Karakterisere sammensætningen af Molecular Motors på Moving axonal Cargo Brug af "Cargo Mapping" Analyse
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Forståelse af de mekanismer, som molekylære motorer koordinere deres aktiviteter, til at transportere vesikuløse laster inden neuroner kræver kvantitativ analyse af motor / cargo foreninger på enkelt vesikel niveau. Målet med denne protokol er at bruge kvantitativ fluorescensmikroskopi at korrelere ("kort") position og retningsbestemmelse bevægelighed for levende last til sammensætning og relative mængder af motorer, der er forbundet med den samme last. "Cargo mapping" består af levende billeddannelse af fluorescensmærkede ladninger bevæger sig i axoner dyrket på mikrofluidenheder, efterfulgt af kemisk fiksering under optagelse af levende bevægelse, og efterfølgende immunofluorescens (IF) farvning af de nøjagtige samme axonale regioner med antistoffer mod motorer. Colokalisering mellem laster og deres tilknyttede motorer vurderes ved at tildele sub-pixel position koordinater motordrevne og fragt kanaler, ved montering af Gauss funktioner diffraktion-ligrænset punkt spredning funktioner, der repræsenterer de enkelte fluorescerende punktkilder. Faste last- og motoriske billederne efterfølgende overlejret til plots af fragt bevægelse, at "kort" dem til deres sporede baner. Styrken ved denne protokol er kombinationen af levende og IF data til at optage både transport af vesikulære last i levende celler og til at bestemme motorerne forbundet til disse nøjagtig samme vesikler. Denne teknik overvinder tidligere udfordringer, der bruger biokemiske metoder til at bestemme den gennemsnitlige motor sammensætning af oprensede heterogene bulk-vesikel populationer, da disse metoder ikke afsløre kompositioner på enkelte bevægelige laster. Endvidere kan denne protokol tilpasses til analyse af andre transport- og / eller menneskehandel veje i andre celletyper at korrelere bevægelsen af individuelle intracellulære strukturer med deres proteinsammensætning. Begrænsninger i denne protokol er den relativt lille produktion på grund af lave transfektionseffektiviteter af dyrkedeprimære neuroner og et begrænset synsfelt til rådighed for høj opløsning billeddannelse. Fremtidige applikationer kan omfatte metoder til at øge antallet af neuroner, som udtrykker fluorescensmærkede ladninger.
Introduction
Intracellulær transport er afgørende i alle celletyper for levering af proteiner, membraner, organeller og signalmolekyler til forskellige cellulære domæner 1. Neuroner er højt specialiserede celler med lange, polariserede fremskrivninger, der kritisk afhængige af intracellulær transport af væsentlige laster for deres lange afstande levering til forskellige axonale mikrodomæner. Denne transport er medieret af kinesiner og dyneins – to store familier af molekylære motoriske proteiner – som binder til fragter og spore langs polariserede mikrotubuli i anterograd og retrograd retninger, hhv. Mens retrograd bevægelse primært medieres af dynein er bevægelse i anterograd retning lettes af en stor, funktionelt forskelligartet familie af kinesin motorer. Derfor kan anterograd transport af axonal ladninger medieres af forskellige familiemedlemmer kinesin superfamilien 1-5. Selvom nogle ladninger bevæger sig konstant i begge retninger, mOst ladninger bevæger sig i to retninger og vende ofte på deres vej til deres endelige destinationer 1,5-13. Endvidere er det blevet påvist, at motorer modstående retningsvirkning associeret samtidigt til laster, hvilket rejser spørgsmålet om, hvordan reguleret bevægelse af laster koordineres af modsat polaritet motorer 5-7. Sammen transport af axonale laster er en samordnet proces, der er reguleret af sammensætningen af motorer og deres specifikke biokemiske aktiviteter, der igen er afhængig af forskellige adaptere og reguleringsmæssige bindingspartnerne 14.
Trofast beskrive den mekanisme af axonal transport til en bestemt last og for at afdække den underliggende regulering af denne transport, er det altafgørende at bestemme sammensætningen af motordrevne proteiner og deres regulerende bindingspartnere forbundet med individuelle laster under deres live-transport. Andre metoder, for eksempel biokemiske metoder, give skøn over gennemsnittet moteller kompositioner på oprensede heterogene vesikel populationer, men disse skøn afslører ikke typen eller mængden af motorer, der er forbundet til enkelte bevægelige vesikler. Også rekonstituering af vesikel transport langs formonterede mikrotubuli in vitro aktiveret måling af mængden af en type motor på en enkelt vesikel niveau 15. Men disse forsøg ikke direkte korrelerer mængden af motorer med transport- karakteristika af disse vesikler og målt transport i fravær af cellulære regulatoriske faktorer.
Præsenteres her En protokol, der bestemmer motorens sammensætning (type og relative mængde af motorer) af individuelle bevægelige vesikler fra immunofluorescens (IF) data, der måler endogent udtrykte motoriske proteiner og korrelerer disse parametre til transport af levende nøjagtig samme vesikler i neuroner 16. Denne metode indebærer præcis kortlægning af IF-til-live fragt bevægelse data. Dette opnås ved growing hippocampus mus neuroner i mikrofluidenheder følgende etablerede protokoller 17-19. Disse enheder giver mulighed for at identificere og korrelation ("mapping") af axoner og enlige bevægelige laster i faste og levende lys mikroskopi modaliteter (figur 1). Dyrkede neuroner transficeres med fluorescensmærkede lastproteiner hvis transport afbildes ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning for at få detaljerede oplysninger, som er afbildet i kymographs bevægelse. Under billeddannelse neuroner fikseret med paraformaldehyd og efterfølgende farvet med antistoffer mod endogene motordrevne proteiner. Faste last- og motoriske billeder overlejret på levende bevægelse kymographs til "kort" (colocalize) dem til live fragt bevægelsesbaner 16. At korrelere levende bevægelse af ladninger med Sammenslutningen af motordrevne proteiner er colokalisering analyseres ved hjælp af en skræddersyet MATLAB software pakke kaldet "Motor colokalisering "16,20. Fluorescensmærkede laster og motorer generere diffraktionsbegrænset punktformig funktioner, der kan delvist overlapper hinanden. For at løse den position af overlappende puncta softwaren først passer automatisk Gauss funktioner til hver punktspredningsfunktionen, der repræsenterer de enkelte fluorescerende puncta, at bestemme deres præcise XY sub-pixel position koordinerer og intensitet amplituder 21-23. Positionerne af motorer og laster er derefter i forhold til hinanden for at afgøre colokalisering 16,20. Derfor er denne metode mere præcist tildeler colokalisering mellem fluorescerende puncta i forhold til andre metoder 24.
Styrken ved denne metode er evnen til at vurdere colokalisering af motorer med individuel last i fikserede celler, som levende bevægelsesbaner (f.eks, i hvilken retning de bevægede sig på tidspunktet for fiksering) har været recbestilte. Med denne metode blev kinesiner og dyneins fundet at associere samtidigt til vesikler, der bærer den normale prionprotein (PrP C -cellular), et neuronalt beriget last, der bevæger sig bidirektionalt eller forbliver stationært i axoner 16. Denne analyse tillod formulering af en arbejdsgruppe model for regulering af PrP C vesikel bevægelse, hvor anterograd (kinesin) og retrograd (dynein) motorer koordinere deres aktiviteter med henblik på at flytte vesiklerne i begge retninger eller at forblive stationær, mens forbundet til lasten . En anden styrke ved denne metode er dens potentielle brede anvendelighed til karakterisering colokalisering / sammenslutning af mange fluorescensmærkede laster, der bevæger sig i stort set enhver celletype, med andre protein (r) af interesse. Således kunne levende / fast korrelation potentielt give til påvisning af forbigående protein-cargo interaktioner, kan så mange individuelle fluorescensmærkede bevægelige partikler analyseres over et ønsket period af tid. I betragtning af den brede anvendelighed og den type spørgsmål, som denne metode kan adresse, vil denne protokol være af interesse for et bredt publikum af cellebiologer herunder dem, der studerer handel og transport i neuroner eller i andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her giver korrelationen af retningen af bevægelse af enkelte fluorescerende mikrotubulus-baserede flytte gods partikler med den relative type og mængde af de tilknyttede motordrevne proteiner i levende neuroner. Tidligere blev den samlede motor sammensætningen af axonale vesikuløse laster analyseret på heterogene populationer af biokemisk rensede vesikler og organeller 9,15. Imidlertid har karakteriserer motor sammensætning til en enkelt type gods i ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
