Summary
Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.
Abstract
İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.
Introduction
Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikleri gibi serebral iskemi ile ilgili deneysel modellerinin kullanımına dayalı (güncel bir değerlendirme için bakınız 2). Buna paralel olarak,, aynı zamanda, sınırlama ve hayvan modellerinde, çeşitli merkezi sinir sistemi dokuların Organotipik kesit kültürünün kullanımı ile etik kaygılar Stu izin veren kullanılmıştıryaralanma 3-5 çeşitli tip nöronal reaksiyonların dy.
Iskemik beyin yaralanmasının taklit koşullarda nöronal reaksiyonun incelenmesi için, oksijen glikoz yoksunluğu model sistem (OGD) geliştirilmiştir. Bu modelde, dilim kültürler geçici olarak glikoz yoksun ve oksijenin yokluğunda azot gazı ile dengeye getirilmiş olan bir ortama maruz bırakılır. Bu tür bir işlem ile, in vivo 6, 7 iskemik yaralanma sonrası gözlenen ile oldukça benzer nöronal yaralanma ve kaybını uyarmak mümkündür. Hipokampta, böyle bir tedavi olarak, özellikle CA1 nöronal kaybı uyarmaktadır ama CA3 alan veya hipokampus dentat girus. Bunun aksine, kesit kültürlerinde vasküler reaksiyonların Bu güne kadar geniş ele edilmemiştir. Bir belirgin bir neden dilim kültürü modelinde dolaşım ve kan damarı perfüzyon olmamasıdır. Bununla birlikte, bu B korumak mümkün olduğunu göstermiştikMSS lood gemiler 9, birkaç gün 8 kültürleri dilim.
Bu yöntemin genel amacı OGD'ye sonra nöronların kaderi izlemek, ancak yaralanma yanıtın önemli bir parçası olan damar kaderi ve biçimlenme çalışma genişletmek için değil sadece. Şimdiye kadar bu tür çalışmalar, hayvan deneylerinde kullanımını gerektirmiştir (. De Jong ve arkadaşları, 1999; Cavaglia ve diğerleri, 2001.). Protokol Burada yer olarak, bu tür çalışmalar, hipoksi ile birlikte ya da her ikisi nöronal hayatta kalma ve damar reaksiyonlarının analizi ile takip eksitotoksik lezyonlar ya meydan entorhino-hipokampal kesit kültürlerinde Organotipik detay yapılabilir nasıl. Bu protokol, bu konuda 10 önceden yayımlanan bir çalışmada dayanmaktadır ve MSS nörovasküler etkileşimleri ilgilenen herhangi bir laboratuvar için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi.
1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma
- Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır.
- Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış tezgah steril koşullar altında tüm adımları uygulayın.
- Septorinoplastiyi zamansal ekseni boyunca dilimin konumundan muhtemel müdahaleyi önlemek için, yalnızca hipokampal septal yarısı dilim kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirmek.
- T kestiO cerrahi makas ile bir P4 fare yavru kafa. Resim anestezi Bu aşama için gereklidir.
- Beyin çevresinde kafatası çıkarın ve hemisferdeki ve orta beyinin kaudal ucu arasındaki fissür tespit. Dikkatle kafatasından orta beyin beynin rostral bir kısmını çıkarmak ve L-glutamin, stabilize edilmiş bir formu ile takviye edilmiş MEM oluşan buzla soğutulmuş Müstahzar ortamda yerleştirin.
- Beyin, buz gibi hazırlama ortamına daldırılmış edilir bir stereo mikroskop altında diseksiyon devam edin. Kortikal hemisferden kalan meninks çıkarın. Yarımkürenin orta kaudal yüzeyinde hipokampus belirlenmesi ve beynin geri kalanından komşu entorhinal korteks ile birlikte ayırın.
- Bir doku helikoptere doku aktarın ve hipokampus septorinoplastiyi-zamansal eksene aseptik koşullar altında çaprazlama 400 mikron kalınlığında dilimler kesilir.
- Ce üzerinde dilimlerini yerleştirinll kültür ekleri (yaklaşık 6 uç başına dilim) ve inkübasyon ortamının (47 mi, MEM, 25 mi Eagle Medium, oyuk başına 1 mi, 25 mi at serumu, bir 1 ml Glutamax I, 1 ml 'si ile 6-yuvalı plakalar içinde inkübe bunları 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde ve steril% 10 glükoz çözeltisi, pH 7.3). Konusu orta ertesi gün ve 1 hafta sonra her gün yukarı değiştirin.
REPERFÜZYONUNDA Vitro Hipokside 2. ve Oksijen-glukoz Yoksunluk
- Prosedürün tam bir zaman çizelgesi için Tablo 1'e bakınız. Hipoksi ve OGD'ye maruz bırakılmadan önce 5 gün boyunca (DIV5) için kültür EHOSCs. Bu zaman noktasında, aşağıdaki bileşim ile serum içermeyen ortam,% 25 at serumu ihtiva eden inkübasyon ortamından orta geçiş: Neuro temelli vasat% 2 B27 takviyesi,% 1 Glutamax ve ilave% 0.1 glukoz ile birlikte.
- Referans 7 bileşenlerin .The son konsantrasyonları ayrıntılı olarak aşağıdaki gibi olacaktır OGD ortamı hazırlayın: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5.25 mM NaHCO 3, 70 mM KCI, pH 6.8, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 ve 10 mM sukroz. Iki adet 6 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna OGD, ortamın 1 ml ilave edilir.
- Hipoksi bir odasında 1 saat süreyle N2 ile OGD, orta serpmek ve daha sonra sızdırmaz hale getirir ve tutmak O / 37 ° C'de bir kuluçka K.
- Hipoksik göstergeleri olarak anaerobik şeritler kullanın. Şeritlerin rengi beyaz pembeden değiştirildiğinde oksijensiz ortama düşünün.
- Hypoxia, yerine OGD, ortamın glikoz ile serumsuz ortamı kullanmaktadır. Kullanmadan önce, OGD, orta kısmında anlatıldığı şekilde bir bölme hipoksi halinde N2 ile orta serpmek.
- Dilimleri OGD'ye maruz kalan önce, 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek. 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml 'lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve seçmek, 2 uldeney için, sadece sağlıklı dilim PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi.
- . OGD maruz kalma ve reperfüzyon Şekil 1'de gösterildiği zamanlamasını kullanın 15 dakika boyunca ya oksijen sadece (hipoksi) veya oksijen ve glikoz (OGD) dilimleri mahrum.
- Hipoksi ve OGD'ye indüksiyonu için OGD ortamına dilim aktarmak ve hipoksi odası içinde 15 dakika için tutun. Kültürler, orta ve arka OGD düzenli ortamından açıldığında, insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun.
- Hipoksi ve OGD'ye sonra, oksijenli serum barındırmayan ortam maddesi ile OGD, orta yerine ve kültürler,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de normal inkübatörde serum barındırmayan ortam içinde 3, 24 veya 48 saat süre ile iyileşmelerine izin verilir. Hücre ölümü tespiti için tespit için önce yeniden PI ekleyin.
Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler 3. Farmakolojik Tedaviler
- Kültürfarmakolojik tedavilere maruz bırakılmadan önce, kuluçkalama ortamı içinde 5 gün (DIV5) e EHOSCs. Farmakolojik tedaviler sırasında veya hemen OGD'ye dilim serumsuz ortama transfer zaman sonra OGD, ya başlatın.
- OGD'ye koruması için Tedaviler.
- OGD, 30 dakika boyunca, indüksiyondan sonra hemen 100 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) ya da (15 dk) OGD, indüksiyon sırasında kültür ortamına 1 uM Tetrodotoksin (TTX) veya ekleyin. Daha sonra, tespitten önce, 48 saat boyunca normoksik, serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilir.
- Eksitotoksik ölüme indüksiyonu için tedaviler.
- Kuluçka ortamı anahtar kültürlerinde 5 gün sonra, 30 dakika boyunca 100 uM, (RS) -α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) içeren içermeyen ortam serum.
- Aspirasyon (ekler üzerinde herhangi bir kalıntı orta kaldırmak için özen) tarafından AMPA içeren kültür ortamı çıkarın, sonra da normal serum serbest orta ve taze plakaları dilim aktarmakfiksasyon kadar 48 saat boyunca saklayın.
4. Fiksasyon ve immün Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler
- Propidium iyodür (PI) boyama.
- 2 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda canlı dilimlerin kültür ortamına PI, 30 dakika boyunca ilave edin. Floresan optik ile donatılan bir ters mikroskop ile canlı kültürler el ve daha fazla tedavi için dilim seçmek. Immünhistokimya ile birlikte PI boyama için, önce kültürlerin tespit PI boňaltılması 30 dakika ekleyin.
- Dilimleri Fiksasyon.
- 6-delikli plaka kültür Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA), 3 ml ekleyin. Daha sonra, bir buzdolabı içinde 6 oyuklu plaka yerleştirilir ve 4 ° C'de O / N düzeltin.
- PFA çözüme ertesi gün çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dilimleri 3-4 kez yıkayın.
- Hücre kültürü i ikinci dilim uzaklaştırılmasınsert ve serbest yüzen bölümlerinin imünohistokimya için engelleme prosedürü.
- Dikkatlice ayırın ve boyutu 0 veya daha küçük bir sanat boya fırçası kullanılarak kültürü ekler gelen dilim çıkarın. (% 3 normal keçi serumu (NGS) ve 2% Triton-X100 ile PBS) ile bloke edici tampon ile doldurulmuş bir 96 gözenekli plakanın bir kuyuya her bir dilim aktarın. Orbital bir karıştırıcı ile sabit çalkalama altında, oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon dilimleri tutun.
- Dilim kültürlerin immün
- Etiketleme için kan damarları 1 bir seyreltme poliklonal anti-laminin kullanın: 200 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden.
- PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 içeren 500: etiketleme nöronlar 1 bir seyreltme proteini 2 (MAP2) ilgili anti-mikrotübül kullanın.
- Sürekli çalkalama ile 4 ° C'de 48 saat için primer antikorlar ile inkübe dilimleri. İnkübasyon süresinden sonra, 3-4 kez,% 0.5 Triton-X100 ile PBS ile yıkayın. İkincil antikorlar 1 seyreltin: 500 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. Alexa fluorofor konjüge sekonder antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe dilimleri. Alexa 350 veya 488 konjuge uygun keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare ikincil antikoru kullanın.
- Ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) ile dilimleri üç defa yıkamak; cam slaytlar takar ve Mowiol ile slaytlar lamel.
- Lekelenmiş dilimlerin Mikroskopi
- Epifloresans donanımları ile standart bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile ya lekeli dilimleri gör. Uygun bir kamera ile çektiğiniz görüntüleri. Bazı görüntüler için, parlak arka planda koyu renkte boyalı gemileri elde etmek için floresan kontrast (Şekil 5 ve 6) ters çevirin.
Kültürlerin Bölgesel Gemi Yoğunluk 5. Belirlenmesi
- Vesse niceliğiniReferans 8'de tarif edildiği gibi kap geçişleri göre L. yoğunluğu.
- Bu ölçümler için laminin lekeli dilimleri kullanın. Her grid kare başına 100 x 100 mikron, 0.25 mm 2 toplam alanına eşit bir 6 x 6 ızgara ile 10X büyütme Kayıtlı görüntüleri üst üste.
- CA1, CA3, DG ve AK bölgede bindirme böyle üç ızgaraları (Şekil 2). Izgara çizgileri geçen gemileri saymak.
- İyi bir istatistik alaka ile sonuç elde etmek için, fare yavru başına 3 dilim ile 3 fare yavrular, en az 3 bağımsız deneyde dahil her veri ölçümlerini yapmak.
- Her bölge için ızgaralardan damar geçişlerinin ortalama değerini belirler ve uygun istatistik yazılımı kullanılarak (anlamlı olarak tanımlanan p <0.05) post hoc test olarak Bonferroni düzeltmeli ANOVA ile istatistiksel analiz yapmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden.
Daha önce tarif edildiği gibi, 7 'e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve kurum CA1 bölgesinde hariç kültür çoğu bölümünde OGD cebine kontrolüne benzer olmuştur olduğu bulunmuştur. Damar yoğunluk azalma oldu ve kan damar ağı kısmen (Şekil 3, E ve F) kesilmiş olabilir. Bu değişiklikler sadece propidyum iyodid lekeleme artmıştır bölgesinde görüldü.
Vasküler değişikliklerin zaman ders Neur paralellikonal dejenerasyon.
Bu, 3 saat, 24 saat ve oksijen tükenmesi (hipoksi) sonra 48 saat zaman noktalarında kullanılarak CA1 hem nöronal dejenerasyon ve damar kaybı zaman sürecini inceledik. 3 saat sonrası hipoksi, hiçbir propidiyum iyodür boyama görünür oldu ve şu anda herhangi bir değişiklik görülüyordu henüz belirten damar mimarisi mevcut hiçbir değişiklik (Şekil 4, A ve B) vardı. 24 saat sonrası hipoksi 'de CA1 bölgesindeki hücre ölümü sürecini gösteren propidyum iyodid lekeleme görünümü oldu. Bu zaman noktasında kan damarlarının ağ zaten bozulmuş ve kan damarları CA1 bölgesinde (Şekil 4, C ve D) olarak kaybedilmiştir. Hem propidiyum iyodür boyama ve kan damarı kaybı (Şekil 4, E ve F) 48 saat sonrası hipoksi daha belirginleşmiştir.
Nöronal ölüm hemkan damarı kaybı OGD'ye veya hipoksi sonra uyarma engelleyerek önlenir.
Biz aşırı glutamat engelledi farmakolojik tedaviler ile OGD birleştirildiğinde, OGD kaynaklı hücre ölümünden nöronlar kurtarmak mümkün olmuştur. Nöronal ölümlere (Şekil 5, D ve F) ile birlikte ya da tedavi CNQX (AMPA-tipi glütamat reseptörlerini inhibe eden) kurtarıldı CA1 piramidal hücreleri (aksiyon potansiyeli iletici terminalleri susturulması sonuçlanan üretimini inhibe eden) TTX ile tedavi. Bu sonuçlar, OGD'ye nöronal ölüm glutamat eksitotoksik hareketi ile aracılık ettiğini göstermektedir. Bu işlemlerden sonra, sadece nöron hücresi ölümü önlenmiştir, ama aynı zamanda kap bütünlüğünün korunması ve CA1 bölgesindeki kan damarlarının kaybı (Şekil 5, C ve E) önlenmiştir.
AMPA tedavi hipokampus met yaygın Eksitotoksik nöron ölümünü indüklert damar kaybı CA1 sınırlıdır.
Bu çalışmada kullanılan OGD CA1 spesifik nöronal ölüme neden olur. Buna karşılık, 30 dakika boyunca 100 uM AMPA ile tedavi, ancak kıvrımlarının (Şekil 6C) hipokampusun (CA1 ve CA3) ve subikulum tüm cornu ammonis yaygın bir nöron kaybında. İlginçtir, kan damarı kaybı bu bölgede (Şekil 6D) hiçbir kan damarı kaybı oldu CA3 benzer nöronal kaybına rağmen, CA1 bölgesinde sınırlı oldu. Kıvrımlarının içinde ne nöronal ölüm, ne kan damarı kaybı oldu. Damar yoğunluğu ölçümü kan damarları değil kültürün Şekil 6E diğer bölgelerinde, CA1 kayıp olduğunu onaylar.
OGD maruz kalma ve reperfusio Şekil 1. Takvimi: n. vitro kültürlerinde 5 gün OGD, hipoksi veya AMPA işlemine tabi sonra. Kültürler 3 saat, 24 saat ve 48 saat bir yaşam süre sonra sabitlenir.
Entorhino-hipokampal dilim kültürlerin farklı bölgelerinde kan damarı yoğunluğu Şekil 2. Kantitasyonu. (Burada kareler olarak gösterilen) Üç 6 x 6 ızgaraları CA1, CA3, DG ve AK bölgede üst üste. Izgaranın iç sınırı aşması damarlar, her kare için sayıldı.
Şekil 3. Hipoksi tedavisi, nöronal ölüm ve CA1 bölgesindeki kan damarı kaybı uyarmaktadır. (A,C, e) kontrol kültürleri (B, D, F) kültür normoksiyada 48 saat, ardından hipoksi muamelesine tabi tutulmuştur. Yeşil düşük büyütmede laminin immünoboyamasıdır kırmızı (C D) yüksek büyütmede (A, B), PI boyama, (E) laminin ve PI boyama görüntüleri birleşti ve (F). Ve (A, B için B) Ölçek bar = 100 mikron (C, D, E, F F). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Vasküler değişiklikler ve nöronal Şekil 4. Zaman kursuOksijen yoksunluğun (hipoksi). (A, C, E) gösterilen kırmızı PI boyama sonra dejenerasyon, (B, D, F) gösterilen PI boyama ve laminin (yeşil) için görüntüleri birleşti. 3 saat sonrası hipoksi tedavi de, orada görünür hiçbir PI boyama ve hiçbir vasküler değişiklikler (A, B) belirgindir. 24 saat PI boyama ortaya çıkan ve kan damarı kaybı da (C, D) sonra belirgin. PI boyama ve kan damarı kaybı hem de 48 saat (E, F) sonra daha belirgin hale gelir. (F) Ölçek çubuğu 100 mikron =. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5,., Nöronal ölüm, ve damar kaybı nöronal uyarım blokerleri ile önlenmektedir PI boyama (B, D, F) ve damar ile görüldüğü gibi TTX (C ve D) ya da CNQX (E, F) her iki nöron kaybı önlenir ya da uygulanması. Laminin zarar lekelemesi (A, C, D) ile ifade edilir. OGD, tek başına CA1 nöronal kayıp ve kan damarlarının kaybı (A, B) her ikisi de neden olur. (F) Ölçek çubuğu 100 mikron =. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Nöronal ölüm, ve damar kaybı, AMPA sonra değerlendirildi. Yaygın kaynaklı Tedavi 100 uM AMPA ile 30 dakika boyuncanöronal hipokamp (C) pek çok alanda kaybı, fakat kan damarlarının kaybı alanı CA1 (D) sınırlı kalmıştır. (D) Ölçek çubuğu 100 mikron =. Kan damarlarının miktar CA1 bölgesinde (E) 'de seçici kaybı teyit etmektedir. Sütunlar gemi geçişleri, SEM gösteren hata çubukları ortalama sayısını gösterir. Önemli farklılıklar p <0.01 ** ile gösterilir. Sonuçlar üç analiz kültürleri ile üç bağımsız deneyler türetilen her (n = 9), her bölge için. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Zaman | Eylem |
| DIV 4 | OGD veya hipoksi ortamı hazırlayın |
| DIV 4 | OGD serpmek veyadaha sonra 1 hipoksi bir odasında saat ve N2 ile hipoksi orta kapatılır ve 37 ° C'de bir inkübatör içinde O / N tutmak |
| DIV 4 | , Inkübasyon ortamından Neurobasal serum serbest ortamı + glikoz kültürleri geçin onları O / N veya 1 gün dinlenmek için izin |
| DIV 5 | 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek |
| DIV 5 | 2 ul 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml 'lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi deney için, sadece sağlıklı dilim seçmek |
| DIV 5 | Düzenli orta emmek ve kuyulara OGD orta ekleyin. Kültürler arka OGD / hipoksi ortamına normal ortamından açılır ve zaman insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun. Hipoksi odasına plaka transfer |
| DIV 5 | Hipoksi bölmesi içinde 15 dakika süreyle N2 ile perfüze |
| DIV 5 | Odasından plakasını çıkarın. Geri Neurobasal orta geçin ve% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör geri koyun |
| DIV 5 | PI ekleyin ve 3 saat aralığı için OGD / hipoksi 3 saat sonra düzeltmek |
| DIV 6 | PI ekleyin ve 24 saat aralığı için OGD / hipoksi 24 saat sonra düzeltmek |
| DIV 7 | PI ekleyin ve 48 saat aralığı için OGD / hipoksi sonra 48 saat düzeltmek |
OGD / hipoksi tedavisi için adımlar Tablo 1. ayrıntılı zamanı dizisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Ayrıca, dilim kültür yaklaşımı sadece iskemik meydan sonuçlarını okuyan değil verir ama aynı zamanda nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test için izin verir. Dilim kültürler nedenle iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araçtır.
Burada sunulan yöntem, ha tüm laboratuvarlar için uygulamak kolayMSS dilim kültürleri ile bazı deneyimi Ving. OGD veya hipoksinin uygulayarak yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için N2 ile kültür ortamına dikkatli bir şekilde dengelenmesini gerektirir. Ayrıca bir ön OGD'ye uygulanmasından PI-pozitif hücre düşük sayıda tek kullanım alanı dilim kültürlerinin önemlidir. Hipoksi koşulları (yani uygulandığı ve hipoksi için zaman OGD) çeşitli ve ikinci dilim kültür tipine göre optimize edilebilir.
Iskemi nöronal tepkiler olarak çalışılırken yaygın hipoksik-iskemik beyin hasarı sonrası damar değişiklikleri hakkında az bilgi mevcuttur orada sadece. Bir hafta kadar 8, 9 hipokampal organotipik dilim kültürlerin 10 ortamda hipoksi mücadeleden sonra damar değişiklikleri incelemek için fırsat açtı boyunca kan damarları ve kan beyin bariyerinin bile belirteçleri bulma organotipik dilim kültürlerde tutulur. Tabii ki gerekiyordilim kültürlerde tutulur gemilerin perfüze olmadığını fark edilebilir. Ayrıca, daha önceden var olan kan damarlarının-yerine, yeni kan damarlarının oluşumu geniş kaybına farklılıklar gözlenmiştir. Bu model sistemi, büyük ihtimalle, bu nedenle, bu değer iskemik zedelenmeden sonra, yeni damar oluşumu çalışmak için optimal değildir.
Olasılık nöronlar arasındaki karmaşık etkileşimin daha aydınlatılması için organotipik hipokampal dilim kültürleri kullanmak ve damar çalışma yeni bir alan açar ve sonrası özellikle serebral iskemi, daha iyi bir anlayış sağlanması ve nörovasküler bozukluklar için yeni tedavi seçenekleri gelişmekte yardım sözü verdi inme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
