Abstract
分子モーターは、ニューロン内の小胞の貨物を輸送するために彼らの活動を調整するメカニズムを理解することは、単一の小胞レベルでのモータ/貨物協会の定量分析を必要とします。このプロトコルの目的は、組成物及び貨物に関連付けられているモータの相対量は、ライブ貨物の移動（「マップ」）の位置と方向を相関させるために、定量的蛍光顕微鏡を使用することである。 「カーゴマッピングは「ライブのライブ運動の記録中に化学固定に続いてマイクロ流体デバイス上で培養した軸索に移動、蛍光標識された貨物のイメージング、およびモータに対する抗体を用いた、まったく同じ軸索の領域のその後の免疫蛍光（IF）染色で構成されています。貨物およびそれらに関連するモータ間の共局在は、サブピクセル位置を割り当てることによって評価される回折李にガウス関数をフィッティングすることにより、モータ及び荷役チャンネル座標個々の蛍光点光源を表すmited点広がり関数。固定された貨物とモータの画像は、その後、彼らの追跡軌跡にそれらを「マップ」するために、荷動きのプロットに重畳される。データは、生細胞内の小胞貨物の輸送の両方を記録するために、これらのまったく同じ小胞に関連したモータを決定する場合は、このプロトコルの強さは、ライブの組み合わせですと。この技術は、これらの方法は、単一の移動貨物上の組成物を明らかにしないように、精製された不均質バルクベシクル集団の平均運動の組成を決定するために、生化学的方法を使用して、前の課題を克服する。さらに、このプロトコルは、それらのタンパク質組成を有する個々の細胞内構造の動きを相関させるために他の細胞型で他の輸送及び/又はトラフィッキング経路の分析に適合させることができる。このプロトコルの制限事項は、培養の低いトランスフェクション効率に起因する比較的低いスループットである一次ニューロンおよび高分解能イメージングのために使用可能な制限された視野。将来のアプリケーションには、蛍光標識された貨物を発現するニューロンの数を増加させる方法を含むことができる。
Introduction
細胞内輸送は、種々の細胞ドメイン1へのタンパク質、膜、細胞小器官、およびシグナル伝達分子を送達するための全ての細胞型において非常に重要です。ニューロンは、批判的にさまざまな軸索マイクロドメインへの長距離配信のために不可欠な貨物の細胞内輸送に依存して長く、偏予測と高度に特殊化した細胞である。二つの大きな分子モータータンパク質のファミリ - - この輸送はキネシンとダイニンによって媒介される貨物に結合すると、それぞれ、順行と逆行方向に偏光した微小管に沿って追跡する。逆行移動は主にダイニンによって媒介されるが、順行方向の移動は、キネシンモーターの大きい、機能的に多様なファミリーによって促進される。その結果、軸索貨物の順行性輸送は、キネシンスーパーファミリー1-5の様々な家族によって媒介される可能性があります。一部の貨物は、どちらの方向にも持続的にメートルを移動しますがOST貨物は双方向に移動し、その最終的な目的地1,5-13に向かう途中で頻繁に逆転。さらに、示されている、貨物同時に指向性会合に対向する貨物の移動が規制反対の極性モータ5-7によって調整されるかという疑問を上げるモーター。一緒に、軸索貨物の輸送はモーターと順番に様々なアダプタおよび規制上の結合パートナー14に依存している彼らの特異的な生化学的な活動、の組成によって調節されている協調プロセスです。
忠実に特定の貨物軸索輸送のメカニズムを説明するために、その輸送の基礎となる規則を発見するためには、ライブの輸送中に、個々の貨物に関連付けられたモータータンパク質とその調節結合パートナーの組成を決定するために最も重要である。他の方法は、例えば生化学的アプローチのために、平均のmotの推定値を提供するまたは精製された異種のベシクル集団上の組成が、これらの推定値は、単一の移動小胞に関連するモータの種類や金額を明らかにしない。また、in vitroで 、予め組み立てられた微小管に沿った小胞輸送の再構成は、単一の小胞のレベル15で、モータの一種の量を測定可能にした。しかし、これらの実験は、直接これらの小胞の輸送特性のモータの量を相関し、細胞調節因子の非存在下での輸送を測定しなかった。
内因的に測定する（IF）データはモータータンパク質を発現した免疫蛍光からの個別の移動小胞の運動組成物（タイプとモーターの相対的な量）を決定し、ニューロンにおける正確に同じ小胞のライブトランスポートにこれらのパラメータを関連付けるここに提示されているプロトコル16。この方法は、IF存続荷物移動データの正確なマッピングを必要とする。これはgrowinことによって達成される確立されたプロトコルの17-19を以下のマイクロ流体デバイスにおけるG海馬マウスのニューロン。これらのデバイスは、固定とライブ光学顕微鏡モダリティにおける軸索および単一可動貨物の識別と相関関係 （「マッピング」）（ 図1）を可能にします。培養されたニューロンは、その輸送kymographsにプロットされている詳細な移動情報を取得するために、高い空間分解能及び時間分解能で画像化された蛍光標識された貨物のタンパク質をトランスフェクトする。画像化の過程で、神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、その後、内因性のモータータンパク質に対する抗体で染色した。固定された貨物とモータの画像は動きが16軌道ライブ貨物にそれらを「地図」（共局在）するライブ移動kymographsに重畳されている。モータータンパク質との会合を持つ貨物のライブの動きを相関させるために、共局在は、「Moを呼ばれるカスタムメイドのMATLABソフトウェアパッケージを用いて分析されているTOR共局在」16,20。蛍光標識された貨物とモーターが部分的に重複することができ、回折限界点状の特徴を生成する。涙点の重複の位置を解決するために、ソフトウェアが最初に自動的にそれらの正確なXYサブピクセル位置座標を決定するために、個々の蛍光涙点を表し、それぞれの点広がり関数をガウス関数に適合し、強度が21-23振幅。モータや貨物の位置である続いて共局在16,20を決定するために、互いに比較した。したがって、この方法は、より正確に、他の方法24に比べて、蛍光涙点間の共局在を割り当てる。
この方法の強みは、ライブの移動軌跡（例えば、それらは定着時に移動された方向）のrecされているために、固定された細胞内の個々の貨物とモータの共局在化を評価する能力であるorded。この方法では、キネシンおよびダイニンは、（のPrP Cの -cellular）双方向に移動させ、あるいは軸索16で静止したままでneuronally富化貨物を正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞に同時に関連付けることが見出された。この分析は、貨物に関連しながら、順行（キネシン）と逆行（ダイニン）モータがどちらの方向に小胞を移動するか、静止したままにするために彼らの活動を調整するPrP Cから小胞の動きの調節をワーキングモデルの定式化を可能にした。この方法の別の強さは、目的の任意の他のタンパク質（単数または複数）と、実質的に任意の細胞型の中で移動する多数の蛍光標識された貨物の共局在化/会合を特徴付けるためのその潜在広い適用である。多くの個々の蛍光を移動する粒子が所望のページを介して分析することができる標識したがって、生/固定された相関関係は、潜在的に、一過性のタンパク質 - カーゴ相互作用の検出を可能にすることができ時間のeriod。幅広い適用性と、このメソッドが対処できる質問の種類を考えると、このプロトコルは、ニューロンまたは他の細胞型のもの勉強人身売買および輸送を含む細胞生物学者の幅広い視聴者を対象としています。
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Protocol
全ての実験は、承認されたプロトコールに従い、研究動物の人道的なケアのための施設のガイドラインに従って行った。新生児マウスは断頭により安楽死させた。
細胞培養のためのマイクロ流体デバイスの作製
- ハリスと同僚17-19によって記載されているように海馬ニューロンの成長のためにポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスを準備します。下の貨物マッピングプロトコルに適応させたいくつかの変更があります。
注：マイクロ流体デバイスはまた、（材料リスト）は市販されている、製造設備への、したがってアクセスは不要である。 - それらを100％エタノールで3回洗浄し、水で3回洗浄し、アセトンで3回洗浄することによって番号1.5カバーガラス（24×40 mm）を準備する。使用するまで4℃の水に保管してカバースリップ。これらの治療はカバースリップはCELのメッキを妨害する可能性のある破片からクリーンであることを確実に助けるlsは、汚染、および生存。
注：アセトン、エタノールを吸入、経口摂取のため、可燃性や眼への接触（刺激性）の皮膚接触（刺激物）の場合には危険である。公式規則に従って廃棄してください。 - 場合には、使用のマイクロ流体デバイスあたり60ミリメートル細胞培養皿一つのカバーガラスを配置し、それを空気乾燥は、汚染を避けるために生物学的安全キャビネット内で45分間覆わせて準備ができて。
- デバイスがマスターとパンチから切り出された後、殺菌のために45分間のUVランプを装備した安全キャビネット内部のマイクロ流体チャネル側アップでそれらを置いて、貯水池（ 図1A、B）を作成するためにカットされている。
注：2時間よりも長い間UV処理中のデバイスを残すことはPDMSの完全性に影響を与える可能性がある。 - マイクロ流体チャンネルが下向きになるように60ミリメートルのプラスチック細胞培養皿の内側に各カバーガラス上に一つのデバイスを配置することによって、デバイスを組み立てる。トップOに穏やかな圧力をかけるデバイスfをカバーガラスにデバイスの非常任シールを提供する（マイクロチャネルには手を触れないでください）。ふた付き各60ミリメートル細胞培養皿をカバーしています。
- マイクロピペットを用いて、水が通って流れることを可能にする、上の2つのマイクロ流体リザーバ（ 図1A中の1と2）の細胞培養グレードの水を加えることによってデバイスを水和する。マイクロピペットで水を除去し、マイクロ流体リザーバー1（200μL）および2（100μL）に1 mg / mlのポリ-L-リジンを追加します。体積差は、マイクロチャネル（ 図1A、B）を介して流れるように、ポリ-L-リジンを可能にする。
- 60ミリメートルの細胞培養皿内のデバイスは、37℃のインキュベーターの内部に転倒しないように150mmのプラスチック製の細胞培養皿にデバイスを含む3つの60mmの細胞培養皿に置き、蓋付き皿を覆う。 5％CO 2、37℃のインキュベーター中でO / Nインキュベートする。典型的には、チャネルの90％以上は、デバイスごとに使用可能であると行う気泡または物理的閉塞が含まれていませ。
- 翌日、水とポリ-L-リジンを交換し、少なくとも1時間インキュベーター内でデバイスを残す。この洗浄を3回繰り返します。水を除去し、各デバイスにたNeurobasal-（2％、B-27サプリメント及び500μMのグルタMAXを含む）増殖培地を追加します。 5％CO 2で37℃のインキュベーター内でO / Nのままにしておきます。
- 後述のように次の日に、海馬細胞をプレート。
マイクロ流体デバイスでのマウスの海馬初代神経細胞の2めっき
注：新生児ラットから培養海馬神経細胞の調製は、以前にJoveの25に掲載されました。以下の微小流体デバイスでプレートマウス海馬神経細胞に適応させたいくつかの変更があり、それがトランスフェクションのために最適であった。
- マウス脳を解剖前に、前加温ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含む10％ウシ胎児血清（FBS、抗生物質を含まない）、混合物A（125 mgのDL-システイン、125 mgのウシ血清アルブミン（BSA）およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）500ml中のD-グルコースの3.125グラム、フィルタは0.22μmフィルターを通して滅菌） 37℃の水浴中で：、およびデオキシリボヌクレアーゼI溶液（50 DNアーゼI 20mgおよび1.2 100におけるMをMgSO 4溶液mlのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）フィルターを0.5ml、0.22μmのフィルターを通して滅菌DNアーゼI）。
- 前加温するNeurobasal-pHを平衡化するために、5％CO 2、37℃インキュベーター内の成長培地。
- 確立されたプロトコール26に従って1-3日齢の新生児マウスから海馬を解剖。氷の上で、（10mMのHEPES pH7.4の、50mMグルコース、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを含むHBSS）10ミリリットル解剖緩衝液を含む15ミリリットルコニカルチューブ内で海馬を保つ。 15ミリリットルコニカルチューブあたり4海馬まで置く。
- 残りのプロトコルを実行すると、無菌状態下にあるバイオセーフティキャビネット内のsである。
- 混合物Aを5mlのパパインの45単位を希釈、ボルテックス、及びパパイン粉末が溶解するまで37℃で5分間インキュベートする。 DNアーゼI溶液の1ミリリットルを追加します。 0.22μmのシリンジフィルターユニットを通して混合物を濾過する。
- 15ミリリットルコニカルチューブを含む海馬から慎重に吸引HBSS」。追加10ミリリットルの冷（4℃）HBSS海馬に、それらを、チューブの底に沈殿させ。慎重に15ミリリットルコニカルチューブからHBSSを吸引。
- 私は最大4海馬に混ぜ、37℃で20〜30分間インキュベート1ミリリットルパパイン/ DNアーゼを追加します。ミックスと海馬を入浴コニカルチューブを5分ごとに傾けます。代わりに穏やかに振盪（〜100 rpm）で37℃水浴シェーカーで海馬を置く。
- 吸引パパイン/ Iを混合し、10％FBSを含有する予め温めたDMEM（37°C）で海馬回洗浄アーゼ。
- 2回目の洗浄の後、2海馬、10％のFBSを含有する予め温めたDMEMを加え、ピペッティングにより手動粉砕物海馬を追加上下〜ニューロンを解離た1mlピペットチップを用いて10〜12倍である。
- これは非解離ニューロンはコニカルチューブの底に沈殿することを可能にするように粉砕物は、〜1分間沈降しましょう。含むトランスファー上清をチューブの底に沈降した大きな組織の移動を回避する新たな15ミリリットルの円錐管にニューロンを解離。
- 2分間千×gで細胞をスピンし、慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を除去。穏やかにピペッティングすることによって80μlの神経基本成長培地中で細胞を再懸濁する。
- マイクロ流体リザーバー1,1 'からメディアを取り出します。マイクロ流体リザーバー1への細胞を20μl（〜275000）を適用し、それらが通過流れるようになります。 20分間、5％CO 2、37℃インキュベーター内の場所デバイス。
- 細胞がカバーガラスに付着していることを確認するために顕微鏡下で見てください。すべての貯水池をオフに先頭にしたNeurobasal-増殖培地を追加します。 5％のCOを用いて37℃のインキュベーターに細胞を持つデバイスを返す
- 蒸発を避けるために、デバイスごとに〜2〜3日としたNeurobasal-（グルタMAXなし）を含む2％のB-27サプリメントでトップオフ貯水池を確認してください。ニューロンは〜2-3日、めっき後のマイクロ流体チャネルを介してその軸索を拡張するために開始します。 7-10日めっき後、通常、トランスフェクションの対象とニューロン。
マイクロ流体デバイスで栽培海馬ニューロンのトランスフェクション3
- デバイスごとに、30μlのたNeurobasal-Aの1.2μlのリポフェクタミン2000のミックス、および30μlのたNeurobasal-Aの0.5μgの蛍光貨物融合プラスミドのミックスを調製し、室温で5分間インキュベートする。リポフェクタミンをDNA混合物に混合し、RTで20分間インキュベート加える。 DNAにしたNeurobasal含有4％、B-27サプリメント60μlのを追加/リポフェクタミンは、チューブをフリックで混ぜ混ぜ。
- 「マイクロ流体貯蔵器2及び2からすべてのメディアを取り外し、慎重に媒体int型の上にこぼすことなく、2％のB-27サプリメントを含むたNeurobasal-Aと井戸を埋める他の区画O。
- マイクロ流体リザーバー1,1 'からメディアを取り出します。マイクロ流体リザーバーを1に混ぜ、それが流すのDNA /リポフェクタミン120μlのを追加します。 3-4時間、5％CO 2で37℃のインキュベーターにデバイスを返します。
- 「マイクロ流体リザーバー1,1からすべてのメディアを取り出し、24時間たNeurobasal-含む2％のB-27サプリメントと交換（または直前まで、画像へ）。典型的には、マイクロチャネルを通じて成長5-7軸索は約海馬培養細胞26に公開の効率と一致1~3％のトランスフェクション効率を表すもの条件下でトランスフェクトされる。
4.「貨物マッピング」分析
- 荷動きのライブイメージング
- 37℃のインキュベーターとCO 2制御室を備えた倒立落射蛍光光顕微鏡で撮影を行う。
- MICRで栽培海馬ニューロンとカバースリップをマウント顕微鏡ステージ上にofluidicデバイス。神経細胞死を回避するためには、もはやより1時間顕微鏡でサンプルを維持するために迅速に動作します。
- 高分解能対物レンズ（100X）を使用して、マイクロ流体チャンバのチャネルを通って延び、トランスフェクトされた軸索が検出されたチャネルの数を記録してトランスフェクトされた細胞の軸索を見つける。ハンドタリーカウンターを用いてチャネルの数を数える。
- ライブの動きとその後の共局在解析の最適な記録のために、ほとんどの小胞のイメージングがフォーカスして行うことができるようにチャネルを介して比較的平坦な成長軸索を選択します。
- 1ミリリットルプラスチック製トランスファーピペットと貯水池2,2 'からの媒体のほとんどを除去。 kymographs上の移動軌跡と定着画像のその後の位置合わせを容易にするために、画像化（ 図1B、C）の間に視野を有するマイクロチャネルの右端を揃える。
- フィクサンを容易にするために撮影時のサンプルのgが、2人とライブイメージングを行う。ライブイメージングは、一人の人間によって実行される場合に代替的に、ドリフト補正を備えた顕微鏡システムを使用する。
- （ 図2および物質一覧の伝説に指定されているYFP-PrP Cからを画像化するための顕微鏡の仕様や設定）タイムラプス分析されている貨物の輸送ダイナミクスに固有の仕様にイメージングライブ貨物移動を開始。
- 十分なライブ運動データが収集された後、一人が、細胞を固定するために0.04グラム/ mlのショ糖を含むPBS中で予め温めておいた4％パラホルムアルデヒドで「リザーバ2,2を埋める必要があります。これはライブイメージングの焦点を混乱されるように、マイクロ流体デバイスに触れないようにしてください。固定剤が添加されている間、他の人はピントを合わせる必要があります。運動の即時停止が観察されたときに固定が成功した。その後1,1 'をリザーバ固定液を追加します。
注：一時photoblea貨物蛍光のチンも観察されることがありますが、モータータンパク質のためのIF染色は（次のステップ）を完了した後に蛍光が持続する。
注：パラが皮膚と接触して、吸入による有害である、と飲み込む。眼、呼吸器系および皮膚を刺激する。公式規則に従って廃棄してください。
- 共局在化分析のためのモータータンパク質の染色IF
注：個々の移動貨物に関連付けられたモータータンパク質の相対レベル（抗体染色によって決定される）の定量のために、検証および抗体 - 抗原結合が飽和されていることを確認するために抗体を滴定する。これは、目的のタンパク質がノックアウトまたはノックダウンのどちらかであったものであり、抗体濃度を増加させて分析IF実行することによって神経細胞を用いた抗体の特異性を決定することによって行われる。陰性対照のために、神経細胞は、一次抗体の非存在下における二次抗体で染色する。より詳細な抗体の検証の説明はEncalada ら 16、及びSzpankowski ら 20に見出すことができる。- 顕微鏡ステージからマイクロ流体デバイス中で成長海馬ニューロンとカバーガラスを外します。マイクロチャネルは、ライブおよび定着画像を重ね合わせるために無傷のままする必要があるように、カバースリップからマイクロ流体デバイスを取り外さないでください。湿度チャンバ内で、次の手順を実行します。
- マイクロチャネル内の溶液の流れを確保するために、少なくとも30μlにリザーバ1,1 '、及び2,2'との間のバッファ量の差を維持する。後続のすべてのステップで。例えば、マイクロ流体リザーバー2,2に100μlのメディアボリュームを追加」、およびマイクロ流体リザーバー1,1〜70μlのメディアボリューム」。
- マイクロ流体デバイスのチャンバーから固定液を取り出し、洗浄の間で10分待って、PBSで細胞を3回洗浄する。
- 0.1％トリトンX-100 DILUを加えることにより細胞を透過すべての貯水池への5分間PBS中テッド。
- すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで洗浄する。洗濯の洗浄の間に10分を待って3回繰り返します。
- すべてのリザーバーからの溶液を除去し、PBS中10％正常ロバ血清および3％プロテアーゼフリーおよび免疫グロブリンG（IgG）のフリーのBSAを含有するブロッキング緩衝適用し、室温で少なくとも30分間インキュベートする。
- 沈殿物を除去するために5分間20,000×gで一次抗体ストック溶液をスピン。ブロッキング緩衝液中で適切な濃度に抗体を希釈する。抗体溶液をマイクロ流体デバイスからブロッキングバッファーを交換してください。 4℃でRTまたはO / Nで2時間のためのサンプルをインキュベートする。
- すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、洗浄の間に10分を待っている。
- 沈殿物を除去するために5分間20,000×gで二次抗体ストック溶液をスピン。ブロッキング緩衝液中で適切な濃度に抗体を希釈する。二次抗体溶液を含むPBSを交換してください。インキュベートRTで1時間のサンプル。
- すべての貯水池から溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、洗浄の間に10分を待っている。
- 直接リザーバを接続通路の開口部にマウンティング培地をピペッティングすることにより〜10-20μlの封入剤を含むPBSを交換してください。室温で1時間 - 〜20分間メディアドライをマウントしてみましょう。
- 染色の二日（最大1週間）以内に退色を避けるために、光から保護し、4℃で保存する装置、および画像軸索。
- 染色が完了した後、顕微鏡ステージ上にマイクロ流体デバイス中で成長海馬ニューロンとカバースリップをマウントします。ステップ4.1.1-4.1.7で撮像されたトランスフェクトした軸索の地域を探します。
- 高解像度の目的（ 例えば、高開口数油または水客観）を使用して、貨物、モータ1、モータ2：3つのチャンネルそれぞれに対してZスタック画像（300nmのステップ）を取得する。
注：軸索がしばしば完全に平坦に成長しないように、Zスタックの取得が重要ですマイクロチャネル及びませんので、全ての蛍光涙点において同じ焦点面内にある。
- 貨物マッピング
- 画像解析ソフトウェアを使用して貨物の移動カイモグラフを生成する。 Rietdorfとザイツ（EMBL）によって開発されたImageJのプラグインがkymographsを生成するために推奨されます（ダウンロードのために参照してください。 マテリアルリスト）。
注：ImageJの保健27,28の国立研究所で開発されたパブリックドメイン、Javaベースの画像処理プログラムである（ダウンロード用物質一覧を参照してください）。 - 市販のグラフのソフトウェアプログラム（材料を使用して、固定します（ 図2A、B）の時点でのカイモグラフにおける軌跡の位置にそれらを重ね合わせて手動で（ステップ4.2.14で生成された）は、蛍光貨物の固定画像を整列リスト）。最初カイモグラフ上に固定された貨物の画像を重畳し、手動で上の特定の軌道に相当貨物涙点を選択することで、手動での位置合わせカイモグラフ。最良のアライメント結果を得るには、マッピングされた貨物のための最良の焦点が合っているのZスライスを使用しています。いくつかのZスライスを使用してもよい。
- XY座標確立アルゴリズムを使用して各蛍光涙点についての強度の振幅が表す点広がり関数に2次元ガウス分布に適合するように決定し、それぞれのZスタック画像（ステップ4.2.14で生成された貨物は、モータ1とモータ2）つのチャネル16,20,21（ 図2D）のそれぞれにおいて、各点光源。
注：XY座標取得するには、「モータ共局在」と呼ばれるカスタム構築されたMATLABソフトウェアパッケージはJaqaman、Danuserと同僚21-23によって開発されたガウシアンフィッティングアルゴリズムを組み込んだ、16,20を開発した。その使用のためのソフトウェアパッケージと詳細な手順は、要求に応じて得ることができる。 - カイモグラフ上のモバイルまたは静止軌道上にマッピングされた個別の貨物涙点のそれぞれについて、tを選択彼は"モーター共局在」プログラムの結果からの座標と強度振幅（これらの貨物は、個別に、図2Bのラベルが貼られていて）XY。別の焦点面上に見られるより多くの貨物をマップするステップ4.2.14で取得されたいくつかのZスタック画像）を使用します。
- 個々のXY対応するZスライス（ 図2D）におけるモータチャネルのそれぞれについて得られたものにマッピングされた貨物の座標を比較する。貨物の300nmの半径内にあるXYモータ座標を決定し、選択します。貨物と同じ焦点面内の信号を持っているモータの場合、300 nmの半径内に配置されている涙点を決定するために、「モータ共局在」ソフトウェアパッケージを使用しています。
- 画像解析ソフトウェアを使用して貨物の移動カイモグラフを生成する。 Rietdorfとザイツ（EMBL）によって開発されたImageJのプラグインがkymographsを生成するために推奨されます（ダウンロードのために参照してください。 マテリアルリスト）。
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Representative Results
図1は、海馬神経細胞を成長させるために使用されるマイクロ流体デバイスの概要を示している（ 図1A、B）。ニューロンは、チャネルの長さは、軸索コンパートメントまでずっと交配からの樹状突起を防ぎつつマイクロチャネルの大きさは、軸索コンパートメントに細胞体（細胞体）の拡散を防止するリザーバ1にプレーティングする。培養液中で〜2-3日後に、ニューロンは軸索コンパートメント（ 図1B、C）にマイクロチャネル全体でその軸索を拡張し始める。黄色蛍光タンパク質（YFP-のPrP C）で標識された正常なプリオンタンパク質を発現するトランスフェクトされた軸索は、蛍光顕微鏡（ 図1C）によって同定することができる。プラスミドトランスフェクションを使用して、蛍光標識されたタンパク質の発現は、変化したタンパク質のコンフォメーションへの実験的なアーティファクトを導入可能性が過剰発現などの適切な細胞内局在と機能のためにチェックする必要があります。したがって、colocalizatイオン実験は、生化学的共沈法研究と、ならびに内因的に発現されるタンパク質のためのIF染色の両方で補完されるべきである。ここで使用YFP-PrP Cからの動作は、以前に16試験した。一過性にトランスフェクト神経芽細胞腫細胞（N2aを）におけるYFP-PrP Cからの発現は、一過性トランスフェクションは非常に過剰発現し、YFP-PrP Cからレベル16にならないことを示唆し、低いものであった。また、CのPrPに対する抗体を用いてYFP-のPrP CをトランスフェクトしたN2a細胞のIFは、YFP-のPrP Cは非常に両方のトランスフェクトし、内因性のPrP Cは同様に挙動することを示唆し、内因性のPrP Cと共局在することが示された。のPrP Cには、モータに関連付けられていることを確認するために、小胞immunoisolations 16を行った。
最適な貨物マッピング研究のために、マイクロチャネルの右端ライブ固定IMA中の視野と位置合わせされる（ 図1B、C言語で赤い四角形で示される）軸索の同じ領域の画像へ順番に変。 図2と図3は、貨物のマッピングのための代表的な結果は、一過性にYFP-PrP Cからでトランスフェクションしたニューロンの分析を示している。 YFP-PrP Cからを運ぶ小胞は、従ってYFP-PrP Cから小胞をキネシン1サブユニットキネシン軽鎖1（KLC1）にマッピングし、キネシン1家族やダイニン重鎖1（DYNC1H1）16のメンバーによって、哺乳動物の軸索に輸送される、およびDYNC1H1モータへ。 YFP-PrP Cから小胞の動きを画像化し、カイモグラフ（ 図2A）でプロットした。 kymographsでは、YFP-のPrP C小胞の順行性及び逆行運動は、それぞれ、負および正の勾配を有する軌跡で表され、固定小胞は垂直軌跡によって描かれている。固定時に、全ての動きがカイモグラフにおける対角線の欠如によって示される停止し（ 図2A）。固定、透過処理軸索における分子モーターや貨物のIF信号は、点状16（ 図2B、C）である。 「カーゴマッピング」の目標は、貨物チャネル（ 図2B）における涙点は、他の2つのチャンネルのモータ涙点（ 図2C）と共局在かどうかを決定することである。これを行うには、固定YFP-PrP Cから小胞 、および水疱性涙点に関連しKLC1とDYNC1H1対応のIF画像の蛍光画像はカイモグラフ（ 図2B、C）に整列させた。ガウス関数は、ライブイメージング（ 図2D）によって得られた貨物軌道にモータの正確なXY位置をマッピングするためにすべての3つのチャネル内の蛍光点光源の点広がり関数にフィットさせた。内因的KLC1とDYNC1H1モータが点状染色として現れるとYFP-PrP Cから小胞 （ 図2D）で示差的に共局在表明した。 Colocalizationは、ガウスXYの共局在YFP-PrP CからとKLC1とDYNC1H1涙点の各々との間の座標位置のレベル（ 図3Aにより300nmの距離内YFP-のPrP Cの存在とモータ涙点によって定義され、定量化した）。この距離は、光学、光の回折限界、及び貨物自動車のサブユニットの関連する物理的なサイズに基づいて選択した。 YFP-のPrP C小胞に関連付けKLC1とDYNC1H1の相対量は、それぞれの涙（ 図3B）の強度を表すガウス振幅から得られた。必要に応じてこれらのデータをさらに分析することができる。例えば、制御の間にYFP-PrP Cからの涙（野生型- WT）との共局在モーターの強度ニューロンおよび他のキ ネシン1サブユニット（KIF5C欠く- / - 図3Aのニューロンは、KIF5Cはキネシン1のメンバーであるファミリー）、KIF5の不在かどうかを決定するために比較することができるCは、YFP-PrP Cから小胞 （KLC1とDYNC1H1強度が我々の実験16で変わらなかった）にKLC1および/ またはDYNC1H1の関連付けを破壊する。さらに、KLC1とDYNC1H1強度は相対運動量と運動の方向（ 図3B）の間の可能な相関関係を精査するためにプロットすることができる。例えば、移動及び/又は固定されたYFP-のPrP C小胞はKLC1および/ またはDYNC1H1（ 図3B）の両方に関連付けられている。
マイクロ流体デバイス内で培養図1.海馬ニューロン。マイクロ流体デバイスの（A）写真。リザーバの輪郭が赤色および青色色素によって可視化される。番号付けは、プロトコル全体で使用されるマイクロ流体リザーバの数を指す。マイクロ流体デバイスの（B）図。数字は、貯水池のiに対応メディアおよびニューロンが追加されるn個。トランスフェクトしたニューロンは緑色で示されている。シングルマイクロチャネルを通じて成長しているYFP-PrP Cから（デバイスの1マイクロチャネルとエッジが点線白線によって概説されている）でトランス2軸索の赤い矩形と赤の点線の矢印はライブや固定蛍光イメージングのために推奨される地域を示している。（C）画像。個別に移動YFP-のPrP C小胞は明るい斑点として区別することができる。スケールバーは10μmである。 。図から適応される：。Encalada ら 16 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
とYFP-PrP Cからの小胞輸送を相関させる図2.「カーゴマッピング」キネシンおよびダイニンモーターの相対量ライブ移動および固定貨物の広視野蛍光画像は電動ステージおよびCCDカメラおよび100X / 1.4 NAオイル対物を備えた倒立顕微鏡上で撮影した。YFPの（A）カイモグラフ図1Cに示されている軸索の-PrP C小胞の動き。ライブ移動は30〜100ミリ秒露光（10ヘルツ）で60秒までの範囲の合計時間を記録した。細胞は、少なくとも15秒間、貨物の移動を画像化した後に固定した。点線は、ライブ撮影時の固定の時間を示す。赤いボックスは、（B、C）で強調表示され、拡大小胞の領域を示している（D）。矢印の頭は、（D）静止（青）に対応する、逆行（赤）、および順行（緑）の軌道に示す三小胞を指す。（対応カイモグラフに整列固定YFP-PrP Cから小胞のB）画像。数字は、中を示すカイモグラフに識別可能な涙点にマッピングされたdividual YFP-PrP Cから小胞 。順行小胞は緑色で、逆行は赤であり、静止ものは青である。（C）KLC1とDYNC1H1涙点の画像が、（B）に示された同じ領域に対応するIF修正しました。スケールバー（AC）は 10μmである。固定IFの（D）の拡大2Dガウス関数の割り当てを持つ3つのチャネルのそれぞれの信号。青いドットが局所強度極大ピクセルを表し、赤い点は、ガウスフィットを表し、ピンクのドットが2間の重複である。矢印は、（A）に示すYFP-のPrP C小胞の例を示し、KLC1とDYNC1H1モータータンパク質との差分共局在。スケールバーは2μmである。 。図は以下から適応される：。Encalada ら 16 番目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください図である。
図3.定量的には、YFP-PrP Cから小胞の「貨物マッピング」の分析。 （A）YFP-のPrP C小胞 、KLC1とDYNC1H1 WTおよびKIF5Cノックアウトニューロン（KIF5C - / - ）との間の共局在の定量。 - / -分析され涙点の総数は、N、WT = 887とN KIF5Cた。= 1629 16のバーの内側の数字は、カテゴリごとの小胞の数を表す。 SEMの±平均値を示している。ノンパラメトリック順列t検定を遺伝子型29との間の比較のために使用した。（A）において分析されたデータのWTニューロンにおける相対運動組成および運動の方向の（B）の相関。 Encalada ら16：図から適合されている。.jove.com /ファイル/ ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、ライブニューロンにおける相対的なタイプと関連したモータータンパク質の量と個々の蛍光微小管ベースの移動貨物粒子の運動の方向性との相関を可能にします。以前は、軸索水疱貨物の総運動組成物は、生化学的に精製された小胞およびオルガネラ9,15の不均一な集団で検定した。しかし、細胞内での貨物のシングルタイプの特徴づけるモーター組成が原因均質ベシクル集団を精製することが困難である挑戦されています。モータストール力の測定は、ショウジョウバエ胚においてアクティブモーター数の推定値を提供しながら、また、それは動きの方向を安定して貨物またはへ/積荷12から活性モータの迅速な会合/解離に束縛されるモータと相関するかどうかは不明であった。そのため「貨物マッピング」プロトコルはdescriここのベッドは、さらに種類や個別のライブニューロンで貨物を移動するために関連したモータの相対数との相関関係を調査するために開発されました。
首尾よく「貨物マッピング」からデータを取得するには、高い時間的·空間的分解能で荷動きのイメージングおよび固定のIFを実行する）1に重要である、2）3）領域を揃え、画像化の過程での試料の即時の定着を確実にするライブおよび定着画像中の対象と同一の画像の移動kymographsに固定された貨物やモータをマップし、4）正確にXY貨物とモータータンパク質との間の共局在の量を決定するために、貨物自動車蛍光涙点の座標を決定する。
このプロトコルは一意にマイクロ流体デバイス中で増殖させたニューロンの軸索に均一に編成輸送特性を分析するために適しているが、それは研究課題の広い範囲に適合させることができる。例えば、このAPPLICAンは、エンド/エキソサイトーシスに関与し、それらのアダプタ（ 例えば、線維芽細胞における人身売買アッセイ）で小胞の会合を特徴付けるために使用、または微小管+先端結合タンパク質で標識された微小管の成長をすることができた。これらの場合は、マイクロ流体デバイスは、相関ライブおよび固定イメージング研究のために必要な画像化された細胞の局在を容易にするために、グリッド·カバースリップによって置き換えることができる。このプロトコルは、時間のパラメータの変化は、特定の細胞環境に依存している細胞事象を特徴付けるために使用することができる。例えば、細胞質への個々のエンドソーム構造からの蛍光標識されたウイルスタンパク質の放出は、エンドソームのタンパク質の発現および/または会合と相関させることができた。
このプロトコルの一つの可能な限界は、高密度貨物のマッピングは難しいかもしれないということである。しかし、ガウス関数の割り当ては可能にすることにより大幅にこの問題を回避サブピクセルレベルでの蛍光涙点の間の位置の区別。さらに、軸索の貨物にモータのマッピングは、低スループットである。現在、マッピングは、マイクロ流体デバイスあたり2軸索のために行うことができ、高ために必要な高倍率を使用した場合、ニューロンのトランスフェクション率が低いと制限された視野を与え私たちのカメラで解像度イメージング。この方法の将来の開発が増加するのすべてが高い効率でニューロンを形質導入するレンチウイルス系を使用する、蛍光タグ化タンパク質またはそのようなリソトラッカーまたはのMitoTrackerの小さな蛍光色素とのオルガネラの標識を発現するトランスジェニックマウスからの神経細胞の単離を含んでもよい蛍光マーカーで標識された軸索の数。さらに、記録された領域の大きさ、倍率、画素サイズ、および画像化のために使用されるカメラの画素アレイのサイズによって制限される。イメージング技術の分野における継続的な発展は、より大きな領域を可能にするsは、将来的に撮像され、したがって、実験条件ごとに得られたデータの量を増加させることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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