Summary
بروتوكول للثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين، والذي يسمح استنساخ جوانب كثيرة من إصابات الدماغ الدماغية، ويرد. من خلال دراسة التغيرات في neurovasculature بالإضافة إلى التغييرات في الخلايا العصبية، وهذا البروتوكول هو أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة.
Abstract
إصابات الدماغ الدماغية هي من بين الشروط الأكثر شيوعا ومدمرة المساومة على وظيفة الدماغ السليم ويؤدي إلى استمرار العجز الوظيفية في المرضى المصابين كثير من الأحيان. على الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال هناك أي خيار العلاج الناجع الذي يقلل الإصابة العصبية ويحمي الخلايا العصبية في المناطق الدماغية من الموت الثانوي تأخير. البحوث في هذا المجال عادة ما ينطوي على استخدام نماذج حيوانية متقنة ومعقدة. وتنشأ الثقافات شريحة عضوي النمط-Entorhino الحصين تحدى مع الأكسجين والحرمان الجلوكوز (OGD) في نماذج المختبر التي تحاكي نقص التروية الدماغية. الجانب الرواية من هذه الدراسة هو أن يتم دراسة التغيرات في الأوعية الدموية في الدماغ بالإضافة إلى التغيرات العصبية وردود الفعل من كل من الخلايا العصبية وحجرة حجرة الأوعية الدموية يمكن مقارنة والمترابطة. الطرق الواردة في هذا البروتوكول توسيع كبير في التطبيقات المحتملة للأوganotypic نهج ثقافة شريحة. تحريض OGD أو نقص الأكسجة وحدها يمكن تطبيقها بوسائل بسيطة إلى حد ما في الثقافات شريحة عضوي النمط ويؤدي إلى الضرر موثوقة وقابلة للتكرار في الأنسجة العصبية. هذا هو في تناقض صارخ مع التجارب على الحيوانات معقدة وإشكالية حمل السكتة الدماغية ونقص التروية في الجسم الحي. من خلال توسيع التحليل ليشمل دراسة رد فعل الأوعية الدموية يمكن أن توفر طرق جديدة حول كيفية حفظ واستعادة وظائف المخ. نهج ثقافة شريحة المقدمة هنا قد تتطور إلى أداة جذابة وهامة لدراسة إصابات الدماغ الدماغية ويمكن أن تكون مفيدة لاختبار التدابير العلاجية المحتملة التي تهدف إلى العصبية.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي حساس بشكل خاص للخسارة أو تخفيض إمدادات الأكسجين والجلوكوز بواسطة الأوعية الدموية. حتى انقطاع قصير بدلا من إمدادات الدم إلى الدماغ يمكن أن تحدث خسارة دائمة في وظيفة من مناطق الدماغ ذات الصلة مما يؤدي إلى أعراض السكتة الدماغية نموذجية. بالإضافة إلى فقدان الخلايا العصبية في المناطق المتضررة الأولية، هناك عادة إضافية فقدان الخلايا العصبية المتأخرة من خلال الضرر الثانوي. للأسف حتى الآن، كان يوجد علاج اعصاب للحد من موت الخلايا العصبية الثانوي المتاحة 1. الجهود البحثية لدراسة آليات الضرر الثانوي تعتمد على استخدام نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية مثل انسداد الشريان الدماغي الأوسط ومختلف تقنيات انسداد الجلطات (لمراجعة حديثة انظر 2). في موازاة ذلك، أيضا بسبب القيود والمخاوف الأخلاقية مع استخدام النماذج الحيوانية، ثقافة شريحة عضوي النمط من مختلف أنسجة الجهاز العصبي المركزي وقد استخدمت تسمح ستودى من ردود الفعل العصبية إلى نوع مختلف من إصابات 3-5.
لدراسة رد فعل الخلايا العصبية في ظل الظروف التي تحاكي إصابات الدماغ الدماغية، وقد تم تطوير النظام النموذجي للحرمان الأكسجين الجلوكوز (OGD). في هذا النموذج، تتعرض الثقافات شريحة مؤقتا إلى المتوسطة التي تفتقر الجلوكوز وتم معايرتها مع غاز النيتروجين في غياب الأكسجين. مع مثل هذا العلاج، فمن الممكن للحث على إصابة الخلايا العصبية وفقدان الذي يشبه إلى حد ما واحد وحظ بعد الإصابة الدماغية في الجسم الحي 6 و 7. في الحصين، فإن مثل هذا العلاج يستحث فقدان الخلايا العصبية وتحديدا في CA1، ولكن ليس في منطقة CA3 أو التلفيف المسنن من الحصين. في المقابل، فإن دراسة التفاعلات الوعائية في الثقافات شريحة لم يجر على نطاق واسع حتى الآن. لسبب واضح هو عدم وجود الدورة الدموية والأوعية الدموية نضح في نموذج الثقافة شريحة. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا أنه من الممكن للحفاظ على بسفن lood في الجهاز العصبي المركزي شريحة الثقافات لعدة أيام 8 و 9.
الهدف العام من هذه الطريقة هو مراقبة ليس فقط مصير الخلايا العصبية بعد OGD بل تمتد الدراسة إلى مصير وإعادة تشكيل الأوعية الدموية التي هي جزء مهم من استجابة الاصابة. حتى الآن قد تتطلب هذه الدراسات استخدام التجارب على الحيوانات (دي يونغ وآخرون، 1999؛ Cavaglia وآخرون، 2001). في قدم بروتوكول هنا، فإننا سوف بالتفصيل كيف يمكن القيام به في مثل هذه الدراسات الثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين تحدى إما مع نقص الأكسجة أو الآفات excitotoxic المواد تليها تحليل كل من البقاء والأوعية الدموية ردود الفعل العصبية. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت سابقا حول هذا الموضوع 10 ويمكن أن تكون مفيدة لأي مختبر ترغب في التفاعلات الوعائية العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية في 22 سبتمبر 2010 (2010/63 / الاتحاد الأوروبي) وجرى استعراض ويسمح به السلطات السويسرية.
1. إعداد الثقافات شريحة عضوي النمط Entorhino-الحصين
- إعداد-entorhino الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط (EHOSCs) من الجراء بعد الولادة يوم 4 (P4) الماوس باستخدام طريقة الحضانة ثابت 4،11. هنا، استخدم C57BL6 وCB6F1 الفئران.
- تأخذ حوالي 30 دقيقة لكل الماوس الجرو لإعداد الثقافات شريحة، أي 3 ساعة لالقمامة من 6 الجراء الماوس. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي طاولة العمل مع الأدوات الجراحية معقمة.
- من أجل تجنب أي تداخل محتمل من موقف شريحة على طول المحور septo الزمني، استخدم فقط الحصين شرائح من النصف الحاجز. إذا لم ينص على خلاف ذلك، تنفيذ جميع الخطوات في RT.
- قطع رانه رأس الجرو P4 الفأر مع مقص جراحي. لا يلزم التخدير لهذه الخطوة.
- إزالة الجمجمة حول الدماغ وتحديد فجوة بين نهاية الذيلية من نصفي الكرة المخية والمخ الأوسط. إزالة بعناية من جانب منقاري الدماغ إلى الدماغ المتوسط من الجمجمة ووضعه في الجليد الباردة المتوسطة إعداد تتألف من MEM تستكمل مع شكل استقرت من L-الجلوتامين.
- مواصلة تشريح تحت stereomicroscope مع الدماغ يجري مغمورة في الجليد المتوسطة إعداد البارد. إزالة السحايا المتبقية من نصفي الكرة الأرضية القشرية. تحديد الحصين على سطح الذيلية وسطي من نصف الكرة وفصلها مع القشرة المخية الأنفية الداخلية المجاورة عن بقية الدماغ.
- نقل الأنسجة إلى المروحية الأنسجة وقطع 400 ميكرون شرائح سميكة تحت ظروف معقمة مستعرضة إلى المحور septo الزمني للالحصين.
- وضع شرائح على مإدراج الثقافة ليرة لبنانية (حوالي 6 شرائح لكل إدراج)، واحتضان لهم في 6 لوحات جيدة مع 1 مل لكل بئر من الحضانة المتوسطة (47 مل MEM، 25 مل النسر متوسطة، 25 مل مصل الحصان، 1 مل glutamax I، 1 مل من معقم حل 10٪ الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.3) في جو مرطب مع CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في اليوم التالي وبعد ذلك كل يوم ما يصل إلى 1 في الاسبوع الآخرين.
2. في المختبر نقص الأكسجة والأوكسجين الجلوكوز الحرمان مع إعادة إشباع الخلايا
- انظر الجدول رقم 1 لجدول زمني دقيق لهذا الإجراء. EHOSCs الثقافة لمدة 5 أيام (DIV5) قبل التعرض لنقص الأكسجين أو OGD. عند هذه النقطة وقت تبديل المتوسطة من الحضانة المتوسطة التي تحتوي على 25٪ مصل الحصان إلى المتوسطة المصل الحرة مع التشكيل التالي: Neurobasal متوسطة مع 2٪ ملحق B27، 1٪ glutamax والإضافي الجلوكوز بنسبة 0.1٪.
- إعداد المتوسطة OGD كما هو مفصل في مرجع 7. وتركيزات النهائية من المكونات سوف تكون على النحو التالي: 0.3مم CaCl 2، 70 مم كلوريد الصوديوم، 5.25 مم 3 NaHCO، 70 ملي بوكل، 1.25 ملم ناه 2 ص 4، 2 مم MgSO 4، و 10 ملي السكروز في درجة الحموضة 6.8. إضافة 1 مل من OGD المتوسط إلى كل بئر من اثنين 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة.
- يروي المتوسط OGD مع N 2 لمدة 1 ساعة في غرفة نقص الأكسجة ثم ختم والحفاظ O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- استخدام شرائط اللاهوائية كمؤشرات ميتة. النظر في المتوسط إلى أن تكون الأكسجين الحر عندما يتغير لون الشرائط من الوردي إلى الأبيض.
- لتحريض نقص الأكسجة، واستخدام المصل المتوسطة الحرة مع الجلوكوز بدلا من OGD المتوسطة. قبل الاستخدام، يروي المتوسطة مع N 2 في غرفة نقص الأكسجة على النحو المفصل أعلاه لOGD المتوسطة.
- قبل أن يتعرض لشرائح OGD، يروي المتوسط OGD مرة أخرى مع N 2 لمدة 30 دقيقة. إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل يوديد propidium (PI) حل لكل بئر (لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل) إلى شرائح لمدة 30 دقيقة وحددفقط شرائح صحية للتجريب كما يتضح من انخفاض عدد خلايا إيجابية PI.
- استخدام الجدول الزمني للتعرض OGD وضخه هو مبين في الشكل 1. حرمان شرائح إما الأكسجين فقط (نقص الأكسجة) أو الأكسجين والجلوكوز (OGD) لمدة 15 دقيقة.
- لتحريض نقص الأكسجة أو OGD، ونقل إلى شرائح OGD المتوسطة والحفاظ على لمدة 15 دقيقة في غرفة نقص الأكسجة. التأكد من أن جميع السوائل التي تبقى على الجانبين من إدراج ويستنشق بعيدا عندما يتم تبديل الثقافات من المتوسط منتظم لOGD المتوسطة والظهر.
- بعد نقص الأكسجين أو OGD، استبدل المتوسطة OGD مع المصل الاوكسيجين المتوسطة مجانا ويسمح الثقافات لاستعادة ل3، 24 أو 48 ساعة في المتوسط المصل مجانا في الحاضنة العادية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إضافة PI مرة أخرى قبل التثبيت لتحديد موت الخلية.
3. العلاجات الدوائية من Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط
- الثقافيهEHOSCs ه لمدة 5 أيام (DIV5) في الحضانة المتوسطة قبل التعرض للعلاجات الدوائية. بدء العلاجات الدوائية إما خلال أو مباشرة بعد OGD OGD عندما يتم نقلها إلى شرائح متوسطة المصل مجانا.
- علاجات للحماية من OGD.
- إضافة 100 ميكرومتر-6-7-سيانو nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) أو 1 سم الأسماك الرباعية الأسنان ميكرومتر (TTX) إلى مستنبت خلال OGD التحريض (لمدة 15 دقيقة) أو مباشرة بعد OGD تحريض لمدة 30 دقيقة. ثم، في احتضان normoxic مصل المتوسطة مجانا لمدة 48 ساعة قبل التثبيت.
- علاجات لتحريض الموت excitotoxic المواد.
- بعد 5 أيام في الحضانة الثقافات المتوسطة التحول إلى المتوسطة المصل الحرة تحتوي على 100 ميكرومتر (RS) -α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا) لمدة 30 دقيقة.
- إزالة مستنبت تحتوي أمبا بواسطة الشفط (الحرص على إزالة أي وسيط المتبقية على إدراج)، ثم نقل إلى شرائح جديدة مع لوحات طبيعية مصل المتوسطة الحرة والاحتفاظ بها لمدة 48 ساعة حتى تثبيت.
4. تثبيت والمناعية من Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط
- يوديد propidium (PI) تلطيخ.
- إضافة PI لمدة 30 دقيقة إلى مستنبت من شرائح يعيشون بتركيز 2 ميكروغرام / مل. عرض الثقافات الحية مع مجهر مقلوب مجهزة مضان البصريات وتحديد شرائح لمزيد من العلاج. لتلطيخ PI في تركيبة مع المناعية، إضافة حل PI 30 دقيقة قبل التثبيت من الثقافات.
- تثبيت للشرائح.
- إزالة مستنبت من لوحة 6 جيدا وإضافة 3 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) إلى كل بئر. ثم ضع لوحة 6 جيدا في الثلاجة وإصلاح O / N في 4 درجات مئوية.
- إزالة الحل PFA في اليوم التالي وتغسل شرائح 3-4 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إزالة شرائح من ط زراعة الخلاياnsert ومنع إجراء المناعية المقاطع التعويم الحر.
- فصل بعناية وإزالة شرائح من إدراج الثقافة باستخدام فرشاة الطلاء فن حجم 0 أو أصغر. نقل كل شريحة الفردية في بئر من 96 لوحة جيدا مليئة عرقلة العازلة (PBS مع 3٪ مصل الماعز العادي (خ ع) و 2٪ تريتون-X100). الحفاظ على شرائح في المخزن المؤقت حجب لمدة 2 ساعة على RT في إطار التحريض المستمر من قبل شاكر المداري.
- المناعية من الثقافات شريحة
- لوصفها الأوعية الدموية تستخدم بولكلونل مكافحة laminin في التخفيف من 1: 200 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100.
- لوضع العلامات الخلايا العصبية تستخدم لمكافحة أنيبيب المرتبطة بروتين 2 (MAP2) في التخفيف من 1: 500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100.
- احتضان شرائح مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع التحريض المستمر. بعد فترة الحضانة، وغسلها في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ تريتون-X100 لمدة 3-4 مرات. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100. احتضان الشرائح لمدة 2 ساعة في RT في الظلام مع اليكسا fluorophore الأجسام المضادة الثانوية مترافق. استخدام الماعز المضادة للأرنب المناسب أو الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق لاليكسا 350 أو 488.
- إزالة حل الضد الثانوية وتغسل شرائح ثلاث مرات مع المالحة تريس مخزنة (TBS). جبل لهم على الشرائح الزجاجية وساترة الشرائح مع Mowiol.
- المجهري للشرائح الملون
- عرض شرائح الملون إما على المجهر القياسية مع المعدات epifluorescence أو مع المجهر متحد البؤر. التقاط صور مع كاميرا المناسبة. لبعض الصور وعكس النقيض مضان من أجل انتاج السفن غامق ملطخة على خلفية مشرقة (الشكلان 5 و 6).
5. تحديد الكثافة السفينة الإقليمية في الثقافات
- قياس vesseكثافة لتر استنادا المعابر السفينة كما هو موضح في مرجع 8.
- استخدام شرائح الملون لlaminin لهذه القياسات. ركب الصور المسجلة من 10X التكبير مع شبكة 6 × 6، حيث كل شبكة تساوي 100 × 100 ميكرون لكل متر مربع، الحقل الكلي لل0.25 ملم 2.
- تراكب ثلاثة من هذه الشبكات في المنطقة CA1، CA3، DG، وEC (الشكل 2). عد السفن المارة خطوط من الشبكة.
- للحصول على نتائج ذات أهمية إحصائية جيدة، وجعل القياسات في لا يقل عن 3 تجارب مستقلة، بما في ذلك البيانات كل 3 من الجراء الفأر مع 3 شرائح في الماوس الجرو.
- تحديد متوسط قيمة المعابر سفينة من الشبكات لكل منطقة وإجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA مع تصحيح Bonferroni كما اللاحق اختبار (P <0.05 يعرف أهمية و) باستخدام برنامج إحصاءات المناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحرمان من الجلوكوز والأكسجين نقص الأكسجة لحث على موت الخلايا العصبية والحد من الأوعية الدموية وتحديدا في المنطقة CA1 الحصين.
OGD أو الأكسجين الحرمان وحده لمدة 15 دقيقة يسببها التعريفي قوي من موت الخلايا كما يراها يوديد propidium تلطيخ تحديدا في منطقة CA1 من الحصين (الشكل 3) مماثل كما هو موضح سابقا 7. مع علامات لتصور شبكة الأوعية الدموية، تبين أن كثافة الأوعية الدموية وتنظيم بدت مشابهة لعنصر التحكم بعد التحدي OGD في معظم أنحاء ثقافة باستثناء المنطقة CA1. كان هناك انخفاض كثافة الأوعية الدموية وتعطل شبكة الأوعية الدموية جزئيا (الشكل 3، E و F). واعتبرت هذه التغيرات فقط في المنطقة حيث تمت زيادة تلطيخ يوديد propidium.
على مدار الساعة من التغيرات الوعائية يوازي ذلك من neurانحطاط اونال.
درسنا مدار الساعة من كل من الخلايا العصبية انحطاط وفقدان الدم في الأوعية CA1 باستخدام نقاط الوقت 3 ساعة، 24 ساعة و 48 ساعة بعد الحرمان من الأكسجين (نقص الأكسجة). في آخر 3 ساعة نقص الأكسجة، لم يكن هناك يوديد propidium تلطيخ مرئية وكانت هناك أي تغييرات الحالية في العمارة الأوعية الدموية مشيرا إلى أن في هذا الوقت أي تغييرات كانت واضحة بعد (الشكل 4، A و B). في آخر 24 ساعة كان هناك نقص الأكسجة ظهور يوديد propidium تلطيخ يدل على تطور موت الخلايا في CA1. عند هذه النقطة كان الوقت بالانزعاج شبكة من الأوعية الدموية وبالفعل ضاعت الأوعية الدموية في المنطقة CA1 (الشكل 4، C و D). كلا، أصبح تلطيخ يوديد propidium وفقدان الأوعية الدموية أكثر وضوحا في آخر 48 ساعة نقص الأكسجة (الشكل 4، E و F).
كلا موت الخلايا العصبية ويتم منع فقدان الأوعية الدموية عن طريق منع الإثارة بعد OGD أو نقص الأكسجة.
عندما كنا جنبا إلى جنب مع العلاجات الدوائية OGD التي حالت دون إطلاق سراح الغلوتامات الزائدة، وكان من الممكن لانقاذ الخلايا العصبية من موت الخلايا OGD التي يسببها. العلاج مع TTX (الذي يثبط عمل جيل محتمل قد ينتج في إسكات محطات وارد) أو العلاج مع CNQX (الذي يثبط أمبا مستقبلات الغلوتامات من نوع) الخلايا الهرمية CA1 انقاذهم من موت الخلايا العصبية (الشكل 5، D و F). وتشير هذه النتائج أن وفاة الخلايا العصبية بعد OGD بوساطة عمل excitotoxic المواد الغلوتامات. بعد هذه العلاجات، وليس فقط منع موت الخلايا العصبية، ولكن أيضا تم الحفاظ على سلامة السفينة ومنعت فقدان الأوعية الدموية في CA1 (الشكل 5، C و E).
العلاج أمبا الحث على نطاق واسع وفاة الخلايا العصبية excitotoxic المواد في بو الحصينيقتصر ر فقدان السفينة إلى CA1.
OGD كما استخدمت في هذه الدراسة يدفع الموت تحديدا في الخلايا العصبية CA1. في المقابل، والمعاملة مع 100 ميكرومتر أمبا لمدة 30 دقيقة يسببها فقدان الخلايا العصبية على نطاق واسع في قرن آمون كامل الحصين (CA1 CA3 و) ومرفد ولكن ليس في التلفيف المسنن (الشكل 6C). ومن المثير للاهتمام، اقتصر فقدان الأوعية الدموية إلى المنطقة CA1، على الرغم من فقدان الخلايا العصبية مماثلة في CA3 لم يكن هناك فقدان الأوعية الدموية في هذه المنطقة (الشكل 6D). في التلفيف المسنن كان هناك لا موت ولا الأوعية الدموية فقدان الخلايا العصبية. القياس الكمي لكثافة السفينة يؤكد أن الأوعية الدموية تضيع في CA1، ولكن ليس في مناطق أخرى من ثقافة الشكل 6E.
الرقم 1. جدول التعرض OGD وreperfusioن. بعد يتعرضون 5 أيام في المختبر الثقافات إلى OGD، نقص الأكسجة أو المعاملة أمبا. يتم إصلاحها الثقافات بعد وقت بقاء 3 ساعة، 24 ساعة و 48 ساعة.
ومضافين الشكل 2. الكمي لكثافة الأوعية الدموية في مناطق مختلفة من الثقافات شريحة entorhino الحصين. ثلاثة 6 × 6 شبكات (كما هو موضح هنا المربعات) في المنطقة CA1، CA3، DG، والمفوضية الأوروبية. احصي الأوعية الدموية عبور خطوط الشبكة الداخلية لكل مربع.
الرقم العلاج 3. نقص الأكسجة يستحث موت الخلايا العصبية وفقدان الأوعية الدموية في CA1. (A،C، E) الثقافات السيطرة، (B، D، F) الثقافات تخضع للعلاج نقص الأكسجة تليها 48 ساعة من normoxia. المناعية Laminin في التكبير المنخفض باللون الأخضر (A، B)، وتلطيخ PI في أعلى التكبير في الحمراء (C. D)، دمج الصور للlaminin وPI تلطيخ في (E) و (F). أشرطة النطاق في (B ل A، B) و (F للC، D، E، F) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. وقت مسار التغييرات الوعائية والعصبيةانحطاط بعد الحرمان الأكسجين (نقص الأكسجة). تلطيخ PI باللون الأحمر هو مبين في (A، C، E)، دمج الصور للPI تلطيخ وlaminin (الأخضر) هو مبين في (B، D، F). في 3 ساعة بعد العلاج نقص الأكسجة، ليس هناك تلطيخ PI المرئي وأي تغييرات الأوعية الدموية واضحا (A، B). بعد 24 ساعة يخرج PI تلطيخ وفقدان الأوعية الدموية واضح أيضا (C، D). كلا تلطيخ PI وفقدان الأوعية الدموية تصبح أكثر وضوحا بعد 48 ساعة (E، F). شريط النطاق في (F) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5.؛ ومنع موت الخلايا العصبية والأوعية الدموية الخسارة حاصرات من الإثارة العصبية تطبيق إما TTX (C، D) أو CNQX (E، F) منعت كلا فقدان الخلايا العصبية كما رأينا مع تلطيخ PI (B، D، F) والأوعية الدموية. فقد كشفت من قبل laminin تلطيخ (A، C، E). OGD يدفع وحده كلا فقدان الخلايا العصبية وفقدان الأوعية الدموية في CA1 (A، B). شريط النطاق في (F) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. العصبية الموت وفقدان الأوعية الدموية بعد العلاج أمبا. المعاملة مع 100 ميكرومتر أمبا لمدة 30 دقيقة يسببها على نطاق واسعظلت فقدان الخلايا العصبية في معظم مناطق قرن آمون (C)، ولكن فقدان الأوعية الدموية المحظورة إلى CA1 منطقة (D). شريط النطاق في (D) = 100 ميكرون. الكمي الأوعية الدموية يؤكد فقدان انتقائية في المنطقة CA1 (E). وتبين الأعمدة متوسط عدد المعابر السفينة، أشرطة الخطأ تبين SEM. يشار إلى اختلافات كبيرة مع ل** P <0.01. وقد استمدت النتائج من ثلاث تجارب مستقلة مع ثلاث ثقافات تحليل كل (ن = 9) لكل منطقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الوقت | العمل |
| DIV 4 | إعداد OGD أو نقص الأكسجة المتوسطة |
| DIV 4 | يروي OGD أونقص الأكسجة المتوسطة مع N 2 لمدة 1 ساعة في غرفة نقص الأكسجة ثم ختم والحفاظ O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية |
| DIV 4 | تبديل الثقافات لNeurobasal مصل المتوسطة مجانا + الجلوكوز من الحضانة المتوسطة، والسماح لهم بالراحة O / N أو 1 اليوم |
| DIV 5 | يروي المتوسط OGD مرة أخرى مع N 2 لمدة 30 دقيقة |
| DIV 5 | إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل يوديد propidium (PI) حل لكل بئر (لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل) إلى شرائح لمدة 30 دقيقة وحدد شرائح صحية فقط للتجريب كما يتضح من انخفاض عدد خلايا إيجابية PI |
| DIV 5 | تمتص قبالة المتوسطة العادية وإضافة OGD المتوسطة إلى الآبار. التأكد من أن جميع السوائل التي تبقى على الجانبين من إدراج ويستنشق بعيدا عندما يتم تبديل الثقافات من المتوسط منتظم لOGD / نقص الأكسجة المتوسطة والظهر. نقل لوحة لغرفة نقص الأكسجة |
| DIV 5 | يروي مع N 2 لمدة 15 دقيقة في غرفة نقص الأكسجة |
| DIV 5 | إزالة لوحة من الغرفة. التبديل إلى Neurobasal المتوسطة ووضع مرة أخرى في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 |
| DIV 5 | إضافة PI وإصلاح 3 ساعة بعد OGD / نقص الأكسجة لفترة 3 ساعة |
| DIV 6 | إضافة PI وإصلاح 24 ساعة بعد OGD / نقص الأكسجين لفترة 24 ساعة |
| DIV 7 | إضافة PI وإصلاح 48 ساعة بعد OGD / نقص الأكسجين لفترة 48 ساعة |
الجدول الزمني المفصل 1. تسلسل من الخطوات لعلاج OGD / نقص الأكسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع الأساليب المعروضة هنا، الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط يمكن استخدام أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة. في حين الثقافات شريحة عضوي النمط وقد استخدمت في الماضي لدراسة ردود الفعل العصبية بعد نقص التروية 6، 7 الجانب الجديد من الدراسة في وقت واحد من التغيرات الوعائية يعزز بشكل كبير من التطبيقات المحتملة لهذا الأسلوب. تحريض OGD أو نقص الأكسجة وحدها يمكن تطبيقها بوسائل بسيطة إلى حد ما في الثقافات شريحة عضوي النمط ويؤدي إلى الضرر موثوقة وقابلة للتكرار في الأنسجة العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن النهج ثقافة شريحة يسمح ليس فقط يدرس عواقب التحدي الدماغية كنه يسمح أيضا لاختبار التدابير العلاجية المحتملة التي تهدف إلى العصبية. لذا الثقافات شريحة هم أداة جذابة وهامة لدراسة إصابات الدماغ الدماغية.
الطريقة المعروضة هنا هي سهلة التنفيذ لجميع المختبرات هكتارفينج بعض الخبرة مع الثقافات شريحة الجهاز العصبي المركزي. تطبيق OGD أو نقص الأكسجة يتطلب موازنة دقيقة للمستنبت مع N 2 من أجل تحقيق نتائج استنساخه. من المهم أن استخدام شريحة الثقافات الوحيدة مع انخفاض عدد الخلايا PI إيجابي قبل تطبيق OGD أيضا. ظروف نقص الأكسجين (أي الوقت الذي نقص الأكسجة أو OGD يتم تطبيقها) يمكن أن يكون متنوعا والأمثل وفقا لنوع من الثقافة شريحة المستخدمة.
في حين أن ردود الفعل العصبية لنقص التروية وقد درس على نطاق واسع هو فقط هناك القليل من المعلومات المتوفرة حول التغيرات الوعائية بعد إصابات الدماغ الإقفاري بنقص التأكسج. وجدت أن الأوعية الدموية وحتى علامات من حاجز الدم في الدماغ يتم الاحتفاظ بها في الثقافات شريحة عضوي النمط لمدة تصل إلى أسبوع 8، 9 فتحت الفرصة لدراسة التغيرات في الأوعية الدموية بعد التحدي نقص الأكسجة في تحديد الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط 10. وبطبيعة الحال فإنه يحتاج إلىأن أدرك أن السفن التي يتم الاحتفاظ بها في الثقافات شريحة لا perfused ل. وعلاوة على ذلك، لاحظنا الاختلافات في فقدان-الأوعية الدموية موجودة مسبقا بدلا من تشكيل واسعة من الأوعية الدموية الجديدة. هذا النظام هو النموذج، لذلك، ربما ليس الأمثل لدراسة تشكيل السفن الجديدة بعد إهانة الدماغية.
إمكانية استخدام عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين لاستجلاء مزيد من التفاعل المعقد بين الخلايا العصبية والأوعية الدموية يفتح مجال جديد للدراسة وعود للمساعدة في التوصل إلى فهم أفضل للووضع خيارات جديدة لعلاج الاضطرابات الوعائية العصبية، وخاصة بعد نقص التروية الدماغية السكتة الدماغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية في 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) وكان تاريخ والسماح من قبل السلطات السويسرية. الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جامعة بازل، قسم الطب الحيوي، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_141007). قدم ماركوس Saxer الدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
