Abstract
La comprensione dei meccanismi attraverso i quali motori molecolari coordinano le loro attività per il trasporto di carichi vescicolari all'interno dei neuroni richiede l'analisi quantitativa delle associazioni motore / carico a livello delle vescicole singolo. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza quantitativa correlare ("mappa") la posizione e la direzionalità del movimento di carico vivo per la composizione e la quantità relative di motori associati allo stesso carico. "Mappatura Cargo" è costituito da immagini in diretta di carichi fluorescente che si muovono in assoni coltivate su dispositivi microfluidici, seguita da una sintesi chimica durante la registrazione di movimento dal vivo, e la successiva immunofluorescenza (IF) colorazione delle esatte regioni assoni stessi con anticorpi contro i motori. Colocalizzazione tra i carichi e relativi motori è valutata assegnando posizione sub-pixel coordinate ai canali del motore e del carico, da funzioni gaussiane di montaggio per la diffrazione-lile funzioni di punto di spread tata che rappresentano le singole fonti puntuali fluorescenti. Del carico e del motore le immagini fisse vengono successivamente sovrapposte a trame di movimento merci, di "mappare" ai loro traiettorie tracciate. Il punto di forza di questo protocollo è la combinazione di live e se i dati di registrare sia il trasporto di carichi vescicolari in cellule vive e per determinare i motori associati a queste stesse vescicole esatte. Questa tecnica supera sfide precedenti che utilizzano metodi biochimici per determinare la composizione media del motore di eterogenee popolazioni di vescicole rinfusa purificati, come questi metodi non rivelano composizioni su singoli carichi in movimento. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di altre vie di trasporto e / o di traffico in altri tipi di cellule di correlare il movimento delle singole strutture intracellulari con la loro composizione proteica. Le limitazioni di questo protocollo sono la relativamente bassa velocità a causa delle basse efficienze di trasfezione di colturaneuroni primari e un campo di vista limitato disponibile per imaging ad alta risoluzione. Le applicazioni future potrebbero includere metodi per aumentare il numero di neuroni che esprimono carichi fluorescente.
Introduction
Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari 1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine - due grandi famiglie di proteine motore molecolare - che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è mediata principalmente da dineina, il movimento in direzione anterograda è facilitato da una famiglia numerosa e funzionale gamma di motori kinesin. Di conseguenza, il trasporto anterogrado di carichi assonale potrebbe essere mediata da vari membri della famiglia della superfamiglia kinesin 1-5. Sebbene alcuni carichi muovono costantemente in entrambe le direzioni, mcarichi ost si muovono in modo bidirezionale e invertono spesso nel loro cammino verso la loro destinazione finale 1,5-13. Inoltre, è stato dimostrato che i motori di opporsi direzionalità collegata simultaneamente a carichi, sollevando la questione di come il movimento regolato di carichi è coordinata da motori opposto polarità 5-7. Insieme, il trasporto di carichi assonale è un processo concertato che è regolato dalla composizione dei motori e delle loro attività biochimiche specifiche, che a loro volta dipendono da vari adattatori e partner di legame normativi 14.
Per descrivere fedelmente il meccanismo di trasporto assonale per un carico specifico e per scoprire la regolazione di fondo di tale trasporto è fondamentale per determinare la composizione di proteine motore e dei loro partner di legame regolamentazione associati con i singoli carichi durante il trasporto di animali vivi. Altri metodi, ad esempio approcci biochimici, forniscono stime di mot mediao composizioni su popolazioni purificate vescicole eterogenee, ma queste stime non rivelano il tipo o la quantità di motori associati a vescicole si muovono singoli. Inoltre, la ricostituzione del trasporto delle vescicole lungo i microtubuli preassemblati in vitro abilitata la misurazione della quantità di un tipo di motore su un unico livello vescicole 15. Tuttavia, questi esperimenti non correlavano direttamente la quantità di motori con caratteristiche di trasporto di questi vescicole, e misurato il trasporto in assenza di fattori regolatori cellulari.
Un protocollo è presentato qui, che determina la composizione del motore (tipo e la quantità relativa di motori) delle vescicole spostano singoli da immunofluorescenza (IF) dati di misura endogenamente espressi proteine motrici, e correla questi parametri al trasporto vivo degli stessi esatti vescicole in neuroni 16. Questo metodo comporta precisa mappatura dei dati IF-to-live il movimento del carico. Questo si ottiene growing neuroni dell'ippocampo di topo in dispositivi microfluidici seguenti protocolli 17-19 stabiliti. Questi dispositivi consentono l'identificazione e la correlazione ("mappatura") degli assoni e dei singoli carichi in movimento in modalità microscopia luce fissa e dal vivo (Figura 1). Neuroni in coltura sono trasfettate con modo fluorescente proteine cargo con etichetta il cui trasporto è ripreso ad alta risoluzione spaziale e temporale per ottenere le informazioni dettagliate movimento che viene tracciata in kymographs. Nel corso delle immagini, i neuroni sono fissate con paraformaldeide, e successivamente colorate con anticorpi contro proteine motrici endogene. Del carico e del motore le immagini fisse sono sovrapposte su kymographs dal vivo movimento di "mappare" (colocalizza) li al carico dal vivo movimento traiettorie 16. Per correlare il movimento in tempo reale dei carichi con l'associazione di proteine motrici, co-localizzazione viene analizzato utilizzando un pacchetto software MATLAB su misura chiamato "Motor Colocalizzazione "16,20. Carichi e motori fluorescente generano caratteristiche puntiformi diffrazione limitata che può parzialmente sovrapporsi. Per risolvere la posizione di sovrapposizione puncta, il software prima adatta automaticamente funzioni gaussiane a ciascuna funzione del punto di diffusione, che rappresenta puncta fluorescente individuale, per determinare la loro esatta posizione XY sub-pixel di coordinate e l'intensità ampiezze 21-23. Le posizioni dei motori e dei carichi sono successivamente confrontate tra loro per determinare colocalizzazione 16,20. Pertanto, questo metodo assegna più precisamente colocalizzazione tra puncta fluorescenza rispetto ad altri metodi 24.
La forza di questo metodo è la capacità di valutare la colocalizzazione dei motori con carico individuale cellule fissate, per cui traiettorie di movimento vivo (ad esempio, la direzione in cui sono stati in movimento al momento della fissazione) sono stati recorded. Con questo metodo, kinesins e dineine trovato associare simultaneamente vescicole che portano il normale proteina prionica (PrP C -cellular), un carico neuronally arricchito che si sposta bidirezionalmente o rimane stazionario negli assoni 16. Questa analisi ha permesso la formulazione di un modello di lavoro per la regolazione della PrP C movimento delle vescicole in cui anterograda (cinesina) e (dineina) Motori retrogradi coordinano le loro attività al fine di spostare le vescicole in entrambe le direzioni o di rimanere fermo mentre associato al carico . Un'altra forza di questo metodo è la sua applicabilità potenziale massima per caratterizzare colocalizzazione / associazione di molti carichi fluorescente che si muovono in qualsiasi tipo di cellula, con qualsiasi altra proteina (s) di interesse. Così, in diretta correlazione / fisso potrebbe potenzialmente consentire la rilevazione di interazioni transienti proteina-carico, come molti fluorescente individuo etichettato particelle in movimento può essere analizzato su un p desideratoeriodo di tempo. Data l'ampia applicabilità e il tipo di domande che questo metodo può affrontare, questo protocollo sarà di interesse per un vasto pubblico di biologi cellulari, tra cui quelli che studiano il traffico e il trasporto nei neuroni o in altri tipi di cellule.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati e secondo le linee guida istituzionali per la cura umano degli animali di ricerca. Neonati topi sono stati sacrificati per decapitazione.
1. Preparazione di dispositivi microfluidici per colture cellulari
- Preparare polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici per la crescita dei neuroni dell'ippocampo come descritto da Harris e colleghi 17-19. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate al protocollo mappatura del carico.
NOTA: dispositivi microfluidici sono anche disponibili in commercio (Materials List), così l'accesso ad un impianto di fabbricazione non è necessario. - Preparare No. 1½ vetrini coprioggetto (24 x 40 mm) per lavarli tre volte con acetone, seguita da tre lavaggi con il 100% di etanolo e tre lavaggi di acqua. Conservare coprioggetto in acqua a 4 ° C fino al momento dell'uso. Questi trattamenti aiutano a garantire che lamelle siano pulite da detriti che potrebbero interferire con la placcatura di cells, la contaminazione, e la sopravvivenza.
NOTA: acetone ed etanolo sono infiammabili e pericolosi in caso di contatto cutaneo (irritante), di contatto con gli occhi (irritante), di ingestione, di inalazione. Smaltire conformemente alla normativa vigente. - Quando si è pronti ad utilizzare, mettere un vetro di copertura in un piatto di coltura cellulare 60 millimetri per dispositivo microfluidica, e lasciare asciugare all'aria scoperto per 45 minuti all'interno di un quadro di biosicurezza per evitare la contaminazione.
- Dopo che i dispositivi sono tagliati fuori da maestri e pugni sono stati tagliati per creare serbatoi (Figura 1A, B), metterli con i canali microfluidici lato-up all'interno di un armadio biosicurezza dotato di una lampada UV per 45 minuti per la sterilizzazione.
NOTA: Lasciare i dispositivi in trattamento UV per più di 2 ore potrebbe influenzare l'integrità dei PDMS. - Montare i dispositivi inserendo un dispositivo su ogni vetro di copertura all'interno del piatto di coltura cellulare di plastica 60 millimetri in modo che i canali microfluidici a faccia in giù. Applicare una leggera pressione al o superioref il dispositivo (non toccare i microcanali) per fornire una tenuta non permanente del dispositivo al vetro di copertura. Coprire ogni piatto di coltura cellulare 60 mm Con un coperchio.
- Usando una micropipetta, idratare i dispositivi aggiungendo acqua coltura cellulare di grado all'inizio due serbatoi microfluidica (1 e 2 in Figura 1A), permettendo all'acqua di fluire attraverso. Rimuovere acqua con una micropipetta e aggiungere 1 mg / ml di poli-L-lisina nel serbatoio microfluidica 1 (200 ml) e 2 (100 mL). Il volume differenziale consentirà il poli-L-lisina a fluire attraverso i microcanali (Figura 1A, B).
- Per garantire che i dispositivi all'interno dei piatti di coltura cellulare 60 millimetri non rovesciarsi all'interno di un incubatore a 37 ° C, posizionare tre piatti 60 millimetri di coltura cellulare contenente i dispositivi in un piatto di coltura cellulare in plastica 150 mm e coprire il piatto con un coperchio. Incubare O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Tipicamente più del 90% dei canali utilizzabili per dispositivo e farenon contenere bolle d'aria o il blocco fisico.
- Il giorno successivo, sostituire poli-L-lisina con acqua e lasciare dispositivo in incubatore per almeno 1 ora. Ripetere questo lavaggio tre volte. Rimuovere l'acqua e aggiungere Neurobasal-A mezzo di crescita (contenente 2% B-27 supplemento e 500 mM Glutamax) a ciascun dispositivo. Lascia O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2.
- Il giorno successivo, piastra cellule dell'ippocampo come descritto di seguito.
2. placcatura di topo ippocampale Primaria neuroni in dispositivi microfluidici
NOTA: La preparazione di colture di neuroni ippocampali di topi neonati è stato precedentemente pubblicato in Giove 25. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate per i neuroni dell'ippocampo di topo piatto in dispositivi microfluidici, e che erano ottimali per trasfezioni.
- Prima del mouse dissezione del cervello, contenente siero fetale bovino al 10% della coltura di Dulbecco modificato (DMEM) pre-caldo(FBS; senza antibiotici), miscela A (125 mg di DL-cisteina, 125 mg di sieroalbumina bovina (BSA) e 3,125 g di D-glucosio in 500 ml di tampone fosfato salino (PBS), filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron) e deossiribonucleasi io soluzione (DNasi I: 50 mg di DNasi I e 0,5 ml di una 4 soluzione 1,2 M MgSO in 100 ml soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) filtro sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 micron) in un bagno d'acqua a 37 °.
- Pre-calda Neurobasal-A mezzo di crescita all'interno di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per equilibrare il pH.
- Sezionare ippocampi 1-3 giorno topi neonati secondo i protocolli stabiliti 26. Mantenere dell'ippocampo in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di tampone di dissezione (HBSS contenente 10 mM HEPES pH 7,4, glucosio 50 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina), su ghiaccio. Mettere fino a 4 ippocampi per tubo da 15 ml.
- Eseguire il protocollo rimanente è in condizioni sterilis all'interno di un armadio biosicurezza.
- Diluire 45 unità di papaina in 5 ml di miscela A, vortex e incubare per 5 minuti a 37 ° C fino papaina dissoluzione della polvere. Aggiungere 1 ml di soluzione di DNasi I. Filtrare la miscela attraverso un filtro di 0,22 micron unità siringa.
- Attenzione aspirare HBSS 'da 15 ml coniche ippocampi tubo contenente. Aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) HBSS di ippocampi e farli depositano sul fondo della provetta. Con attenzione aspirare HBSS da tubo da 15 ml.
- Aggiungere 1 ml papaina / DNasi impasto fino a 4 ippocampi e incubare per 20-30 minuti a 37 ° C. Inclinare tubo conico ogni 5 minuti per fare il bagno ippocampi con la miscela. In alternativa, inserire ippocampi a 37 ° C Acque bagno shaker con agitando delicatamente (~ 100 rpm).
- Aspirare papaina / DNasi impasto e lavo ippocampi due volte con pre-riscaldato DMEM (37 ° C) contenente 10% FBS.
- Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 2 ml di DMEM pre-riscaldato contenente 10% FBS di ippocampi e ippocampi manualmente triturare pipettandosu e giù ~ 10-12 volte con una punta di pipetta 1 ml a dissociarsi neuroni.
- Let triturare accontentarsi di ~ 1 min in modo da poter neuroni non dissociati di depositarsi sul fondo della provetta conica. Trasferire il surnatante contenente neuroni dissociati in un tubo da 15 ml evitando il trasferimento di tessuto più grande che si è posata sul fondo della provetta.
- Spin cellule a 1.000 xg per 2 minuti e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet di cellule. Risospendere le cellule in 80 ml Neurobasal-A mezzo di crescita pipettando delicatamente.
- Rimuovere media dal serbatoio microfluidica 1 e 1 '. Applicare 20 ml di cellule (~ 275.000) al serbatoio microfluidica 1, e consentire loro di fluire attraverso. Inserire dispositivo 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 20 min.
- Guardare sotto il microscopio per assicurare che le cellule hanno aderito al vetro di copertura. Aggiungi Neurobasal-A mezzo di crescita per concludere tutti i serbatoi. Dispositivo ritorno con celle di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO
- Controllare i dispositivi di evaporazione ~ ogni 2-3 giorni e rabboccare serbatoi con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento (senza Glutamax) da evitare. I neuroni cominciano a estendere le loro assoni attraverso canali microfluidici ~ 2-3 giorni dopo la placcatura. Neuroni riserva di trasfezione in genere 7-10 giorni dopo la placcatura.
3. La trasfezione di neuroni ippocampali Cresciuta in Device Microfluidic
- Per dispositivo, preparare una miscela di 1,2 ml Lipofectamine 2000 a 30 microlitri Neurobasal-A, e un mix di 0,5 mg fluorescente plasmide carico fusione in 30 ml Neurobasal-A e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi mix Lipofectamine al mix DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 60 ml di Neurobasal-A contenente 4% B-27 supplemento del DNA / Lipofectamine mix e mescolare muovendo il tubo.
- Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 2 e 2 'e riempire con cura fino pozzi con Neurobasal-A contenenti 2% B-27 supplemento senza versare nel medio into gli altri comparti.
- Rimuovere i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 '. Aggiungere 120 ml di DNA / Lipofectamine mix di serbatoio microfluidica 1 e lasciare fluire. Dispositivo di ritorno a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 3-4 ore.
- Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 'e sostituire con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento per 24 ore (o fino al momento di immagine). In genere, 5-7 assoni che si sviluppano attraverso microcanali sono trasfettate in queste condizioni, che rappresentano circa il 1-3% l'efficienza di trasfezione in linea con efficienze pubblicati per cellule in coltura ippocampali 26.
4. Analisi "Cargo Mapping"
- Immagini dal vivo di movimento merci
- Eseguire l'imaging di un microscopio ottico invertito epifluorescenza dotato di un incubatore a 37 ° e di una camera di controllo di CO 2.
- Montare il vetrino con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un micrdispositivo ofluidic sul palco microscopio. Per evitare la morte neuronale, lavorare rapidamente per mantenere i campioni al microscopio per non più di 1 ora.
- Usando un obiettivo ad alta risoluzione (100X), trovare gli assoni delle cellule transfettate che si estendono attraverso i canali di camere di microfluidica e registrare il numero dei canali in cui è stato trovato l'assone transfettate. Contare il numero di canali utilizzando un contatore tally mano.
- Per una registrazione ottimale circolazione vivo e successiva analisi colocalizzazione, scegliere assoni che crescono relativamente piatta attraverso i canali in modo che l'immagine della maggior vescicole può essere eseguita a fuoco.
- Rimuovere la maggior parte del mezzo da serbatoi 2 e 2 'con 1 ml di trasferimento pipetta. Per facilitare la successiva allineamento delle immagini fisse con traiettorie di movimento sulla kymographs, allineare il bordo destro dei microcanali con il campo visivo durante l'imaging (Figura 1B, C).
- Per facilitare fixing dei campioni durante l'imaging, eseguire l'imaging dal vivo con due persone. In alternativa, se l'imaging in tempo reale viene eseguita da una sola persona, utilizzare un sistema microscopio dotato di correzione della deriva.
- Avviare l'imaging movimento merci dal vivo con le specifiche time-lapse specifiche per le dinamiche di trasporto del carico in fase di analisi (specifiche microscopio e le impostazioni per l'imaging YFP-PrP C sono specificati nella legenda della figura 2 ed elenca le materie).
- Dopo sufficienti dati in tempo reale del movimento sono stati raccolti, avere una persona riempire serbatoi 2 e 2 'con pre-riscaldato 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,04 g / ml di saccarosio per riparare le cellule. Evitare di toccare il dispositivo di microfluidica, per evitare di falsare il focus della immagini dal vivo. Avere l'altra persona regolare la messa a fuoco mentre si aggiunge il fissativo. Fissazione è successo quando si osserva arresto immediato del movimento. Aggiungi fissativo al serbatoio 1 e 1 'dopo.
NOTA: photoblea temporaneoching della fluorescenza carico potrebbe anche essere osservato, ma la fluorescenza persiste dopo se la colorazione per le proteine del motore è completata (fase successiva).
NOTA: Paraformaldeide è nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Smaltire conformemente alla normativa vigente.
- Se la colorazione delle proteine motrici per l'analisi co-localizzazione
NOTA: Per la quantificazione dei livelli relativi di proteine motrici (come determinato dalla colorazione degli anticorpi), associati ai carichi in movimento individuali, validare e titolare anticorpi per garantire che il legame antigene-anticorpo è saturo. Questo viene fatto determinando la specificità dell'anticorpo usando neuroni in cui la proteina di interesse è stato né knock-out o smontati, ed effettuando IF analisi con concentrazioni crescenti di anticorpi. Per i controlli negativi, i neuroni sono colorate con anticorpi secondari in assenza di anticorpi primari. Più dettagliateDescrizione della convalida anticorpo può essere trovato in Encalada et al. 16, e Szpankowski et al. 20.- Rimuovere il vetrino con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica dal palco microscopio. Non scollegare il dispositivo di microfluidica dal coprioggetto, come i microcanali devono rimanere intatto per sovrapporre le immagini in diretta e fisse. Effettuare le seguenti operazioni in una camera umida.
- Per garantire il flusso di soluzioni nei microcanali, mantenere un volume differenziale cuscinetto tra serbatoi 1, 1 'e 2, 2' di almeno 30 microlitri. in tutte le fasi successive. Ad esempio, aggiungere il volume di 100 microlitri mezzi di serbatoio microfluidica 2, 2 ', e 70 ml di volume media per serbatoio microfluidica 1, 1'.
- Rimuovere fissativo delle camere di dispositivo di microfluidica e lavare le cellule tre volte con PBS di attesa di 10 minuti tra un lavaggio.
- Permeabilize cellule aggiungendo 0,1% Triton X-100 Diluta in PBS per 5 minuti per tutti i serbatoi.
- Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare con PBS. Ripetere il lavaggio e tre tempi di attesa di 10 minuti tra un lavaggio.
- Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e applicare un tampone di bloccaggio contenente il 10% di siero normale Asino e il 3% della proteasi libera e immunoglobuline G (IgG) -free BSA in PBS e incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
- Spin anticorpi soluzione madre primaria a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l'anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire il tampone bloccante dal dispositivo di microfluidica con soluzione di anticorpi. Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio.
- Spin anticorpi soluzione madre secondario a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l'anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire PBS con la soluzione di anticorpo secondario. Covarecampioni per 1 ora a RT.
- Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio.
- Sostituire PBS con ~ mezzo di montaggio 10-20 microlitri pipettando direttamente mezzo di montaggio nell'apertura dei canali che collegano i serbatoi. Lasciate il montaggio di mezzi a secco per ~ 20 min - 1 ora a temperatura ambiente.
- Dispositivi Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per evitare photobleaching, e assoni immagine entro due giorni (massimo una settimana) di colorazione.
- Dopo la colorazione è stata completata, montare coprioggetto con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica sul palco microscopio. Individuare la regione del assone trasfettate ripreso al punto 4.1.1-4.1.7.
- Acquisire immagini Z-stack (300 gradini nm) per ciascuno dei tre canali: carico, il motore 1, motore 2, utilizzando un obiettivo ad alta risoluzione (ad esempio, un alto obiettivo di olio o acqua apertura numerica).
NOTA: Acquisizione di Z-stack è importante in quanto assoni spesso non crescono perfettamente pianain microcanali e quindi non tutti puncta fluorescenti sono nello stesso piano focale.
- Mappatura Cargo
- Genera un chimografo di movimento del carico utilizzando il software di analisi delle immagini. Il plugin ImageJ sviluppato da Rietdorf e Seitz (EMBL) è consigliato per la generazione di kymographs (vedi per il download Elenco materiali).
NOTA: ImageJ è un dominio pubblico, basata su Java programma di elaborazione delle immagini sviluppato presso il National Institutes of Health 27,28 (per il download vedi Materials List). - Allineate le immagini fisse del carico fluorescente (generato nel passaggio 4.2.14) manualmente sovrapponendoli sulla posizione delle traiettorie nel chimografo nel punto di fissaggio (figura 2A, B), utilizzando un programma software grafica disponibile in commercio (Materiali List). Allineare manualmente dal primo sovrapponendo l'immagine del carico fissato sul chimografo e scegliendo manualmente il puncta carico che corrisponde ad una traiettoria determinata sullail chimografo. Per ottenere i migliori risultati di allineamento, utilizzare la fetta Z che è nel migliore messa a fuoco per il carico mappato. Possono essere utilizzate diverse sezioni Z.
- Per ogni immagine nella Z-stack (carico motore 1 e motore 2; generato nel passaggio 4.2.14) determinare le coordinate XY e ampiezze di intensità per ogni puncta fluorescenza utilizzando un algoritmo stabilito per adattarsi gaussiane 2D alla funzione di diffusione del punto che rappresenta ciascuna sorgente puntiforme in ciascuno dei tre canali 16,20,21 (Figura 2D).
NOTA: Per ottenere le coordinate XY, un pacchetto software MATLAB su misura denominata "Motor Colocalizzazione" è stato sviluppato 16,20, che incorpora un algoritmo di raccordo gaussiano sviluppato da Jaqaman, Danuser e colleghi 21-23. Il pacchetto software e dettagliate istruzioni per l'uso possono essere richiesti. - Per ciascuno di carico puncta singolarmente che sono stati mappati sulle traiettorie mobili o fissi sul chimografo, selezionare tha coordinate XY e ampiezze intensità dai risultati del programma "Motor Colocalizzazione" (questi carichi sono singolarmente etichettati in Figura 2B). Utilizzare diverse immagini Z-stack acquisite in fase 4.2.14) per mappare più carichi che si trovano su diversi piani focali.
- Confrontare coordinate XY individuale per il carico mappato a quelli ottenuti per ciascuno dei canali motore nella corrispondente sezione Z (Figura 2D). Determinare e selezionare le coordinate XY del motore che si trovano entro un raggio di 300 nm del carico. Per i carichi e motori che hanno il segnale all'interno dello stesso piano focale, utilizzare il pacchetto software "Motor Colocalizzazione" per determinare il puncta che si trovano entro un raggio di 300 nm.
- Genera un chimografo di movimento del carico utilizzando il software di analisi delle immagini. Il plugin ImageJ sviluppato da Rietdorf e Seitz (EMBL) è consigliato per la generazione di kymographs (vedi per il download Elenco materiali).
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Representative Results
La Figura 1 mostra una panoramica del dispositivo microfluidica utilizzato per la coltivazione neuroni ippocampali (Figura 1A, B). I neuroni sono placcati nel serbatoio 1. La dimensione dei microcanali impedisce la diffusione di corpi cellulari (soma) nel compartimento assonale mentre la lunghezza dei canali impedisce proiezioni dendritiche di attraversare tutta la strada al compartimento assonale. Dopo circa 2-3 giorni di coltura, neuroni cominciano estendendo loro assoni attraverso microcanali nel compartimento assonale (Figura 1B, C). Assoni transfettate che esprimono proteina prionica normale marcato con proteina fluorescente gialla (YFP-PrP C) possono essere identificati al microscopio a fluorescenza (Figura 1C). Espressione di proteine fluorescente utilizzando plasmide trasfezione deve essere controllata per una corretta localizzazione subcellulare e funzione di sovraespressione potrebbe introdurre artefatti sperimentali a causa di conformazioni di proteine alterate. Così, colocalizatesperimenti di ioni deve essere accompagnato sia con studi di co-precipitazione biochimici, nonché con IF colorazione per proteine espresse endogenamente. Il comportamento del YFP-PrP C usato qui è stato testato in precedenza 16. L'espressione di YFP-PrP C nelle cellule di neuroblastoma trasfettate (N2a) è stato basso, suggerendo che trasfezione transiente non dia luogo a livelli molto sovraespresse YFP-PrP C 16. Inoltre, IF di cellule N2a trasfettate con YFP-PrP C con anticorpi contro PrP C ha indicato che YFP-PrP C altamente colocalizzava con endogena PrP C, suggerendo che sia trasfettate ed endogena PrP C si sono comportati allo stesso modo. Per verificare che la PrP C associata a motori, immunoisolations vescicole sono state eseguite 16.
Per gli studi di mappatura ottimali carico, il bordo di destra dei microcanali è allineato con il campo visivo durante vivo e fissa imaging per l'immagine della stessa regione dell'assone (indicato dal rettangolo rosso nella figura 1B, C). Figura 2 e Figura 3 mostrano risultati rappresentativi per il carico mappatura analisi dei neuroni transitoriamente trasfettate con YFP-PrP C. Vescicole che trasportano YFP-PrP C vengono trasportati in assoni mammiferi dai membri del Kinesin-1 famiglia e Dynein pesante catena 1 (DYNC1H1) 16, quindi vescicole YFP-PrP C sono stati mappati al Kinesin-1 subunità Kinesin Catena leggera 1 (KLC1) , e DYNC1H1 motori. YFP-PrP C movimento delle vescicole è stato ripreso e tracciata in un chimografo (Figura 2A). In kymographs, anterograda e il movimento retrogrado di YFP-PrP C vescicole è rappresentato da traiettorie con pendenze, rispettivamente negativo e positivo, e vescicole stazionarie sono raffigurati dai traiettorie verticali. Al fissazione, ogni movimento smesso indicato dall'assenza di linee diagonali nel chimografo(Figura 2A). Il segnale IF di motori molecolari e carichi di assoni, permeabilizzate fisse è puntata 16 (Figura 2B, C). L'obiettivo di "mappatura carico" è determinare se puncta nel canale di carico (Figura 2B) colocalize con puncta motore (Figura 2C) negli altri due canali. Per fare questo, le immagini fluorescenti di vescicole YFP-PrP C fissi, e le immagini di IF corrispondente KLC1 e DYNC1H1 associate puncta vescicolare sono stati allineati al chimografo (Figura 2B, C). Funzioni gaussiane sono stati montati alle funzioni di punto di diffusione di fonti puntuali fluorescenti in tutti e tre i canali, al fine di mappare le precise posizioni XY dei motori a traiettorie di carico ottenuti con l'imaging dal vivo (Figura 2D). Endogenamente espressi motori KLC1 e DYNC1H1 appaiono come macchie puntiformi e colocalized differenziale con vescicole YFP-PrP C (Figura 2D). Colocalizione è stata definita dalla presenza di YFP-PrP C e puncta motore entro una distanza di 300 nm e quantificato dal livello di colocalizzazione della gaussiana XY posizioni tra il YFP-PrP C e ciascuno dei puncta KLC1 e DYNC1H1 coordinate (Figura 3A ). Questa distanza è stato scelto sulla base degli ottica, limite di diffrazione della luce, e la dimensione fisica rilevante del carico e del motore subunità. La quantità relativa di KLC1 e DYNC1H1 associato YFP-PrP C vescicole sono state ottenute dai ampiezze gaussiane, che rappresentano le intensità di ciascuna puncta (Figura 3B). Questi dati possono essere ulteriormente analizzati lo desideri. Ad esempio, le intensità di motori colocalizing con YFP-PrP C puncta tra controllo (wild-type - WT) neuroni e quelli privi di altri Kinesin-1 subunità (KIF5C - / - neuroni in figura 3A, KIF5C è membro della Kinesin-1 famiglia), può essere paragonata a determinare se la mancanza di KIF5C sconvolge associazione di KLC1 e / o DYNC1H1 per YFP-PrP C vescicole (KLC1 e DYNC1H1 intensità sono rimasti invariati nei nostri esperimenti 16). Inoltre, KLC1 e DYNC1H1 intensità possono essere tracciati per esaminare possibili correlazioni tra i valori relativi a motore e direzionalità di movimento (Figura 3B). Ad esempio, YFP-PrP C vescicole che sono in movimento e / o stazionari associati sia KLC1 e / o DYNC1H1 (Figura 3B).
Figura 1. neuroni dell'ippocampo coltivate in dispositivi microfluidici. (A) Immagine di un dispositivo di microfluidica. I contorni di serbatoi vengono visualizzati con coloranti rosso e blu. Numerazione si riferisce al numero di serbatoi microfluidici utilizzati nel protocollo. (B) Schema di un dispositivo microfluidico. Numeri corrispondono i serbatoin cui si aggiungono i media e neuroni. Neuroni trasfettati sono mostrati in verde. Rettangolo rosso e rosso frecce tratteggiate indicano la regione consigliato per vivo e fissa l'imaging di fluorescenza. (C) Immagine di due assoni trasfettate con YFP-PrP C cresce attraverso un unico microcanali (uno a microcanali e il bordo del dispositivo è delineato da linee bianche tratteggiate) . Si muovono individualmente vescicole YFP-PrP C possono essere distinti come più luminosa puncta. Barra della scala è di 10 micron. La figura è adattato da:.. Encalada ed altri 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. "mappatura Cargo" di correlare il trasporto delle vescicole YFP-PrP C conquantità relative di motori kinesin e dineina. Wide-field immagini di fluorescenza di movimento dal vivo e di carichi fissi sono stati presi su un microscopio invertito dotato di un palco motorizzato e una camera CCD e un obiettivo di olio 100X / 1.4 NA. (A) chimografo di YFP -PrP C movimento delle vescicole di assoni illustrati nella Figura 1C. Circolazione Live è stato registrato per un tempo totale compreso tra 30 e 60 sec a 100 ms di esposizione (10 Hz). Le cellule sono state fissate dopo l'imaging movimento di carico per almeno 15 sec. La linea tratteggiata indica il tempo di fissaggio durante l'imaging in tempo reale. Casella rossa mostra regione delle vescicole evidenziati in (B, C) e ampliato nel (D). Frecce indicano tre vescicole indicate in (D) corrispondenti a fermo (blu), retrogrado (rosso), e anterograda (verde) traiettorie. ( B) Immagine di vescicole YFP-PrP C fissi allineati al corrispondente chimografo. I numeri indicano l'inindividuale YFP-PrP C vescicole che sono stati mappati identificabili puncta sul chimografo. Vescicole anterograda sono verdi, retrograda sono rossi, e quelli fissi sono blu. (C) fisso Se le immagini di KLC1 e DYNC1H1 puncta corrispondente alla stessa regione indicato in (B). Barra di scala (AC) è di 10 micron. (D) L'allargamento fisso IF segnali di ciascuno dei tre canali con incarichi di funzione gaussiana 2D. I puntini blu rappresentano locali massimi di intensità pixel, punti rossi rappresentano adatta gaussiana, e puntini rosa sono la sovrapposizione tra i due. Punte di freccia indicano esempi di YFP-PrP C vescicole mostrati in (A), e la loro co-localizzazione differenziale con proteine motrici KLC1 e DYNC1H1. Barra della scala è di 2 micron. La figura è adattato da:.. Encalada ed altri 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di th è figura.
Figura 3. Analisi quantitative di "mappatura carico" di YFP-PrP C vescicole. (A) Quantificazione di co-localizzazione tra vescicole YFP-PrP C, KLC1 e DYNC1H1 in WT e neuroni KIF5C knockout (KIF5C - / -). Numero totale di puncta analizzato era WT N = 887 e N KIF5C - / -. = 1629 16 I numeri all'interno barre rappresentano il numero di vescicole per categoria. Riportati sono medie ± SEM. Test di permutazione t non parametrico è stato utilizzato per il confronto tra i genotipi 29. (B) correlazione della composizione relativo motore e la direzionalità del movimento WT neuroni di dati analizzati in (A). La figura è adattato da: Encalada et al 16...jove.com / files / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentata consente la correlazione di direzionalità del movimento delle singole particelle in movimento del carico basato microtubuli-fluorescenti con il tipo e la quantità relativa di proteine motrici collegate a neuroni vivi. In precedenza, la composizione totale del motore di carichi vescicolari assonale è stato analizzato su popolazioni eterogenee di vescicole e organelli 9,15 biochimicamente purificati. Tuttavia, caratterizzando composizione motore per un singolo tipo di carico all'interno delle cellule è stata difficile a causa della difficoltà nel purificare popolazioni di vescicole omogenee. Inoltre, mentre le misure di stallo-forze motrici hanno fornito stime di numeri motore attivi in embrioni di Drosophila, non era chiaro se la direzionalità di movimento correlato ai motori essendo stabilmente legate ai carichi o alla rapida associazione / dissociazione di motori attivi da / per carico 12. Pertanto, il protocollo "cargo mappatura" descriletto qui è stato sviluppato per approfondire la correlazione tra il tipo e il numero relativo di motori associati a muoversi individualmente carico nei neuroni vivi.
Per ottenere con successo i dati da "mappatura carico" è fondamentale 1) effettuare l'imaging di movimento carico e FI fissati alta risoluzione temporale e spaziale, 2) garantire un fissaggio immediato del campione durante il corso di formazione immagine, 3) allineare la regione di interesse in immagini in diretta e fisse e piano di carico fissa e motori a kymographs movimento per le stesse immagini e 4) determinare con esattezza le coordinate XY del carico e puncta fluorescente motore per determinare la quantità di colocalizzazione tra carico e motore proteine.
Anche se questo protocollo è particolarmente adatto per analizzare le caratteristiche di trasporto negli assoni dei neuroni organizzati in modo uniforme coltivate in dispositivi microfluidici, potrebbe essere adattato ad una vasta gamma di domande di ricerca. Ad esempio, questo applizione potrebbe essere utilizzato per caratterizzare sezione vescicole con i loro adattatori coinvolti nella endo / esocitosi (ad esempio, saggi di traffico in fibroblasti), o la crescita dei microtubuli marcati con proteine microtubuli + punta vincolanti. Per questi dispositivi microfluidici potrebbero essere sostituiti da coprioggetto reticolati per facilitare la localizzazione delle cellule impressi necessarie vivo correlativa e studi di imaging fissi. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per caratterizzare eventi cellulari per cui un parametro cambiamenti nel tempo a seconda dell'ambiente cellulare specifica. Ad esempio, il rilascio di una proteina virale fluorescente da strutture endosomali individuali nel citoplasma potrebbe essere correlato con l'espressione e / o associazione di proteine endosomali.
Una possibile limitazione di questo protocollo è che la mappatura dei carichi ad alta densità potrebbe essere difficile. Tuttavia, l'assegnazione di funzioni gaussiane aggira questo problema in larga misura, consentendodistinzione di posizioni tra puncta fluorescente a livello sub-pixel. Inoltre, la mappatura dei motori per carichi assonale è bassa-velocità: attualmente, la mappatura può essere fatto per 2 assoni per dispositivo microfluidica, dato il basso tasso di trasfezione di neuroni e il campo di vista limitato quando si utilizza l'alto ingrandimento necessario per alta risoluzione delle immagini con la nostra macchina fotografica. Gli sviluppi futuri di questo metodo potrebbero includere l'uso di sistemi lentivirali di trasdurre neuroni con maggiore efficienza, l'isolamento dei neuroni di topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti tag o l'etichettatura di organelli con piccole coloranti fluorescenti, come Lysotracker o Mitotracker, ognuno dei quali aumenterà la numero di assoni marcati con marcatori fluorescenti. Inoltre, la dimensione dell'area registrata è limitata per l'ingrandimento, la dimensione dei pixel e la dimensione della matrice di pixel della telecamera utilizzata per l'imaging. Sviluppi in corso nel campo delle tecniche di imaging consentiranno zona più ampias da acquisire in futuro e quindi aumentare la quantità di dati ottenuti per ogni condizione sperimentale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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