Abstract
فهم الآليات التي المحركات الجزيئية تنسيق أنشطتهم لنقل البضائع حويصلي داخل الخلايا العصبية يتطلب التحليل الكمي للجمعيات المحرك / البضائع على مستوى حويصلة واحدة. الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام المجهر مضان الكمي لربط ("الخريطة") موقف وتوجه حركة البضائع الحية إلى كميات تكوين والنسبية المحركات المرتبطة بنفس البضائع. "رسم الخرائط للشحن" يتكون من التصوير الحي للبضائع fluorescently المسمى تتحرك في محاور مثقف على أجهزة ميكروفلويديك، تليها تثبيت الكيميائي أثناء تسجيل الحركة الحية، والمناعي لاحق (IF) تلطيخ من نفس المناطق بالضبط محور عصبي مع الأجسام المضادة ضد المحركات. ويتم تقييم Colocalization بين الشحنات والمحركات المرتبطة بها من خلال تخصيص موقف الفرعي بكسل تنسق لقنوات السيارات والبضائع، من خلال وظائف جاوس مناسبة للحيود ليثيومmited انتشار نقطة ظائف يمثلون الفردية مصادر نقطة الفلورسنت. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة لاحقا إلى قطع حركة البضائع، ل"الخريطة" لهم لتتبع مساراتها. قوة هذا البروتوكول هو مزيج من العيش وإذا كانت البيانات لتسجيل كل من نقل الشحنات حويصلي في الخلايا الحية وتحديد المحركات المرتبطة نفس هذه الحويصلات الدقيقة. هذه التقنية تتغلب التحديات السابقة التي تستخدم أساليب الكيمياء الحيوية لتحديد متوسط تكوين محرك تنقيته غير متجانسة السكان حويصلة بالجملة، لأن هذه الأساليب لا تكشف التراكيب على الشحنات المتحركة واحدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل مسارات النقل و / أو الاتجار أخرى في أنواع الخلايا الأخرى لربط حركة هياكل داخل الخلايا الفردية مع تكوين البروتين. قيود من هذا البروتوكول هي إنتاجية منخفضة نسبيا نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مثقفالخلايا العصبية الابتدائية وحقل المحدود المتاح لعرض عالية الدقة التصوير. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية طرق لزيادة عدد الخلايا العصبية معربا عن الشحنات fluorescently المسمى.
Introduction
النقل داخل الخلايا أمر حاسم في جميع أنواع الخلايا لتسليم البروتينات والأغشية، والعضيات، والجزيئات يشير الى مختلف المجالات الخلوية 1. الخلايا العصبية وخلايا متخصصة للغاية مع طويلة، توقعات الاستقطاب التي تعتمد بشكل كبير على نقل البضائع داخل الخلايا الأساسية للتسليم لمسافات طويلة لمختلف microdomains محور عصبي. وتوسط هذا النقل kinesins وdyneins - عائلتين كبيرة من البروتينات المحركات الجزيئية - التي ترتبط وتتبع الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة الاستقطاب في تقدمي ورجعية الاتجاهات، على التوالي. في حين تتوسط أساسا حركة تراجعية من قبل داينين، مما يسهل التحرك في الاتجاه تقدمي قبل الكبيرة، عائلة متنوعة من المحركات كينيسين وظيفيا. بالتالي، نقل البضائع تقدمي محور عصبي يمكن بوساطة مختلف أفراد الأسرة من الفصيلة كينيسين 1-5. على الرغم من بعض الشحنات تتحرك باستمرار في كلا الاتجاهين، مOST الشحنات تتحرك في الاتجاهين وعكس كثير من الأحيان في طريقهم إلى وجهاتهم النهائية 1،5-13. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المحركات معارضة الاتجاهية الزميلة في وقت واحد لشحنات، مما يثير السؤال عن كيفية يتم تنسيق حركة البضائع الخاضعة للتنظيم من قبل محركات عكس القطبية 5-7. معا، نقل الشحنات محور عصبي هو عملية منسقة الذي ينظمه تكوين المحركات والأنشطة البيوكيميائية الخاصة بها، والتي بدورها تعتمد على محولات مختلفة وشركاء ملزم التنظيمي 14.
لوصف بأمانة آلية نقل المحاور لشحنة محددة والكشف عن التنظيم الكامن وراء هذا النقل، فإن من الأهمية بمكان لتحديد تكوين البروتينات الحركية وشركاء ملزم التنظيمي المرتبطة الشحنات الفردية خلال نقلها المباشر. أساليب أخرى، على سبيل المثال مناهج الكيمياء الحيوية، وتوفر تقديرات متوسط يذكرهأو التراكيب على النقى السكان حويصلة غير متجانسة، ولكن هذه التقديرات لا تكشف عن نوع أو كمية من المحركات المرتبطة الحويصلات واحدة متحركة. أيضا، إعادة تشكيل حويصلة النقل على طول الأنابيب الدقيقة مجمعة مسبقا في المختبر مكنت قياس كمية نوع واحد من السيارات على مستوى حويصلة واحدة 15. ومع ذلك، فإن هذه التجارب لا ترتبط بشكل مباشر على كمية من المحركات مع خصائص نقل تلك الحويصلات، وقياس النقل في غياب العوامل التنظيمية الخلوية.
بروتوكول يرد هنا، والذي يحدد تكوين المحرك (نوع وكمية النسبي للمحركات) من الحويصلات الانتقال من الفردية أعرب المناعي (IF) بيانات قياس التطور الطبيعي البروتينات الحركية، ويرتبط هؤلاء المعلمات إلى النقل المباشر لنفس الحويصلات بالضبط في الخلايا العصبية 16. ويستتبع هذا طريقة التعيين الدقيق لل-IF إلى العيش البيانات حركة البضائع. ويتم إنجاز ذلك من خلال growinز الخلايا العصبية قرن آمون في الماوس الأجهزة ميكروفلويديك بعد ثبوت بروتوكولات 17-19. هذه الأجهزة تسمح لتحديد والارتباط ("الخرائط") من المحاور والشحنات تتحرك واحدة في طرائق ضوء المجهر الثابتة والحية (الشكل 1). و transfected الخلايا العصبية مثقف مع fluorescently البروتينات المسماة البضائع التي تم تصويرها في القرار المكانية والزمانية عالية للحصول على معلومات مفصلة الحركة أن يتم رسم في kymographs النقل. أثناء التصوير، ويتم إصلاح الخلايا العصبية مع امتصاص العرق، وبعد ذلك الملون مع الأجسام المضادة ضد البروتينات الحركية الذاتية. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة على kymographs الحركة الحية إلى "خريطة" (colocalize) لهم البضائع الحية مسارات حركة 16. لربط الحركة الحية للبضائع مع جمعية البروتينات الحركية، ويتم تحليل colocalization باستخدام العرف MATLAB حزمة برامج تسمى "موتور Colocalization "16،20. شحنات fluorescently المسمى ومحركات تولد محدودة حيود منقط الميزات التي يمكن أن تتداخل جزئيا. لحسم الموقف من نقاط ومتداخلة، البرنامج الأول تلقائيا يناسب ظائف جاوس إلى كل وظيفة انتشار نقطة، تمثل نقاط والفلورسنت الفردية، لتحديد موقف XY الفرعية بكسل دقة بهم تنسق وشدة سعة 21-23، ومواقف للسيارات والبضائع و بعد ذلك مقارنة مع بعضها البعض لتحديد colocalization 16،20. وبالتالي، هذا الأسلوب يكلف أكثر دقة colocalization بين نقاط والفلورسنت بالمقارنة مع الطرق الأخرى 24.
قوة هذه الطريقة هي القدرة على تقييم colocalization المحركات مع الشحنات الفردية في الخلايا الثابتة، والتي كانت مسارات الحركة الحية (على سبيل المثال، في الاتجاه الذي كانت تتحرك في وقت التثبيت) تفصيلأورديد. مع هذا الأسلوب، تم العثور على kinesins وdyneins لربط في الوقت نفسه إلى الحويصلات التي تحمل بروتين بريون العادي (بي ار بي -cellular C)، شحنة المخصب neuronally التي تتحرك في الاتجاهين أو تبقى ثابتة في 16 محاور. يسمح هذا التحليل في صياغة نموذج للعمل لتنظيم حركة C بي ار بي الحويصلة التي تقدمي (كينيسين) ورجعية (داينين) محركات تنسيق أنشطتها من أجل تحريك الحويصلات في كلا الاتجاهين أو أن تبقى ثابتة بينما المرتبطة البضائع . قوة أخرى هذه الطريقة هي إمكانية تطبيقه واسع محتمل للتميز colocalization / جمعية العديد من الشحنات fluorescently المسمى التي تتحرك في الواقع أي نوع من الخلايا، مع أي بروتين آخر (ق) من الفائدة. وبالتالي، يمكن أن يعيش / علاقة ثابتة يحتمل أن تسمح للكشف عن عابرة تفاعلات البروتين البضائع، العديد من الأفراد fluorescently المسمى تتحرك الجزيئات يمكن تحليلها على مدى ع المطلوبeriod من الزمن. نظرا لتطبيق واسع ونوع الأسئلة التي يمكن أن تعالج هذه الطريقة، فإن هذا البروتوكول تكون ذات فائدة لجمهور واسع من علماء الأحياء الخلايا بما في ذلك أولئك الذين يدرسون الاتجار والنقل في الخلايا العصبية أو في أنواع الخلايا الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب التالية البروتوكولات المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للرعاية الإنسانية للحيوانات التجارب. الموت الرحيم كانت الفئران حديثي الولادة بواسطة قطع الرأس.
1. إعداد الأجهزة ميكروفلويديك للثقافة الخلية
- إعداد polydimethyl siloxane (PDMS) أجهزة ميكروفلويديك لنمو الخلايا العصبية قرن آمون كما وصفه هاريس وزملاؤه 17-19. وفيما يلي بعض التعديلات التي تم تكييفها وفقا لبروتوكول رسم الخرائط البضائع.
ملاحظة: الأجهزة ميكروفلويديك هي أيضا متوفرة تجاريا (قائمة المواد)، وبالتالي الوصول إلى منشأة لتصنيع ليست ضرورية. - إعداد رقم 1½ غطاء نظارات (24 × 40 ملم) من خلال غسلها ثلاث مرات مع الأسيتون، تليها ثلاث غسلات مع الإيثانول بنسبة 100٪ وثلاث غسلات من الماء. متجر coverslips في الماء عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. هذه العلاجات تساعد على ضمان أن coverslips نظيفة من الحطام التي قد تتداخل مع الطلاء من سلليرة سورية، والتلوث، والبقاء على قيد الحياة.
ملاحظة: الأسيتون والإيثانول قابلة للاشتعال والخطرة في حالة ملامسة الجلد (توتر)، اتصال العين (توتر)، من الابتلاع، استنشاق. التصرف وفقا للوائح الرسمية. - عندما تصبح جاهزة للاستخدام، وضع غطاء زجاجي واحد في صحن 60 ملم ثقافة الخلية في الجهاز ميكروفلويديك، والسماح لها الهواء الجاف كشف لمدة 45 دقيقة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث.
- بعد قطع الأجهزة الخروج من الماجستير وتم قطع اللكمات لإنشاء الخزانات (الشكل 1A، B)، ووضعها مع قنوات ميكروفلويديك جانب المتابعة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 45 دقيقة للتعقيم.
ملاحظة: الأجهزة تحت العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ترك لفترة أطول من 2 ساعة قد تؤثر على سلامة PDMS. - تجميع الأجهزة عن طريق وضع جهاز واحد على كل غطاء زجاجي داخل صحن 60 ملم ثقافة الخلية البلاستيكية بحيث تواجه القنوات ميكروفلويديك أسفل. تطبيق ضغط لطيف على س العلويو الجهاز (تجنب لمس و microchannels) لتوفير الختم غير دائم في الجهاز على الزجاج غطاء. تغطية كل 60 مم طبق ثقافة الخلية مع غطاء.
- باستخدام micropipette، هيدرات الأجهزة من خلال إضافة زراعة الخلايا الماء درجة إلى الأعلى خزانين ميكروفلويديك (1 و 2 في الشكل 1A)، والسماح لتدفق المياه من خلال. إزالة المياه مع ممص مكروى وإضافة 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في خزان ميكروفلويديك 1 (200 ميكرولتر) و 2 (100 ميكرولتر). والفرق حجم يسمح للبولي-L-يسين في التدفق من خلال و microchannels (الشكل 1A، B).
- لضمان أن تكون الأجهزة داخل 60 ملم أطباق زراعة الخلايا لا يسقط داخل الحاضنة 37 درجة مئوية، وضع ثلاثة أطباق ثقافة خلية 60 ملم تحتوي على أجهزة إلى 150 ملم خلية البلاستيك صحن الثقافة وتغطية صحن مع غطاء. احتضان O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. عادة أكثر من 90٪ من القنوات التي يمكن استخدامها في الجهاز والقياملا تحتوي على أي فقاعات الهواء أو انسداد المادي.
- في اليوم التالي، استبدال بولي-L-يسين بالماء ويترك الجهاز في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل. تكرار هذا الغسيل ثلاث مرات. إزالة الماء وإضافة Neurobasal-A متوسطة النمو (التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق و 500 ميكرومتر GlutaMAX) لكل جهاز. ترك O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- في اليوم التالي، لوحة خلايا قرن آمون كما هو موضح أدناه.
2. تصفيح من الفأر الخلايا العصبية الحصين الابتدائية في أجهزة ميكروفلويديك
ملاحظة: إعداد الخلايا العصبية الحصين مثقف من الفئران حديثي الولادة قد نشرت سابقا في إن الرب 25. وفيما يلي بعض التعديلات التي تم تكييفها لوحة الماوس الخلايا العصبية قرن آمون في أجهزة ميكروفلويديك، والتي كانت الأمثل لtransfections.
- قبل الماوس تشريح الدماغ، قبل الدافئ Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني(FBS، وبدون المضادات الحيوية)، خليط ألف (125 ملغ DL-السيستين، 125 ملغ ألبومين المصل البقري (BSA) و 3.125 غرام من مد الجلوكوز في 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)؛ فلتر تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون) وديوكسي ريبونيوكلياز أنا الحل (الدناز الأول: 50 ملغ من الدناز أنا و 0.5 مل من 1.2 M MgSO 4 الحل في 100 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) فلتر تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون) في 37 ° C حمام الماء.
- قبل الدافئ Neurobasal-A المتوسطة النمو داخل حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 للتوازن الرقم الهيدروجيني.
- تشريح الحصين 1-3 يوم الفئران حديثي الولادة القديمة وفقا للبروتوكولات المعمول 26. الحفاظ الحصين في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل تشريح عازلة (HBSS تحتوي على 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 50 ملي الجلوكوز، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين)، على الجليد. طرح 4 الحصين لكل 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أداء بروتوكول المتبقية تحت شرط العقيمةS داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- تمييع 45 وحدة من غراء في 5 مل من خليط A، الدوامة، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يذوب المسحوق غراء. إضافة 1 مل من محلول الدناز أنا. تصفية الخليط من خلال 0.22 ميكرون وحدة مرشح حقنة.
- نضح بعناية HBSS "من 15 مل المخروطية أنبوب يحتوي الحصين. إضافة 10 مل من البرد (4 درجات مئوية) HBSS إلى الحصين والسماح لهم تستقر في قاع الأنبوب. نضح بعناية HBSS من 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إضافة 1 مل غراء / الدناز أنا مزيج لتصل إلى 4 الحصين واحتضان لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إمالة أنبوب مخروطي كل 5 دقائق ليستحم الحصين مع المزيج. وضع بدلا الحصين في 37 درجة مئوية ماء الحمام لطيف شاكر مع اهتزاز (~ 100 دورة في الدقيقة).
- نضح غراء / الدناز أنا خلط وغسل الحصين مرتين قبل تحسنت DMEM (37 ° C) تحتوي على 10٪ FBS.
- بعد غسل الثاني، إضافة 2 مل من قبل تحسنت DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى الحصين الحصين ويسحن يدويا من قبل pipettingصعودا وهبوطا ~ 10-12 مرات باستخدام ماصة 1 مل لفصل الخلايا العصبية.
- دعونا يسحن تسوية ل~ 1 دقيقة وهذا سوف يسمح الخلايا العصبية غير نأت لتستقر في قاع الأنبوب المخروطي. نقل طاف تحتوي على الخلايا العصبية فصلها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تجنب نقل الأنسجة الكبيرة التي استقرت في قاع الأنبوب.
- تدور الخلايا في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالتها بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية. الخلايا resuspend في 80 ميكرولتر Neurobasal-A المتوسطة النمو من قبل pipetting بلطف.
- إزالة المتوسطة من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 '. تطبيق 20 ميكرولتر من الخلايا (~ 275000) إلى خزان ميكروفلويديك 1، والسماح لهم بالتدفق من خلال. وضع الجهاز في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة.
- تبدو تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا انضمت إلى الزجاج غطاء. إضافة Neurobasal-A المتوسطة النمو إلى أعلى قبالة كل الخزانات. يعود الجهاز مع الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪
- تحقق الأجهزة ~ كل 2-3 أيام وأعلى من الخزانات مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق (بدون GlutaMAX) لتجنب التبخر. تبدأ الخلايا العصبية لتوسيع محاور من خلال قنوات ميكروفلويديك ~ 2-3 أيام بعد الطلاء. الخلايا العصبية تخضع لترنسفكأيشن عادة 7-10 أيام بعد الطلاء.
3. ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين يزرع في جهاز ميكروفلويديك
- لكل جهاز، وإعداد مزيج من 1.2 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 30 ميكرولتر Neurobasal-A، ومزيج من 0.5 ميكروغرام الفلورسنت الانصهار البضائع بلازميد في 30 ميكرولتر Neurobasal-A واحتضان 5 دقائق على RT. إضافة Lipofectamine المزيج لمزيج الحمض النووي واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. إضافة 60 ميكرولتر من Neurobasal-A التي تحتوي على 4٪ B-27 تكملة لDNA / Lipofectamine خلط ومزج عبها الأنبوب.
- إزالة جميع وسائل الإعلام من خزان ميكروفلويديك 2 و 2 "وملء بعناية الآبار مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق دون إراقة على المدى المتوسط الباحثس المقصورات الأخرى.
- إزالة وسائل الاعلام من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 '. إضافة 120 ميكرولتر من الحمض النووي / Lipofectamine المزيج إلى خزان ميكروفلويديك 1 والسماح لها بالتدفق. يعود الجهاز إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة CO 2 5٪ لمدة 3-4 ساعة.
- إزالة جميع وسائل الإعلام من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 "واستبدالها مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحقا لمدة 24 ساعة (أو حتى جاهزة للصورة). عادة، و transfected 5-7 المحاور التي تنمو من خلال microchannels في ظل هذه الظروف، والتي تمثل حوالي 1-3٪ كفاءة ترنسفكأيشن تتفق مع الكفاءات التي نشرت عن الخلايا المستزرعة الحصين 26.
4. "شحن رسم الخرائط" تحليلات
- التصوير المباشر لحركة البضائع
- إجراء التصوير على ضوء المجهر epifluorescence مقلوب مجهزة الحاضنة 37 درجة مئوية، وغرفة التحكم CO 2.
- جبل ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في ميكرجهاز ofluidic على خشبة المسرح المجهر. لتجنب موت الخلايا العصبية، والعمل على وجه السرعة للحفاظ على العينات في المجهر مدة لا تزيد عن 1 ساعة.
- باستخدام الهدف عالية الدقة (100X)، والعثور على محاور عصبية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عبر القنوات التي تمتد من غرف ميكروفلويديك وتسجيل عدد من القنوات التي تم العثور محور عصبي transfected. عد عدد من القنوات باستخدام عداد اليد رصيده.
- لتسجيل الأمثل للحركة الحية وتحليل colocalization لاحق، واختيار المحاور التي تنمو مسطح نسبيا من خلال القنوات بحيث تصوير معظم الحويصلات يمكن أن يؤديها في التركيز.
- إزالة معظم المتوسطة من الخزانات 2 و 2 'مع 1 مل نقل ماصة بلاستيكية. لتسهيل المواءمة اللاحقة من الصور الثابتة مع مسارات الحركة على kymographs، محاذاة الحافة اليمنى و microchannels مع مجال الرؤية أثناء التصوير (الشكل 1B، C).
- لتسهيل فيشينغرام من العينات أثناء التصوير، وأداء التصوير الحي مع شخصين. بدلا من ذلك، إذا يتم إجراء التصوير الحي من قبل شخص واحد، واستخدام نظام المجهر مجهزة تصحيح الانحراف.
- بدء تصوير حركة البضائع الحية مع مرور الزمن مواصفات محددة لديناميات نقل البضائع التي يجري تحليلها (المجهر مواصفات وإعدادات التصوير YFP بي ار بي-C المحددة في أسطورة الشكل 2 والمواد القائمة).
- بعد أن تم جمع بيانات حركة حية كافية، لدينا شخص واحد تملأ الخزانات 2 و 2 "مع تدفئته قبل بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.04 غ / مل السكروز لإصلاح الخلايا. تجنب لمس الجهاز ميكروفلويديك، لأن هذا سيؤدي إلى اختلال التركيز في التصوير الحي. يكون الشخص الآخر ضبط التركيز بينما يتم إضافة تثبيتي. تثبيت ناجحا عندما لوحظ توقف الفوري عن الحركة. إضافة تثبيتي إلى خزان 1 و 1 "بعد ذلك.
ملاحظة: photoblea المؤقتةتشينغ من مضان البضائع ويمكن أيضا ملاحظتها، ولكن استمر مضان بعد اكتمال إذا تلطيخ للبروتينات السيارات (الخطوة التالية).
ملاحظة: لامتصاص العرق هو ضار عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد، وإذا ابتلع. مهيجة للعيون والجهاز التنفسي والجلد. التصرف وفقا للوائح الرسمية.
- إذا تلطيخ البروتينات الحركية لتحليل colocalization
ملاحظة: للحصول على الكميات النسبية من مستويات البروتينات الحركية (كما هو محدد من قبل تلوين الأجسام المضادة)، المرتبطة الشحنات تتحرك الفردية، والتحقق من صحة معايرة الأجسام المضادة للتأكد من أن الضد مستضد ملزمة مشبعة. يتم ذلك عن طريق تحديد خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الخلايا العصبية التي البروتين من الفائدة وقد طرقت التدريجي إما أو طرقت إلى أسفل، وطريق إجراء تحليل IF مع زيادة تركيز الأجسام المضادة. لضوابط السلبية، هي ملطخة الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة الثانوية في غياب الأجسام المضادة الأولية. أكثر تفصيلاوصف التحقق من صحة الأجسام المضادة يمكن العثور عليها في Encalada وآخرون 16، وSzpankowski وآخرون 20.- إزالة ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في جهاز ميكروفلويديك من مرحلة المجهر. لا فصل الجهاز ميكروفلويديك من ساترة، كما تحتاج و microchannels لتبقى سليمة من أجل ركب الصور الحية والثابتة. تنفيذ الخطوات التالية في غرفة الرطوبة.
- لضمان تدفق إلى حلول و microchannels، والحفاظ على فارق حجم عازلة بين الخزانات 1، 1، و 2، 2 'من لا يقل عن 30 ميكرولتر. في جميع الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، إضافة حجم 100 ميكرولتر وسائل الإعلام إلى خزان ميكروفلويديك 2، 2 '، وحجم وسائل الإعلام 70 ميكرولتر إلى خزان ميكروفلويديك 1، 1'.
- إزالة تثبيتي من دوائر الجهاز ميكروفلويديك وغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني انتظار 10 دقيقة بين يغسل.
- Permeabilize خلايا بإضافة 0.1٪ تريتون X-100 diluتيد في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لجميع الخزانات.
- إزالة حل من كل الخزانات ويغسل مع برنامج تلفزيوني. تكرار الغسيل ثلاث مرات انتظار 10 دقيقة بين يغسل.
- إزالة حل من كل الخزانات وتطبيق حظر العازلة التي تحتوي على 10٪ مصل حمار عادي و 3٪ البروتيني الحر والغلوبولين المناعي G (مفتش) خالية BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
- تدور حل الأسهم الأجسام المضادة الأولية في 20000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الرواسب. تمييع الأجسام المضادة للتركيز المناسب في عرقلة العازلة. استبدال عازلة تمنع من جهاز ميكروفلويديك مع الحل الضد. احتضان عينات لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
- إزالة حل من كل الخزانات ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، والانتظار 10 دقيقة بين يغسل.
- تدور حل الأسهم الضد الثانوية في 20000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الرواسب. تمييع الأجسام المضادة للتركيز المناسب في عرقلة العازلة. استبدال برنامج تلفزيوني مع الحل الضد الثانوية. احتضانعينات لمدة 1 ساعة على RT.
- إزالة حل من كل الخزانات ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، والانتظار 10 دقيقة بين يغسل.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع ~ 10-20 ميكرولتر المتوسطة المتزايدة من قبل pipetting مباشرة تصاعد المتوسطة في فتح قنوات ربط الخزانات. دعونا تصاعد الإعلام الجافة لل~ 20 دقيقة - 1 ساعة على RT.
- أجهزة تخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء لتجنب photobleaching من ومحاور الصورة خلال يومين (بحد أقصى أسبوع واحد) من تلطيخ.
- بعد اكتمال التلوين، جبل ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في جهاز ميكروفلويديك على خشبة المسرح المجهر. تحديد موقع المنطقة من محور عصبي transfected تصويرها في خطوة 4.1.1-4.1.7.
- الحصول على صور Z كومة (300 الخطوات نانومتر) لكل واحدة من ثلاث قنوات: البضائع، والسيارات 1، 2 المحرك، وذلك باستخدام الهدف عالية الدقة (على سبيل المثال، فإن أحد الأهداف عالية النفط الفتحة العددية أو الماء).
ملاحظة: شراء Z-مداخن لا يقل أهمية عن المحاور غالبا لا تنمو مسطحة تمامافي microchannels، وبالتالي ليس كل نقاط والفلورسنت الموجودة في نفس المستوى البؤري.
- رسم الخرائط البضائع
- توليد مخطاط التموج من حركة البضائع باستخدام برمجيات تحليل الصور. وأوصى البرنامج المساعد يماغيج التي وضعتها Rietdorf وسيتز (EMBL) لتوليد kymographs (للتحميل نرى قائمة المواد).
ملاحظة: يماغيج هو المجال العام، جافا القائمة على برنامج معالجة الصور المتقدمة في المعاهد الوطنية للصحة 27،28 (للتنزيل رؤية قائمة المواد). - محاذاة الصور الثابتة من البضائع الفلورسنت (إنشاؤها في الخطوة 4.2.14) يدويا بتركيب لهم على موقف مسارات في مخطاط التموج عند نقطة تثبيت (الشكل 2A، B)، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي الرسوم البيانية المتاحة تجاريا (المواد القائمة). محاذاة يدويا بتركيب أول صورة ثابتة على البضائع مخطاط التموج واختيار نقاط والبضائع الذي يتوافق مع مسار معين على يدوياومخطاط التموج. للحصول على أفضل النتائج المحاذاة، استخدام شريحة Z الذي هو في أفضل التركيز على البضائع المعين. ويمكن استخدام عدة شرائح Z.
- لكل صورة في Z-كومة (البضائع والسيارات والمحركات 1 2، تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.14) تحديد XY تنسق وسعة كثافة لكل نقاط والفلورسنت باستخدام خوارزمية أنشئت لتناسب 2D Gaussians إلى انتشار وظيفة النقطة التي تمثل مصدر كل نقطة في كل من القنوات الثلاث 16،20،21 (الشكل 2D).
ملاحظة: للحصول على XY تنسق، مجموعة برمجيات MATLAB عرف بني تسمى "موتور Colocalization" وقد وضعت 16،20، الذي يتضمن خوارزمية جاوس المناسب وضعتها Jaqaman، Danuser وزملاؤه 21-23. حزمة البرامج وتعليمات مفصلة لاستخدامها ويمكن الحصول على الطلب. - لكل واحدة من نقاط والبضائع بشكل فردي التي تم تعيينها على مسارات النقالة أو الثابتة على مخطاط التموج، ر تحديدانه XY الإحداثيات وسعة كثافة من نتائج برنامج "موتور Colocalization" (وصفت هذه الشحنات بشكل فردي في الشكل 2B). استخدام عدة صور Z كومة المكتسبة في الخطوة 4.2.14) لتعيين المزيد من الشحنات التي تم العثور عليها على متن طائرات التنسيق المختلفة.
- مقارنة بتنسيق XY الفردية للشحن المعينة لتلك التي حصلت في كل من القنوات السيارات في المقابلة Z شريحة (الشكل 2D). تحديد وتحديد إحداثيات XY السيارات التي تقع ضمن دائرة نصف قطرها 300 نانومتر من البضائع. للبضائع والمحركات التي لها إشارة في نفس المستوى البؤري، واستخدام "موتور Colocalization" مجموعة من البرامج لتحديد نقاط والتي تقع ضمن دائرة نصف قطرها 300 نانومتر.
- توليد مخطاط التموج من حركة البضائع باستخدام برمجيات تحليل الصور. وأوصى البرنامج المساعد يماغيج التي وضعتها Rietdorf وسيتز (EMBL) لتوليد kymographs (للتحميل نرى قائمة المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن الجهاز ميكروفلويديك تستخدم لزراعة الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 1A، B). ومطلي الخلايا العصبية في خزان 1. حجم و microchannels يمنع نشر أجسام الخلايا (سوما) في حجرة محور عصبي في حين أن طول قنوات يمنع التوقعات شجيري من عبور على طول الطريق إلى المقصورة محور عصبي. ~ بعد 2-3 أيام في الثقافة، وتبدأ الخلايا العصبية التي تمتد عبر محاور microchannels في حجرة محور عصبي (الشكل 1B، C). ويمكن تحديد محاور Transfected التعبير عن بروتين بريون العادي المسمى مع بروتين فلوري أصفر (YFP-بي ار بي سي) بواسطة المجهر مضان (الشكل 1C). يجب أن يتم التحقق التعبير عن البروتينات fluorescently المسمى باستخدام البلازميد ترنسفكأيشن لتوطين التحت خلوية السليم وظيفة overexpression قد يعرض التحف التجريبية بسبب التشكل البروتين تغييرها. وبالتالي، colocalizatيجب أن يكون أثنى على حد سواء مع الدراسات البيوكيميائية شارك في هطول الأمطار، وكذلك مع IF تلطيخ للبروتينات وأعرب التطور الطبيعي التجارب أيون. تم اختبار سلوك YFP بي ار بي-C المستخدمة هنا سابقا 16. كان التعبير عن YFP بي ار بي-C في الخلايا العصبية عابر (N2a) منخفضة، مما يوحي بأن ترنسفكأيشن عابرة لا يؤدي إلى مستويات عالية overexpressed YFP بي ار بي-C 16. وعلاوة على ذلك، إذا الخلايا N2a transfected مع YFP بي ار بي-C باستخدام أجسام مضادة ضد بي ار بي سي إلى أن YFP بي ار بي-C colocalized للغاية مع الذاتية بي ار بي C، مما يشير إلى أن كلا transfected والذاتية بي ار بي سي تصرف مماثل. للتأكد من أن بي ار بي سي المرتبطة المحركات، وأجريت immunoisolations حويصلة 16.
للدراسات الخرائط البضائع المثلى، يتم محاذاة الحافة اليمنى و microchannels مع مجال الرؤية أثناء الحية والثابتة IMAجينج من أجل صورة في نفس المنطقة من محور عصبي (المشار إليها المستطيل الأحمر في الشكل 1B، C). الشكل 2 والشكل 3 تظهر نتائج تمثيلية للشحن رسم الخرائط يحلل الخلايا العصبية عابر مع YFP بي ار بي-C. ويتم نقل الحويصلات تحمل YFP بي ار بي-C في محاور الثدييات من قبل أفراد الأسرة كينيسين-1 وداينين السلسلة الثقيلة 1 (DYNC1H1) 16، تم تعيين بالتالي الحويصلات YFP بي ار بي-C إلى كينيسين-1 فرعية كينيسين الخفيفة سلسلة 1 (KLC1) ، وDYNC1H1 المحركات. تم تصوير YFP بي ار بي-C حركة الحويصلة وتآمر في مخطاط التموج (الشكل 2A). في kymographs، ويمثل تقدمي وحركة تراجعية من الحويصلات YFP بي ار بي-C بواسطة مسارات مع المنحدرات السلبية والإيجابية، على التوالي، ويصور من خلال مسارات ثابتة الحويصلات الرأسية. في التثبيت، وتوقفت عن الحركة التي أشار إليها غياب الخطوط القطرية في مخطاط التموج(الشكل 2A). إشارة IF المحركات والشحنات الجزيئية في، محاور permeabilized الثابتة هو منقط 16 (الشكل 2B، C). هدف "خرائط البضائع" هو لتحديد ما إذا نقاط والبضائع في قناة (الشكل 2B) colocalize مع نقاط والمحركات (الشكل 2C) في غيرها من القناتين. للقيام بذلك، هي التي تنسجم الصور الفلورسنت الثابتة الحويصلات YFP بي ار بي-C، والصور إذا من KLC1 وDYNC1H1 المرتبطة نقاط وحويصلي المقابلة لمخطاط التموج (الشكل 2B، C). تم تركيب ظائف جاوس إلى انتشار نقطة ظائف مصادر نقطة الفلورية في جميع القنوات الثلاث من أجل رسم خريطة للمواقف XY دقيقة من المحركات لمسارات البضائع التي حصلت عليها التصوير الحي (الشكل 2D). أعرب التطور الطبيعي تظهر KLC1 وDYNC1H1 المحركات كما منقط تلطيخ وcolocalized تفاضلي مع حويصلات YFP بي ار بي-C (الشكل 2D). Colocaliوقد عرفت zation بحضور YFP بي ار بي-C ونقاط والسيارات على مسافة 300 نانومتر وكميا من مستوى colocalization من التمويه XY تنسيق المواقف بين YFP بي ار بي-C وكل من KLC1 وDYNC1H1 نقاط و(الشكل 3A ). وقد تم اختيار هذه المسافة على أساس علم البصريات، والحد من حيود الضوء، والحجم المادي ذي الصلة من البضائع والسيارات مفارز. تم الحصول على مبلغ قريب من KLC1 وDYNC1H1 المرتبطة الحويصلات YFP بي ار بي-C من سعة جاوس، التي تمثل شدة كل نقاط و(الشكل 3B). هذه البيانات يمكن تحليلها على النحو المرغوب فيه. على سبيل المثال، شدة المحركات colocalizing مع YFP بي ار بي-C نقاط وبين السيطرة (البرية من نوع - WT) الخلايا العصبية وتلك التي تفتقر إلى أخرى كينيسين-1 مفارز (KIF5C - / - الخلايا العصبية في الشكل 3A، KIF5C هو عضو في كينيسين-1 الأسرة)، يمكن مقارنة لتحديد ما إذا كان غياب KIF5C يعطل جمعية KLC1 و / أو DYNC1H1 إلى الحويصلات YFP بي ار بي-C (كانت KLC1 وDYNC1H1 شدة دون تغيير في تجاربنا 16). وعلاوة على ذلك، KLC1 وDYNC1H1 شدة يمكن رسم للتدقيق الارتباطات المحتملة بين مبالغ السيارات النسبية وتوجه حركة (الشكل 3B). على سبيل المثال، الحويصلات YFP-بي ار بي سي أن تتحرك و / أو ثابتة ترتبط مع كل من KLC1 و / أو DYNC1H1 (الشكل 3B).
الشكل 1. الخلايا العصبية الحصين مثقف في أجهزة ميكروفلويديك. (أ) صورة لجهاز ميكروفلويديك. وتصور الخطوط العريضة الخزانات بواسطة الأصباغ الحمراء والزرقاء. يشير ترقيم لعدد من الخزانات المستخدمة في جميع أنحاء ميكروفلويديك البروتوكول. (ب) رسم تخطيطي للجهاز ميكروفلويديك. الأرقام تتوافق مع الخزانات طن التي تضاف وسائل الإعلام والخلايا العصبية. وتظهر الخلايا العصبية Transfected باللون الأخضر. مستطيل أحمر والسهام الحمراء المنقطة تشير إلى المنطقة أوصى للتصوير مضان حية وثابتة. (C) صورة لاثنين من محاور transfected مع YFP بي ار بي-C المتنامية من خلال متناهية واحدة (واحدة متناهية وحافة الجهاز حددها خطوط بيضاء منقطة) . يمكن أن تتحرك بشكل فردي الحويصلات YFP بي ار بي-C يكون مميز كما إشراقا نقاط و. شريط النطاق هو 10 ميكرون. ويتم تكييف شخصية من:.. Encalada 16 آخرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. "رسم الخرائط للشحن" لربط YFP بي ار بي-C النقل حويصلة معكميات النسبية من كينيسين وداينين المحركات. الصور مضان حقل واسع من الحركة الحية والشحنات الثابتة نقلوا على مجهر مقلوب مجهزة بمحرك مرحلة وكاميرا CCD وهدف النفط 100X / 1.4 NA. (A) مخطاط التموج من YFP -PrP C حركة الحويصلة من المحاور هو مبين في الشكل 1C. وسجلت حركة حية لفترة تتراوح الكلي 30-60 ثانية عند 100 مللي التعرض (10 هرتز). تم إصلاح الخلايا بعد تصوير حركة البضائع لمدة 15 ثانية على الأقل. خط منقط يشير وقت التثبيت أثناء التصوير الحي. يظهر مربع أحمر منطقة الحويصلات أبرزت في (B، C) والموسع في (D). النصال تشير إلى ثلاثة الحويصلات هو مبين في (D) الموافق ثابتة (الأزرق)، إلى الوراء (الحمراء)، وتقدمي (الأخضر) مسارات. ( ب) صورة ثابتة الحويصلات YFP بي ار بي-C الانحياز إلى مخطاط التموج المقابلة. الأرقام تشير إلى والحويصلات dividual YFP بي ار بي-C التي تم تعيينها إلى نقاط ويمكن التعرف على مخطاط التموج. الحويصلات تقدمي خضراء، حمراء إلى الوراء، وتلك التي هي ثابتة الزرقاء. (C) ثابت صور KLC1 وDYNC1H1 نقاط وإذا المقابلة لنفس المنطقة هو مبين في (B). شريط النطاق (AC) هو 10 ميكرون. (D) توسيع IF الثابتة إشارات من كل من القنوات الثلاث مع 2D مهام وظيفة جاوس. وتمثل النقاط الزرقاء المحلية بكسل كثافة ماكسيما، وتمثل النقاط الحمراء يناسب جاوس، والنقاط الوردية هي تداخل بين الاثنين. رؤوس سهام تشير إلى أمثلة من الحويصلات YFP بي ار بي-C هو مبين في (A)، وcolocalization الفارق مع البروتينات السيارات KLC1 وDYNC1H1. شريط النطاق هو 2 ميكرون. ويتم تكييف شخصية من:.. Encalada 16 آخرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من ال هو الرقم.
الشكل 3. تحليل كمي "خرائط البضائع" من الحويصلات YFP بي ار بي-C. (A) الكمي لcolocalization بين الحويصلات YFP بي ار بي-C، KLC1 وDYNC1H1 في WT والخلايا العصبية KIF5C خروج المغلوب (KIF5C - / -). بلغ إجمالي عدد من نقاط وتحليلها WT N = 887 N وKIF5C - / - 1629 = 16 أرقام داخل الحانات وتمثل عدد الحويصلات لكل فئة. المعروضة هي متوسطات ± SEM. تم استخدام غير حدودي التقليب ر الاختبار للمقارنة بين الأنماط الجينية (29). (ب) الارتباط تكوين المحرك النسبي وتوجه الحركة في الخلايا العصبية WT البيانات التي تم تحليلها في (A). ويتم تكييف شخصية من: Encalada وآخرون 16..jove.com / ملفات / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغا "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا تمكن ارتباط الاتجاهية حركة الجزيئات الفردية الفلورسنت البضائع تتحرك على أساس أنيبيب مع نوع النسبي وكمية من البروتينات في الخلايا العصبية الحركية المرتبطة الحية. سابقا، كان يعاير إجمالي تكوين المحرك البضائع حويصلي محور عصبي على السكان غير متجانسة من الحويصلات تنقيتها كيميائيا والعضيات 9،15. ومع ذلك، فقد تم تركيب المحركات التي تميز لنوع واحد من البضائع داخل الخلايا صعبة بسبب صعوبة في تنقية السكان حويصلة متجانس. وعلاوة على ذلك، في حين قدمت قياسات السيارات المماطلة القوات تقديرات أعداد السيارات العاملة في أجنة ذبابة الفاكهة، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت الحركة الاتجاهية ربطها المحركات يجري بثبات متجهة إلى البضائع أو للجمعية السريع / التفكك من المحركات النشطة من / 12 البضائع. وبالتالي فإن بروتوكول "البضائع رسم الخرائط" descriوقد وضعت السرير هنا لمواصلة التحقيق في العلاقة بين نوع وعدد نسبي المحركات المرتبطة تتحرك بشكل فردي البضائع في الخلايا العصبية الحية.
للحصول على البيانات بنجاح من "خرائط البضائع" من المهم جدا لل1) إجراء التصوير للحركة البضائع والاتحادات الدولية ثابتة بدرجة وضوح عالية الزماني والمكاني، 2) ضمان تثبيت فوري من العينة أثناء التصوير، 3) محاذاة المنطقة من الفائدة في الصور الحية والثابتة والخريطة البضائع والمحركات الثابتة لkymographs حركة لنفس الصور، و4) تحديد بالضبط تنسق XY البضائع والمحركات نقاط والفلورسنت من أجل تحديد مقدار colocalization بين البضائع والسيارات البروتينات.
في حين أن هذا البروتوكول هو مناسبة فريدة لتحليل خصائص النقل في تنظيم موحد محاور الخلايا العصبية المزروعة في أجهزة ميكروفلويديك، فإنه يمكن تكييفها لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. على سبيل المثال، وهذا تطبيق مسيمكن استخدامها لوصف نشوئها جمعية الحويصلات مع محولات لهم المشاركة في إندو / إيماس (على سبيل المثال، المقايسات الاتجار في الخلايا الليفية)، أو نمو الأنابيب الدقيقة المسمى مع البروتينات أنيبيب + نصيحة ملزمة. لهذه، يمكن أن تكون بديلا الأجهزة ميكروفلويديك من قبل coverslips الشبكية لتسهيل توطين خلايا تصوير اللازمة لايف المتلازم ودراسات التصوير الثابت. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لتوصيف الأحداث الخلوية التي يتغير المعلمة في الوقت اعتمادا على البيئة الخلوية محددة. على سبيل المثال، يمكن أن تكون مرتبطة بالافراج عن البروتين الفيروسي fluorescently المسمى من الهياكل endosomal الفردية في السيتوبلازم مع التعبير و / أو جمعية من البروتينات endosomal.
واحد الحد الممكن من هذا البروتوكول هو أن رسم الخرائط من الشحنات عالية الكثافة قد يكون صعبا. ومع ذلك، فإن إسناد مهام جاوس تلتف هذه المسألة إلى حد كبير من خلال السماح للتمييز المواقف بين نقاط والفلورسنت على مستوى الفرعي بكسل. وعلاوة على ذلك، تعيين المحركات لشحنات محور عصبي هو منخفضة الإنتاجية: في الوقت الحالي، يمكن أن يتم رسم الخرائط لمدة 2 محاور لكل جهاز ميكروفلويديك، نظرا لانخفاض معدل ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية ومجال محدود نظر عند استخدام التكبير العالية العالية اللازمة ل قرار التصوير مع الكاميرا. ويمكن أن تشمل التطورات المستقبلية لهذه الطريقة استخدام نظم lentiviral لتنبيغ الخلايا العصبية مع كفاءة أعلى وعزل الخلايا العصبية من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الموسومة fluorescently أو وضع العلامات من العضيات مع الأصباغ الفلورية صغيرة مثل Lysotracker أو Mitotracker، والتي سوف تزيد من عدد من المحاور التي تحمل علامات الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، فإن حجم المساحة المسجلة محدود من قبل التكبير، وحجم البكسل وحجم المصفوفة بكسل الكاميرا المستخدمة في التصوير. والتطورات الجارية في مجال تقنيات التصوير تسمح لمساحة أكبرS ليتم تصويرها في المستقبل، وبالتالي زيادة كمية البيانات التي تم الحصول عليها في حالة تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A.
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F.
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W.
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G.
- Collins, T. J.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
