鼠标小狗手术剪刀。不需要麻醉的这一步。
- 删除周围的脑颅骨，并确定大脑半球和中脑的尾端之间的裂隙。小心取出脑延髓部分，从头骨的脑，并将其放置在由补充有L-谷氨酰胺的稳定形式冰冷的筹备中。
- 继续解剖立体显微镜下用脑沉浸在冰冷的筹备中。从半球皮质除去残留的脑膜。识别海马在半球的内侧尾部表面，并与来自大脑的其余部分相邻的内嗅皮质中分离它一起。
- 转移组织到组织切碎机切成400μm的无菌条件下的横向厚片到海马的隔 - 时间轴。
- 广场上CE切片LL培养插入（约6％插片），并培养他们在6孔板，每培养液（47毫升灰熊，将25ml Eagle培养基中井1毫升，25毫升马血清1毫升Glutamax的一，1毫升无菌的10％葡萄糖溶液，pH7.3）中，在湿润的气氛中，用5％CO 2，37℃。第二天，然后隔日达1星期换一次培养基。
2， 体外缺氧及缺氧缺糖再灌注
- 请参阅表1的程序的确切时间表。文化EHOSCs暴露在低氧或缺氧缺糖前5天（DIV5）。有2％B27补充剂，1％Glutamax的和额外的0.1％葡萄糖的Neurobasal介质：在该时间点从含有25％马血清，以无血清培养基具有以下组成的孵化介质切换平台。
- 制备OGD介质与参考7 .The终浓度的组分详述将是以下：0.3毫的CaCl 2，70 mM氯化钠，5.25毫碳酸氢钠 ，70 mM的氯化钾，1.25毫的NaH 2 PO 4，2mM的MgSO 4干燥，和10mM蔗糖，在pH 6.8。加入1 ml OGD介质的两个6孔组织培养板的每个孔中。
- 灌注OGD中与N 2 1小时的缺氧室，然后密封，并保持O / N的孵化器在37℃。
- 使用厌氧条为缺氧的指标。考虑介质是无氧时带的颜色从粉红变为白色。
- 缺氧诱导，用无血清培养基中的葡萄糖，而不是缺氧缺糖培养基。在使用前，灌注在低氧室如上详述的OGD介质与N 2的平台。
- 前条带被暴露于OGD，再灌注OGD介质用N 2 30分钟。加入2微升的1毫克/毫升的碘化丙啶（PI），每孔溶液（2微克/毫升的最终浓度）的切片30分钟，并选择只有健康的切片实验由低数字PI阳性细胞的指示。
- 使用OGD曝光和再灌注在图1中所示的时间表。剥夺或者氧气只（缺氧）或氧气和葡萄糖（OGD）的切片15分钟。
- 对于缺氧诱导或缺氧缺糖的，转成片缺糖中，并保持在低氧室15分钟。确保所有的留在刀片的两侧流体被吸走，当培养物是从常规培养基以OGD介质和背面切换。
- 低氧或缺氧缺糖后，更换OGD介质含氧无血清培养基中，并培养被允许恢复为3,24或48小时在无血清培养基中常规培养器在37℃下用5％的CO 2。之前再添加固定的PI细胞死亡的决心。
的Entorhino，海马脑切片培养3药物治疗
- 文化性ËEHOSCs 5天（DIV5）在培养液暴露在药物治疗之前。开始无论在缺氧缺糖或立即当片被转移到无血清培养基后缺氧缺糖药物治疗。
- 治疗防止缺氧缺糖。
- OGD诱导后加入100μM6-氰基-7 - 硝基喹喔啉-2,3二酮（CNQX）或1μM的河豚毒素（TTX），以在OGD诱导培养基中（15分钟），或者立即进行30分钟。然后，在孵育常氧无血清培养基用于固定前48小时。
- 治疗诱导兴奋死亡。
- 5天后，在培养介质中培养开关血清含有100μM的（RS）-α氨基-3 - 羟基-5 - 甲基-4 - 异唑丙酸（AMPA）处理30分钟的培养基。
- 除去含有AMPA通过抽吸（小心移除插入物的任何残余培养基）培养基中，然后转移切片新鲜平板与正常无血清培养基中，并让他们48小时，直到固定。
4，固定和免疫染色Entorhino，海马脑切片培养
- 碘化丙啶（PI）染色。
- 加入PI进行30分钟至活切片的培养基中，以2微克/毫升的浓度。查看现场的文化与倒置显微镜配备了荧光光学和选择进一步处理切片。对于与免疫组化相结合PI染色，之前培养的固定加PI溶液30分钟。
- 固定的切片。
- 从6孔板中除去培养基，并加入3毫升新制备的4％多聚甲醛（PFA）的各孔。然后将6孔板在冰箱和修复在o / n 4℃。
- 除去PFA溶液翌日并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗片3-4次。
- 从细胞培养物ı除去切片nsert和为自由浮动切片免疫组织粘连过程。
- 仔细分离和使用艺术画笔的大小为0或更小的文化刀片取出切片。传送每个单独的切片于96孔板中填充有封闭缓冲液（PBS，3％正常山羊血清（NGS）和2％的Triton-X100）的孔中。由轨道摇床保持在封闭缓冲液，将切片在恒定搅拌下2小时，在室温。
- 片文化的染色
- 在PBS中含有1％NGS和0.5％的Triton-X100 200：用于标记的血管使用多克隆抗层粘连蛋白的稀释度为1。
- 在PBS中含有1％NGS和0.5％的Triton-X100 500：用于标记的神经元用相关蛋白2（MAP2）的抗微管的稀释度为1。
- 孵育48小时的初级抗体的切片在4℃下以恒定的搅拌。培养结束后，把它们洗干净的PBS中含有0.5％的Triton-X100的3-4倍。 在PBS中含有1％NGS和0.5％的Triton-X100 500：稀释的二抗1。孵育切片2小时在RT与Alexa的荧光团共轭次级抗体的黑暗。使用适当的山羊抗兔或羊抗鼠第二抗体缀合的Alexa 350或488。
- 去除二级抗体溶液并用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤切片三次;它们安装在载玻片和盖玻片的Mowiol幻灯片。
- 染色切片的显微镜
- 查看切片染色无论是在一个标准的显微镜落射荧光装置或用共聚焦显微镜。取的图像与适当的相机。对于一些图像，反转，以产生深染的船只在明亮的背景荧光造影（ 图5和图6）。
5，确定在文化区管密度
- 量化vesse如在参考文献8中描述的基于容器过路升密度。
- 使用染色层粘连蛋白对这些测量的片。叠加的记录图像的放大10倍以一个6×6的网格，其中每个网格等于每平方100×100微米，为0.25mm 2总计字段。
- 叠加三个这样的网格中，CA3，DG和欧盟地区（ 图2）。算交叉网格的线的船只。
- 获得的结果具有良好的统计相关性，从3小鼠幼仔用每只小鼠幼崽3片进行测量中的至少3个独立的实验中，每一个都包括数据。
- 确定船舶口岸从电网各区域的平均值和方差分析和Bonferroni修正为事后用适当的统计软件测试（P <0.05定义为显著）进行统计分析。
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Representative Results
缺氧缺糖和缺氧诱导神经元死亡和血管减少特别是在海马CA1区 。
OGD或氧气剥夺单独15分钟诱导很强的诱导细胞死亡的作为如前面7描述在海马（ 图3）类似的CA1区通过碘化丙啶染色可见特异性。用标记物来可视化血管的网络，人们发现，血管密度和组织似乎类似于在除CA1区的文化的大部分地区OGD挑战后的控制。有血管密度降低和血管网络被部分破坏（ 图3，E和F）。这些变化被认为仅在碘化丙啶染色的增加的区域。
的血管变化的时间当然是平行的neuronal变性。
使用时间点为3小时，24小时后缺氧（缺氧）48小时，我们已经研究了这两种神经元变性和血管损失的时间过程中海马CA1。在3小时后缺氧，没有碘化丙啶染色可见并没有改变存在于血管结构，表明此时没有变化是可见的，但（ 图4，A和B）。在24小时后缺氧有外观的碘化丙啶染色指示细胞死亡中海马CA1的进展。在这个时间点已经被干扰血管网和血管丢失了在海马CA1区域（ 图4中，C和D）。既，碘化丙啶染色和血管损失成为在48小时后缺氧更明显（ 图4，E和F）。
这两种神经元死亡和血管损失是由缺氧缺糖和缺氧后阻断激发阻止。
当我们结合缺氧缺糖与防止过量谷氨酸释放药物治疗，有可能从挽救缺氧缺糖诱导的细胞死亡的神经元。治疗与TTX（抑制动作电位的产生导致的传入端的沉默），或治疗与CNQX（抑制AMPA型谷氨酸受体）救出CA1区锥体细胞的神经元死亡（ 图5，D和F）。这些结果表明，OGD后的神经元死亡是由谷氨酸兴奋毒性作用介导的。这些处理后，不仅神经元细胞死亡被阻止，而且在容器的完整性被保存和血管在CA1的损失被阻止（ 图5，C和E）。
AMPA治疗引起广泛的兴奋性神经元死亡的海马BU吨船舶的损失仅限于CA1区。
在CA1 OGD如在本研究中使用诱导的神经元死亡特异性。相反，用100μM的AMPA处理30分钟诱导的海马（CA1和CA3）和下托的整个大角ammonis广泛的神经元丧失，但不是在齿状回（ 图6C）。有趣的是，血管损失局限在CA1区，尽管CA3区有在这个区域（ 图6D）无血管的损失类似神经元的损失。在齿状回既没有神经元的死亡，也没有血管的损失。血管密度的定量证实血管被丢在CA1区，而不是在培养图6E的其他区域。
图1：安排缺糖曝光和reperfusio的ñ。经过5天的体外培养物中进行OGD，缺氧或AMPA治疗。培养后3小时，24小时和48小时的生存时间固定。
图2定量的entorhino，海马切片培养不同区域的血管密度，3个6×6格（此处显示为正方形）重叠在海马CA1，CA3，DG和欧盟地区。血管交叉网格的内部行进行计数为每平方。
图3：治疗缺氧诱导神经元死亡和海马CA1区血管的损失。（A，C，E）控制的文化，（B，D，F）的文化进行缺氧处理后48小时含氧量的。在低倍镜下层粘连蛋白免疫绿色（A，B），PI在更高的放大倍率染色红色（C，D），合并图像，层粘连蛋白和PI染色（E）和（F）。标尺中的（B为A，B）和（F为C，D，E，F）= 100微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
血管变化和神经元图4时程缺氧（缺氧），在（A，C，E）中所示的红色PI染色后变性，合并在（B，D，F），显示图像PI染色和层粘连蛋白（绿色）。在3小时后缺氧的治疗，没有PI染色可见，无血管的变化是很明显的（A，B）。 24小时后PI染色，并出现血管损失也很明显（C，D）。 48小时（E，F），后两者PI染色和血管的损失变得更加明显。 （F）中比例尺= 100微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图5。; 神经元死亡和血管的损失是由神经元的激发受体阻滞剂防止任何河豚毒素（C，D）或CNQX（E，F），防止了两个神经元的损失，可见PI染色（B，D，F）和血管中的应用。损失透露层粘连蛋白染色（A，C，E）。缺氧缺糖诱导单既神经元丢失及血管的损失CA1区（A，B）。 （F）中比例尺= 100微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图6：神经元死亡和血管损益后的AMPA治疗。治疗100微米的AMPA 30分钟诱发广泛神经元丢失海马（C）的大部分地区，但血管的损失仍然受限于CA1区（D）。 （D）中比例尺= 100微米。血管的定量确认在CA1区（E）的选择性丧失。柱表示容器道口，示出了SEM误差棒的平均数目。显著差异表明与**为P <0.01。结果来源于三个独立的实验有三个分析文化各组（n = 9）为每一个地区。 请点击这里查看该图的放大版本。
| 时间 | 动作 |
| 息4 | 准备缺氧缺糖和缺氧媒体 |
| 息4 | 灌注OGD或与N 2中缺氧1小时的缺氧室，然后密封，并保持O / N的孵化器在37℃ |
| 息4 | 从培养液切换文化的神经基础无血清培养基+葡萄糖，让他们休息的O / N或1天 |
| 息5 | 用N 2再灌注OGD介质30分钟 |
| 息5 | 加入2微升的1毫克/毫升的碘化丙啶（PI），每孔溶液（2微克/毫升的最终浓度）的切片30分钟，并只选择健康的切片进行实验以低数量的PI阳性细胞作为指示 |
| 息5 | 吸出的常规培养基和添加OGD介质的孔中。确保所有的留在刀片的两侧流体被吸走，当培养物是从常规培养基切换到OGD /缺氧介质和背部。板转移到低氧室 |
| 息5 | 灌注用N 2在缺氧室15分 |
| 息5 | 从室中取出钢板。切换回Neurobasal培养基并重新置于潮湿的培养箱中，用5％CO 2的 |
| 息5 | 添加PI和缺氧缺糖/缺氧3小时的时间间隔后修复3小时 |
| DIV 6 | 添加PI和缺氧缺糖/缺氧24小时的时间间隔后修复24小时 |
| DIV 7 | 添加PI和缺氧缺糖/缺氧48小时的时间间隔后修复48小时 |
对缺氧缺糖/缺氧处理步骤表1详细的时间序列。
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Discussion
用这里介绍的方法，海马脑切片培养物可被用作一个通用的工具损伤后，研究塑料的改变的神经组织。虽然器官切片文化已被用于在过去的研究神经元的反应缺血后6，7的血管改变的同时进行研究的新局面显著增强了该方法的应用潜力。 OGD或单独缺氧诱导可以通过在器官切片培养物，而简单的装置来施加，并导致在神经组织可靠和可再现的损伤。此外，切片培养方法允许不仅研究缺血性挑战的后果，但也允许针对神经保护潜力的治疗措施检测。因此切片文化是一个有吸引力的和重要的工具，用于缺血性脑损伤的研究。
这里提出的方法很容易实现对所有实验室公顷咏与中枢神经片培养了一定的经验。施加OGD或缺氧需要仔细平衡以N 2的培养基中，以实现可重复的结果。同样重要的是，只用切片培养与PI阳性细胞施用之前，OGD的较少的次数。缺氧的条件下（ 即，对于其中低氧或缺氧缺糖被施加的时间）可以是多种多样的，并根据所用切片培养的类型进行了优化。
虽然神经元的反应缺血已被广泛研究，只有很少的信息提供了有关缺氧缺血性脑损伤后血管的变化。这一发现，血管和血脑障壁连标记都保持在器官切片文化长达一个星期8,9揭开了海马脑片培养10的设定缺氧的挑战后，研究血管改变的机会。当然，它需要可以意识到，该被保持在切片培养容器不灌流。此外，我们观察到在预先存在的血管，而不是广泛形成的新颖的血管损失的差异。该模型系统，因此，可能不是最佳的一个局部缺血损伤后学习新的血管形成。
是否可使用海马脑片培养的神经元之间的复杂的相互作用的进一步阐述和血管打开一个新的研究领域，并承诺帮后实现更好的理解和开发神经血管性疾病的新治疗选择，尤其是脑缺血中风。
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Disclosures
动物实验是按照1986年11月24日（86/609 / EEC）欧洲共同体理事会指令，并通过瑞士当局审查和批准。作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作得到了巴塞尔大学生物医学系，以及瑞士国家科学基金会（31003A_141007）的支持。马库斯Saxer提供了技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
