Abstract
분자 모터 신경 세포 내 소낭화물을 수송하는 그들의 활동을 조정하는 메커니즘을 이해하는 것은 하나의 소포 수준에서 모터 /화물 협회의 정량 분석이 필요합니다. 이 프로토콜의 목적은 동일한화물과 관련된 모터의 조성 및 상 대량으로 ( "지도") 상관 라이브화물의 이동 위치와 방향성을 정량적 형광 현미경을 사용하는 것이다. "화물 매핑은"생방송 운동의 기록에서 화학적 고정 다음 미세 유체 장치에서 배양 축삭 이동 형광 표지 된화물의 이미징, 및 모터에 대한 항체와 동일한 축삭 지역의 후속 면역 (IF) 염색으로 구성되어 있습니다. 화물 및 연관된 모터 사이 colocalization을 서브 - 픽셀 위치를 할당함으로써 평가된다 회절에 리 피팅 가우스 함수에 의해, 모터 및화물 채널 좌표개별 형광 포인트 소스를 나타내는 mited 포인트 확산 기능. 고정화물 및 모터 이미지는 이후 자신의 추적 궤도로 "맵",화물 이동의 플롯에 중첩된다. 데이터가 살아있는 세포에 기공을화물의 수송을 모두 기록하고이 동일한 소포에 연결된 모터를 결정하는 경우,이 프로토콜의 강도는 라이브의 조합입니다. 이 기술은 이러한 방법은 단일 이동화물에 조성물을 공개하지 않는 한, 정제 된 벌크 소포 이종 집단의 평균 모터 조성을 결정하는 생화학 적 방법을 사용하여 이전의 어려움을 극복한다. 더욱이,이 프로토콜은 단백질 조성물의 개별 세포 구조의 이동을 상관시키는 다른 세포 유형에서 다른 전송 및 / 또는 매매 경로의 분석을 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜의 한계로 인해 배양의 낮은 형질 전환 효율에 상대적으로 낮은 처리량이다차 뉴런 고해상도 영상화 가능한 뷰 제한된 필드. 미래의 애플리케이션은 형광 표지 된화물을 발현하는 신경 세포의 수를 증가시키는 방법을들 수있다.
Introduction
세포 내 수송은 다양한 세포 도메인 1 단백질, 세포막, 세포 기관, 및 신호 분자의 전달을위한 모든 종류의 세포에 중요하다. 뉴런은 매우 비판적으로 여러 축삭 마이크로 도메인에 자신의 장거리 전송에 필수적인화물의 세포 내 수송에 의존 한, 편광 돌기 세포를 전문으로하고 있습니다. 두 개의 큰 분자 모터 단백질의 가족 - -이 교통 키네신과 dyneins에 의해 매개되는화물에 결합하는 각각 선행 성과 역행하는 방향으로 편광 미세 소관을 따라 추적 할 수 있습니다. 역행 이동은 주로 네인에 의해 매개되는 동안, 선행 성 방향의 움직임은 키네신 모터 크고 다양한 기능적 가족에 의해 촉진된다. 결과적으로, 축삭화물의 선행 성 전송은 키네신 상과 1-5의 다양한 가족에 의해 중재 될 수있다. 일부화물은 어느 방향으로, m에서 지속적으로 이동하지만OST화물은 양방향으로 이동하고 최종 목적지 1,5-13에가는 길에 자주 역. 또한, 도시 한 것,화물에 동시에 방향성 연관 대향화물의 이동이 규제 된 반대 극성의 모터 5-7에 의해 조정되는 방법에 대한 의문을 제기 모터. 함께, 축삭화물의 수송은 모터와 차례로 다양한 어댑터와 규제 바인딩 파트너 (14)에 의존하는 특정 생화학 적 활동의 구성에 의해 조절되는 공동의 프로세스입니다.
충실 특정화물 축삭 수송 메커니즘을 설명하기 위해, 그 전송의 기본 규정을 밝히기 위해서, 그들의 라이브 운송 중에 개별화물과 연관된 모터 단백질과 그 규제 결합 파트너의 조성을 결정하기 위해 가장 중요하다. 다른 방법은, 예를 생화학 적 접근법에 대해, 평균 경구의 추정치를 제공또는 정제 이기종 소포 인구에 조성하지만, 이러한 추정은 유형 또는 단일 이동 소포에 관련된 모터의 금액을 공개하지 않습니다. 또한, 시험관 내에서 미리 조립 된 미세 소관을 따라 소포 수송 재구성 단일 소포 레벨 (15) 상 모터의 한 형식의 양을 측정 가능. 그러나, 이들 실험은 직접 그 소포 수송 특성을 갖는 모터의 양의 상관 관계, 및 세포 조절 인자의 부재하에 수송을 측정하지 않았다.
내생 적 측정 (IF) 데이터가 모터 단백질을 발현 면역 개별 이동 소포의 모터 구성 (유형과 모터의 상대적인 양을) 결정하고, 신경 세포의 동일한 소포의 실시간 전송에 이러한 매개 변수의 상관 관계를 여기에 제시되는 프로토콜, 16. 이 방법은 IF 투 라이브화물 이동 데이터의 정확한 매핑을 수반한다. 이 기르고하여 수행됩니다마이크로 유체 장치에서 g 해마 마우스 뉴런 프로토콜 17-19 설립 다음. 이 장치는 고정 및 라이브 광학 현미경의 양식에 축삭과 하나의 이동화물의 식별 및 상관 관계 ( "매핑") (그림 1)에 대한 수 있습니다. 배양 된 신경 세포는 그 전송 kymographs 플롯되는 상세한 움직임 정보를 얻기 위해 높은 공간 및 시간 해상도에 결상된다 형광 표지화물 단백질로 형질 감염된다. 이미징 과정에서 뉴런은 파라 포름 알데히드로 고정되고,이어서 모터 내인성 단백질에 대한 항체로 염색. 고정화물 및 모터 이미지는 운동이 16 탄도 라이브화물로 "지도"(colocalize) 라이브 이동 kymographs에 중첩된다. 모터 단백질의 연관으로화물의 실시간 움직임을 연관하기 colocalization을 "은 모라는 주문품 MATLAB 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석된다토르 colocalization을 "16, 20. 형광 표지 된화물 및 모터 부분이 부분적으로 겹칠 수 회절 제한 반점 기능을 생성합니다. 눈물 점 겹치는 위치를 해결하기 위해, 소프트웨어는 제 자동으로 정확한 XY 서브 픽셀 위치를 결정하기 위해, 각각의 형광 눈물 점을 나타내는 각 점 분포 함수에 가우스 함수 맞는 좌표와 세기는 21-23 진폭이. 모터 및화물의 위치는 이어서 colocalization을 16, 20를 결정하는 서로 비교했다. 따라서,이 방법은 다른 방법들보다 정확하게는 24에 비해 형광 눈물 점 사이 colocalization을 할당한다.
이 방법의 장점은 실시간 이동 궤적 (예를 들면, 방향이되는들은 정착시 이동 하였다) 녹화왔다있는 고정 셀의 개별화물 모터 colocalization을 평가하는 기능이다orded. 이 방법 키네신과 dyneins은 (PRP C의 -cellular) 양방향으로 이동하거나 축색 돌기 (16)에 고정되어 neuronally 풍부한화물을 정상 프리온 단백질을 운반 소포에 동시에 연결할 발견되었다. 이 분석은화물 연관된하면서 선행 성 (키네신)와 역행 (네인) 모터가 어느 한 방향으로 소포를 이동 또는 고정 유지하기 위해 그들의 활동을 조정하는 PRP C 소포 운동 규제 작업 모델의 수립을 허용 . 이 방법의 또 다른 장점은 관심의 다른 단백질 (들)과, 거의 모든 세포 유형에서 이동 많은 형광 표지 된화물의 colocalization을 / 협회의 특성에 대한 잠재적 인 광범위한 적용이다. 따라서, 라이브 / 정 상관 잠재적 과도화물 단백질 상호 작용의 검출을 허용 할 수있는 입자를 이동 표지 많은 개별 형광는 원하는 페이지를 통해 분석 될 수있다시간의 eriod. 폭 넓은 적용이 방법은 처리 할 수 질문의 유형을 감안할 때,이 프로토콜은 신경 세포에서 다른 세포 유형에서 그 공부 인신 매매 및 수송 등 세포 생물학의 다양한 관객들에게 관심이 될 것입니다.
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Protocol
모든 실험은 승인 된 프로토콜을 다음과 연구 동물의 인도적인 관리를위한 제도적 지침에 따라 수행되었다. 신생아 마우스는 잘린 안락사되었다.
세포 배양을위한 미세 유체 장치 1. 준비
- 해리스와 동료 17 ~ 19에 의해 설명 된 해마 신경 세포의 성장을 위해 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로 유체 장치를 준비합니다. 이하화물 매핑 프로토콜에 적응 된 몇 가지 변형이있다.
참고 : 미세 유체 디바이스는 (자료 목록) 상업적으로 사용할 수 있으며, 제조 설비에 따라서 액세스가 필요하지 않습니다. - 그들에게 100 % 에탄올로 세 세척과 물 세 세척 한 다음, 아세톤으로 3 회를 세척하여 제 1.5 커버 유리 (24 × 40 mm)를 준비합니다. 사용할 때까지 4 ° C에서 물에 보관 된 커버. 이 치료 된 커버가 CEL의 도금 방해 할 수 파편 깨끗한 지 보장LS, 오염, 생존.
참고 : 아세톤과 에탄올은 흡입, 섭취의, 가연성 및 눈 접촉의 (자극물)의 피부 접촉 (자극물), 다음 경우 유해 있습니다. 규정에 따라 폐기 할 것. - 때 사용하는 미세 유체 디바이스 당 60mm 세포 배양 접시에 한 커버 유리를 배치하고, 건조 공기 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내부에 45 분 동안 발견 할 준비가.
- 장치가 마스터에서 잘라 펀치가 저수지 만들기 위해 절단 한 후 (그림 1A를, B), 살균 45 분 동안 UV 램프가 장착 된 생물 안전 캐비닛 내부의 미세 유체 채널 사이드 업으로 배치합니다.
참고 : 이상 2 시간 동안 UV 처리에서 장치를 그대로두면 PDMS의 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. - 미세 유체 채널이 아래를 향하도록 60mm 플라스틱 세포 배양 접시에 각각 내측 커버 글래스 상에 하나의 장치를 배치하여 디바이스를 조립한다. 상단 O에 약간 힘을 주어장치 F를 커버 유리로 장치의 비 영구적 인 밀봉을 제공하기 위해 (마이크로 닿지 않도록). 뚜껑이 각 60mm 세포 배양 접시를 커버.
- 마이크로 피펫을 사용하여, 물이 흐를 수 있도록, 상위 두 마이크로 유체 저장조 (도 1A 1, 2)을 세포 배양 등급의 물을 첨가하여 수화 장치. 마이크로 피펫으로 물을 제거하고 미세 유체 저수지 1 (200 μL) 및 2 (100 μL)에 1 ㎎ / ㎖ 폴리 -L- 라이신을 추가합니다. 볼륨 차동 마이크로 채널 (도 1A, B)를 통과하는 폴리 L 리신을 허용한다.
- 60mm 세포 배양 접시 내부 장치가 37 ° C의 배양기 안에 위에 넘어지지 않도록하기 위해, 150mm 플라스틱 세포 배양 접시에 디바이스를 포함하는 세 가지 60mm 세포 배양 접시를 배치하고 뚜껑 덮으. 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 O / N을 품어. 일반적으로 채널의 90 % 이상은 디바이스 당 가능하고 수행기포 또는 물리적 방해물을 포함하지.
- 다음 날, 물에 폴리 -L- 라이신를 교체하고 적어도 1 시간 동안 인큐베이터에서 장치를 둡니다. 이 세탁을 세 번 반복합니다. 물을 제거하고 각 장치 (2 %에게 B-27 보충 및 500 μM 루타를 포함)로 Neurobasal-A 성장 매체를 추가합니다. 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 O / N을 남겨주세요.
- 후술하는 바와 같이, 다음 날, 해마 세포를 플레이트.
미세 유체 장치에서 마우스 해마 차 뉴런 2. 도금
주 : 신생아 쥐에서 배양 된 해마 신경 세포의 준비는 이전에 조브 (25)에 발표되었다. 다음은 마이크로 유체 장치에서 판 마우스 해마 신경 세포에 적응 된 일부 수정이 있고, 그 형질에 대한 최적이었다.
- 마우스 뇌 절개 전에 미리 따뜻한 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 함유하는 10 % 태아 소 혈청(FBS; 항생제없이), 혼합물 A (125 mg을 DL 시스테인 125 mg을 소 혈청 알부민 (BSA)와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 500 ㎖ 중의 D 글루코오스 3.125 g, 필터 0.22 μm의 필터를 통해 살균) 37 ° C의 물을 욕조에 : 그리고 내가 솔루션 ((50)의 DNase I의 MG 100 mL로 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 필터에 1.2 M 황산 용액 0.5 ml의 0.22 μm의 필터를 통해 살균 내가 DNase의를) 데 옥시 리보 뉴 클레아.
- 5 % CO 2로 37 ° C의 배양기 안에 사전 따뜻한로 Neurobasal-A 성장 배지는 pH를 평형화.
- 설립 프로토콜 (26)에 따라 1-3 일 된 신생아 쥐에서 해마를 해부하다. 얼음 (10 mM의 HEPES pH 7.4의 50 mM의 포도당, 100 U / ㎖ 페니실린 및 / ml의 스트렙토 마이신 100 μg의를 포함 HBSS) 10 ml의 해부 버퍼를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 해마를 유지합니다. 15 ML 원뿔 튜브 당 4 개의 해마에 넣었습니다.
- 나머지 프로토콜을 수행하는 것은 멸균 상태에있는바이오 안전성 캐비닛 내부의.
- 혼합물 A, 소용돌이 5ml에 파파인 45 단위를 희석하고, 파파인 분말이 용해 될 때까지 37 ° C에서 5 분 동안 배양한다. DNase의 I 솔루션 1 ML을 추가합니다. 0.22 μm의 주사기 필터 부를 통해 믹스 필터.
- 15 ML 원뿔 튜브를 포함하는 해마에서 조심스럽게 기음 HBSS '. 추가 10 ml의 감기 (4 ° C) HBSS 해마에 그들을 튜브의 바닥에 정착하자. 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브에서 HBSS를 대기음.
- 나는 최대 4 개의 해마에 혼합하고 37 ℃에서 20 ~ 30 분 동안 품어 1 ml의 파파인 / DNase를 추가합니다. 원뿔 튜브를 혼합하여 해마 목욕을 할 때마다 5 분을 기울입니다. 또한 부드러운 흔들림 (~ 100 RPM)와 37 ° C의 물을 욕조 통에서 해마를 배치합니다.
- 기음 파파인 / I 믹스와 10 % FBS를 포함하는 미리 예열 DMEM (37 ° C)와 해마 두 번 씻어 DNase의.
- 두 번째 세척 후에,이 해마, 10 % FBS를 함유하는 미리 가온 된 DMEM ml의 피펫에 의해 수동으로 분쇄시켜, 해마를 추가최대 및 신경 세포를 떼어 놓다 1 ml를 피펫 팁을 사용하여 10 ~ 12 배 ~ 다운.
- 이 비 해리 신경 세포가 원뿔 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록으로 씹다가 ~ 1 분 동안 정착하자. 튜브의 바닥에 정착 한 더 큰 조직의 전송을 피하는 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 해리 신경 세포를 포함하는 상층 액을 전송합니다.
- 2 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거. 부드럽게 피펫 팅하여 80 μL로 Neurobasal-A 성장 배지에서 세포를 재현 탁.
- 미세 유체 저수지 1, 1 '에서 매체를 제거합니다. 미세 유체 저수지 1 세포의 20 μL (~ 275,000)를 적용하고,이를 통해 흐를 수 있도록. 20 분 동안 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 장치를 놓습니다.
- 세포는 커버 유리에 부착했는지 확인하기 위해 현미경으로 봐. 모든 저수지를 맨 위로로 Neurobasal-A 성장 매체를 추가합니다. 5 % CO와 37 ° C 배양기에 세포와 장치를 반환
- 장치마다 ~ (루타 제외)로 Neurobasal-A 포함 2 % B-27 보충 2-3 일 총수입 저수지 피하기 위해 증발을 확인합니다. 뉴런은 도금 후 ~ 미세 유체 채널을 통해 2~3일을 자신의 축삭을 확장하기 시작. 주제 뉴런은 도금 후 일반적으로 7-10일 형질 전환합니다.
미세 유동 장치에 재배 해마 뉴런 3. 형질
- 장치 당 30 μL로 Neurobasal-A 1.2 μL의 리포 펙 타민 2000의 혼합, 30 μL로 Neurobasal-A 0.5 μg의 형광화물 융합 플라스미드의 혼합을 준비하고 RT에서 5 분을 품어. DNA 믹스에 리포 펙 타민 믹스를 추가하고 실온에서 20 분 동안 품어. DNA에 4 % B-27 보충을 포함로 Neurobasal-A의 60 μl를 추가 / 리포 펙 타민은 혼합 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다.
- '미세 유체 저수지 2, 2에서 모든 미디어를 제거하고 조심스럽게 매체 INT 위에 흘리없이 2 % B-27 보충을 포함로 Neurobasal-A와 우물을 채우기다른 구획 오.
- 미세 유체 저수지 1, 1 '에서 미디어를 꺼내십시오. DNA의 120 μl를 추가 / 리포 펙 타민은 미세 유체 저수지 1로 혼합하고 흐름을 보자. 3 ~ 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 장치를 돌려줍니다.
- '미세 유체 저수지 1 일에서 모든 미디어를 제거하고 24 시간 동안로 Neurobasal-A 포함 2 % B-27 보충제로 교체 (또는 전까지 이미지). 일반적으로, 마이크로 채널을 통해 성장 5-7 축삭은 약 해마 배양 세포 (26)에 대한 게시 효율성과 일치 1~3% 형질 전환 효율을 대표하는 조건에서 형질 전환된다.
4. "화물 매핑"분석
- 화물 운동의 라이브 영상
- 37 ° C 배양기 및 CO 2 제어 챔버가 장착 된 거꾸로 표면 형광 광학 현미경의 이미징을 수행합니다.
- MICR에서 재배 해마 신경 세포와 커버 슬립을 탑재현미경 스테이지로 ofluidic 장치. 신경 세포 사멸을 방지하기 위해 더 이상보다 1 시간 현미경의 샘플을 유지하기 위해 신속하게 작동한다.
- 고해상도 대물 (100X)를 사용하여 미세 유체 채널을 통해 챔버의 연장 형질 축삭가 발견 된 채널의 수를 기록 형질 세포의 축삭을 발견한다. 손 탈리 계수기를 사용하여 채널의 수를 계산.
- 라이브 운동 이후 colocalization을 분석 최적의 녹화를 들어, 대부분의 소포의 영상이 초점을 수행 할 수 있도록 채널을 통해 비교적 평탄한 성장 축삭을 선택합니다.
- 1 ml의 플라스틱 전송 피펫과 저수지 2와 2 '에서 매체의 대부분을 제거합니다. kymographs에 이동 궤적과 고정 된 이미지의 다음과 같은 작업을 용이하게하기 위해, 영상 (그림 1B, C) 중 시야와 마이크로의 오른쪽 가장자리를 맞 춥니 다.
- 손만을 용이하게하기 위해이미징 동안 샘플의 G는 두 사람과 라이브 영상을 수행합니다. 라이브 화상이 하나의 사용자에 의해 수행되는 경우 또는, 드리프트 보정 구비 현미경 시스템을 사용한다.
- (그림 2 및 재료 목록의 전설에 지정된 YFP-PRP C를 이미징 현미경 사양 및 설정) 시간 경과 분석되는화물의 수송 역학에 특정 사양의 영상 라이브화물 이동을 시작합니다.
- 충분한 라이브 이동 데이터를 수집 한 후, 한 사람이 PBS에서 미리 예열 4 % 파라 포름 알데히드는 세포를 해결하기 위해 0.04 g / ㎖ 자당을 포함하여 '저수지 2와 2를 채울 수 있습니다. 이것은 라이브 영상의 초점을 방해하므로, 미세 유체 소자를 만지지 마십시오. 고정액을 첨가하면서 상대방이 초점을 조정하게한다. 운동의 즉시 정지가 관찰 될 때 고정이 성공한 것입니다. 이후 1, 1 '리저버 정착액을 추가합니다.
참고 : 임시 photoblea화물 형광 칭 또한 관찰 될 수 있지만, 모터 단백질 IF 염색 (다음 단계) 완료 후 형광 지속.
참고 : 파라 포름 알데히드는 피부 접촉, 흡입시 유해, 삼키면. 눈, 호흡계 및 피부를 자극 함. 규정에 따라 폐기 할 것.
- IF colocalization을 분석 모터 단백질의 염색
참고 : 개별 이동화물에 관련된 모터 단백질의 상대적 수준 (항체 염색으로 결정)의 정량, 확인하고 항체 - 항원 결합이 포화되어 있는지 확인하기 위해 항체를 적정한다. 이것은 관심있는 단백질 중 뜨렸다 아웃 된 뉴런 또는 노크 - 다운을 사용하여 항체의 특이성을 결정하는 단계에 의해 수행되고, 수행함으로써 IF 항체 농도의 증가와 함께 분석. 음성 대조군의 경우, 신경 세포 1 차 항체가없는 상태에서 이차 항체로 염색된다. 더 자세한항체 검증의 설명은 Encalada 등. (16), 및 Szpankowski 등. (20)에서 찾을 수 있습니다.- 현미경 단계에서 미세 유체 장치에서 재배 해마 신경 세포와 커버 슬립을 제거합니다. 마이크로 라이브와 고정 이미지를 중첩하기 위해 그대로 유지해야하므로, 커버 슬립에서 미세 유체 장치를 분리하지 마십시오. 습도 챔버에서 다음 단계를 수행한다.
- 마이크로 채널 내로 용액의 흐름을 보장하기 위해, 적어도 30 μL의 '2, 2'저수지 1, 1 사이의 버퍼 용적 차를 유지한다. 이후의 모든 단계에서. 예를 들어, '미세 유체 저장조 (1) (1), 70 μl의 매체 볼륨'미세 유체 저장조 (2), (2)에 100 μL 매체 볼륨을 추가한다.
- 미세 유체 장치의 챔버에서 고정액을 제거하고 PBS는 세척 사이에 10 분을 기다리고 세포를 세 번 씻는다.
- 0.1 % 트리톤 X-100를 거치도록 희석되지 않았어요 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면모든 저수지에 5 분 동안 PBS에서 테드.
- 모든 저수지에서 솔루션을 제거하고 PBS로 세척. 세탁을 세척 사이에 10 분을 기다리는 세 번 반복합니다.
- 모든 저수지에서 솔루션을 제거하고 PBS 10 % 정상 당나귀 혈청 3 % 프로테아제 무료 및 면역 글로불린 G (IgG를) - 무료 BSA를 포함하는 버퍼를 차단 적용하고 실온에서 적어도 30 분 동안 품어.
- 5 분 침전물을 제거하기 위해 20,000 XG에서 차 항체 원액을 스핀. 버퍼를 차단에 적절한 농도로 항체를 희석. 항체 용액과 미세 유체 장치에서 차단 버퍼를 교체합니다. 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 샘플을 품어.
- 모든 저수지에서 솔루션을 제거하고 세척 사이에 10 분을 기다리고, PBS로 3 회 씻는다.
- 5 분 침전물을 제거하기 위해 20,000 XG에서 이차 항체 원액을 스핀. 버퍼를 차단에 적절한 농도로 항체를 희석. 차 항체 용액을 PBS를 교체합니다. 품다실온에서 1 시간 동안 샘플.
- 모든 저수지에서 솔루션을 제거하고 세척 사이에 10 분을 기다리고, PBS로 3 회 씻는다.
- 직접 저수지를 연결하는 채널의 구멍에 장착 매체를 피펫 팅에 의해 10 ~ 20 μL 설치 매체 ~와 PBS를 교체합니다. 실온에서 1 시간 - ~ 20 분 동안 미디어 건조를 장착 할 수 있습니다.
- 염색 이틀 (최대 일주) 내에서 photobleaching에 방지하기 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 저장 장치, 이미지 축삭.
- 염색 종료 후, 현미경 스테이지 상에 미세 유체 소자에서 배양 된 해마 뉴런과 커버 슬립을 장착. 단계 4.1.1-4.1.7에 이미징되는 형질 전환 된 축삭의 영역을 찾습니다.
- 고해상도 목적 (예를 들어, 높은 개구 수 대물 오일 또는 물)를 사용하여,화물, 모터 (1), 모터 (2) : 세 개의 채널 각각에 대해 Z 스택 이미지 (300 nm의 단계)를 획득.
참고 : 축색 돌기는 종종 완전 평면 성장하지 않는 한 Z-스택의 획득이 중요하다모든 형광 눈물 점 마이크로에 따라서 동일하지 초점면에 있습니다.
- 화물 매핑
- 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여화물 이동 kymograph 생성. Rietdorf과 사이 츠 (BillSeitz) (EMBL)에 의해 개발 된 ImageJ에 플러그인이 kymographs를 생성하는 것이 좋습니다 (다운로드 참조 재료 목록).
참고 : ImageJ에 건강 (27, 28)의 국립 연구소에서 개발 된 공개, 자바 기반의 이미지 처리 프로그램 (다운로드 자료 목록 참조). - (재료, 고정 지점 (도 2A, B)에서 kymograph의 궤적의 위치에 그들을 중첩 시판 그래프 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수동으로 (단계 4.2.14에서 생성) 형광화물의 고정 된 이미지를 정렬 목록). 수동 제 kymograph 상에 고정화물 화상을 중첩 수동에 특정 궤적에 대응화물 눈물 점을 선택하여 정렬kymograph. 가장 좋은 정렬 결과를 매핑 된화물에 가장 초점이 Z 슬라이스를 사용합니다. 몇몇 Z 슬라이스가 사용될 수있다.
- XY 좌표 및 설정 알고리즘을 이용하여 각각의 형광 눈물 점에 대한 강도 진폭이 나타내는 점 분포 함수에 2 차원 가우시안 맞게 결정하고; 각각의 Z-스택 화상 (단계 4.2.14에서 생성화물, 모터 (1) 및 모터 (2))를 들면 세 개의 채널 16,20,21 (그림 2D)의 각각의 각 포인트에 원.
참고 : Jaqaman, Danuser와 동료 21 ~ 23에 의해 개발 된 가우시안 피팅 알고리즘을 통합 XY 좌표, 16, 20를 개발 한 "자동차 colocalization을"라는 사용자 지정 내장 된 MATLAB 소프트웨어 패키지를 구하십시오. 그것의 사용에 대한 소프트웨어 패키지 및 자세한 설명은 요청에 따라 얻을 수 있습니다. - kymograph에 이동 또는 정지 궤도에 매핑 된 개별화물 눈물 점의 각각에 대해, T 선택그는 "자동차 colocalization을"프로그램의 결과에서 좌표와 강도의 진폭 (이화물 개별적 그림 (b)에 표시되어 있습니다)를 XY. 다른 초점면에서 찾을 수있는 더 많은화물을 매핑하는 단계 4.2.14에서 획득 한 여러 Z 스택 이미지)를 사용합니다.
- 개별 XY가 대응 Z 슬라이스 (도 2D)에 모터 채널들 각각에 대해 얻어진 것과 매핑화물 좌표 비교. 결정하고화물의 300 나노 미터 반경 내에있는 XY 모터 좌표를 선택합니다. 화물 및 같은 초점면 내에 신호가 모터를 들어, 300 나노 미터 반경 내에있는 눈물 점을 확인하기 위해 "모터 colocalization을"소프트웨어 패키지를 사용합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여화물 이동 kymograph 생성. Rietdorf과 사이 츠 (BillSeitz) (EMBL)에 의해 개발 된 ImageJ에 플러그인이 kymographs를 생성하는 것이 좋습니다 (다운로드 참조 재료 목록).
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Representative Results
도 1은 해마 신경 세포를 성장하는 데 미세 유동 장치의 개요를 도시한다 (도 1A, B). 뉴런의 채널 길이가 축삭 구획에 줄곧 건너로부터 수지상 돌기를 방지하면서 미세의 크기로 구획 축삭 세포 기관 (소마)의 확산을 방지 저장조 (1)에 도금된다. 문화 ~ 2~3일 후, 신경 세포는 축삭 구획 (그림 1B, C)에 마이크로 채널을 통해 자신의 축삭을 확장하기 시작. 황색 형광 단백질 (YFP PRP-C)로 표지 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질 감염된 축삭 형광 현미경 (도 1C)에 의해 식별 될 수있다. 플라스미드 형질 전환을 이용하여 형광 표지 단백질의 발현으로 인해 변형 된 단백질의 입체로 실험 유물을 소개 할 수 과발현으로 적절한 세포 내 현지화 및 기능에 대해 확인해야합니다. 따라서, colocalizat이온 실험은 생화학 공침 연구와뿐만 아니라 내생 적으로 발현 된 단백질에 대한 IF 염색으로 모두 칭찬되어야한다. 여기서 사용 YFP PRP-C의 동작은 이전에 16 개의 시험 하였다. 일시적으로 형질 전환 된 신경 모세포종 세포 (N2A)에서 YFP-PRP C의 발현은 일시 발현이 매우 과발현 YFP-PRP C 레벨 (16)가 발생하지 않음을 시사 낮았다. 또한, YFP-PRP C는 PRP C에 대한 항체를 이용하여 형질 전환 된 N2A 세포의 경우 YFP-PRP C가 매우 모두 형질 전환 및 내생 PRP C는 유사하게 동작하는 것을 제안, 내생 PRP C와 colocalized 것으로 나타났다. PRP C는 모터와 관련된 것을 확인하기 위해, 소포 immunoisolations 16을 수행 하였다.
최적화물 맵핑 연구를 들어, 마이크로 채널의 오른쪽 에지는 라이브 고정 IMA 동안 시야와 정렬이미지에 위해 축삭의 같은 영역을 드래그하는 그림 2. (그림 1B, C에서 빨간색 사각형으로 표시)와 그림 3은 매핑이 일시적으로 YFP-PRP C로 형질 전환 된 신경 세포의 분석화물에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. YFP-PRP C를 들고 소포가 키네신-1 가족과 네인 중쇄 1 (DYNC1H1) (16)의 회원들에 의해 포유 동물의 축색 돌기에 수송된다, 따라서 YFP-PRP C 소포는 키네신-1 서브 유닛 키네신 빛 체인 1 (KLC1)를 매핑하고 및 모터를 DYNC1H1합니다. YFP-PRP C 소포 운동은 몇 군데와 kymograph (그림 2A)에 그려졌다. kymographs에서, 선행 성 및 YFP-PRP C 소포의 역행 운동은 각각 음과 양의 기울기와 궤적으로 표시되며, 고정 소포 수직 궤도에 의해 설명된다. 고정에서, 모든 운동은 kymograph에서 대각선 라인의 부재로 표시 멈췄(도 2A). 고정, 투과 가능 축삭 분자 모터 및화물의 IF 신호는 반점 (16) (그림 2B, C)입니다. "화물 매핑"의 목적은화물 채널 (도 2B)에서 눈물 점은 다른 두 채널 모터 눈물 점 (도 2C)로 colocalize 여부를 결정하는 것이다. 이렇게하려면 고정 YFP-PRP C 소포 및 기공 눈물 점에 관련된 KLC1과 DYNC1H1 대응 IF 이미지의 형광 이미지는 kymograph (그림 2B, C)에 정렬했다. 가우시안 함수는 라이브 영상 (도 2D)에 의해 얻어진화물 궤적 모터 XY 정확한 위치를 매핑하기 위해 3 개의 채널에서의 형광 점 광원의 점 분포 함수에 장착 하였다. 내생 KLC1 및 DYNC1H1 모터 반점 염색으로 표시하고 YFP-PRP C 소포 (그림 2D)와 차동 colocalized 밝혔다. Colocali아네트는 가우시안 XY의 colocalization을 YFP-PRP C 및 KLC1 및 DYNC1H1 눈물 점 각각 간의 좌표 위치의 레벨 (도 3a에 의해 300 nm의 거리 내에 YFP-PRP C의 존재 및 모터 눈물 점에 의해 정의 및 정량 하였다 ). 이 거리는 광학 광의 회절 한계와화물 및 모터 서브 유닛의 중요한 물리적 크기에 기초하여 선택되었다. YFP-PRP C 소포와 관련된 KLC1과 DYNC1H1의 상대적인 양을 각각의 눈물 점 (그림 3B)의 강도를 나타내는 가우스 진폭로부터 얻은 것입니다. 원하는대로 이러한 데이터는 더 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 모터의 강도가 제어 사이의 YFP-PRP C의 눈물 점 (야생형 - WT)와 colocalizing 신경 세포와 그 다른 키네신-1 서브 유닛 부족 (KIF5C는 - / - 그림 3a에 신경, KIF5C는 키네신-1의 구성원입니다 가족) 여부를 결정하기 위해 비교 될 수 KIF5의 부재C는 (KLC1과 DYNC1H1 강도가 실험 (16)에 변화가 없었다) YFP-PRP C 소포에 KLC1 및 / 또는 DYNC1H1의 연결을 방해. 또한, KLC1 및 DYNC1H1 강도는 상대적으로 모터의 금액과 운동의 방향성 (그림 3B) 사이의 가능한 상관 관계를 자세히 조사하기 위해 플롯 할 수 있습니다. 예를 들어, YFP-PRP C 소포가 이동하는 것을 및 / 또는 고정 KLC1 및 / 또는 DYNC1H1 (그림 3B) 모두와 관련.
마이크로 유체 장치에서 배양 그림 1. 해마 신경 세포. 미세 유체 장치의 (A) 그림. 저수지의 윤곽은 빨간색과 파란색 염료에 의해 시각입니다. 번호는 프로토콜에서 사용되는 미세 유체 저수지의 수를 나타냅니다. 미세 유체 장치의 (B) 다이어그램. 숫자는 저수지에 해당하는 I미디어와 뉴런이 추가 N. 형질 전환 된 신경 세포는 녹색으로 표시됩니다. 빨간색 사각형과 붉은 점선 화살표는 라이브와 고정 된 형광 이미징에 권장되는 지역을 나타냅니다. YFP-PRP C가 하나의 마이크로 채널을 통해 성장 형질이 축삭의 (C) 이미지 (한 마이크로 장치의 가장자리하는 점으로 구분 된 흰색 선으로 설명되어 있습니다) . 개별적으로 이동 YFP-PRP C 소포 밝은 눈물 점으로 구분 될 수있다. 스케일 바는 10 μm의입니다. . 그림에서 적응된다. Encalada 등 (16) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. "화물 매핑"와 YFP-PRP C 소포 수송의 상관 관계YFP의 키네신과 네인 모터의 상대적인 양. 라이브 이동 및 전동 무대와 CCD 카메라와 100X / 1.4 NA 오일 목적으로 장착 거꾸로 현미경에 찍은 고정화물의 와이드 필드 형광 이미지. (A) Kymograph 도 1 (c)에 표시 한 축삭의 -PrP C 소포 운동. 라이브 운동은 30에서 100 밀리 노출 (10 Hz에서)에서 60 초까지의 총 시간을 기록했다. 세포는 적어도 15 초 동안화물의 움직임을 영상화 한 후 수정되었습니다. 점선은 라이브 영상 중 고정의 시간을 나타냅니다. 빨간색 상자 (B, C)에서 강조에 확대 소포의 영역을 보여줍니다 (D). 화살촉은 (D) 고정 (파란색)에 해당하는, 역행 (빨간색) 및 선행 성 (녹색) 궤도에 표시된 세 개의 소포를 가리 킵니다. ( 해당 kymograph에 정렬 고정 YFP-PRP C 소포의 B) 이미지. 숫자에를 나타낸다kymograph에 눈물 점을 식별 가능한 매핑 된 분리 된 YFP-PRP C 소포. 선행 성 소포는 역 행성은 적색이며, 고정 된 사람은 파란색, 녹색. KLC1 및 DYNC1H1 눈물 점의 이미지 (B)에 나타낸 바와 같은 지역에 해당하는 경우 고정 (C). 스케일 바 (AC)는 10 μm의입니다. 고정 IF의 (D) 확대 차원 가우스 함수 과제와 세 개의 채널 각각의 신호. 파란색 점 빨간 점 가우스 맞는을 나타내는 지역 세기 최대의 픽셀을 나타내며, 분홍색 점은 둘 사이의 중복입니다. 화살촉 (A)에 도시 YFP PRP-C 소포의 예를 나타내고, KLC1 및 DYNC1H1 모터 단백질과 그들의 차분 colocalization을. 스케일 바는 2 μm의입니다. . 그림은에서 적응된다. Encalada 등 16 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림입니다.
그림 3. 양적는 YFP-PRP C 소포의 "화물 매핑"분석. YFP-PRP C 소포, WT에 KLC1과 DYNC1H1 및 KIF5C 녹아웃 뉴런 사이의 colocalization을의 (A) 정량 (KIF5C - / -). / - -. = 1629 16 바 내부 숫자 카테고리 당 소포의 수를 나타냅니다 분석 눈물 점의 총 수는 N WT = 887과 N KIF5C했다. SEM ± 평균은있는 바와 같다. 비 파라 메트릭 순열 t 시험. 유전자형 29 간의 비교를 위해 사용 (A)에서 분석 된 데이터의 WT 뉴런에 대하여 모터 조성물과 움직임의 방향성 (B) 상관 하였다. Encalada 등 16. 그림에서 적응된다..jove.com / 파일 / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 실시간 뉴런 상대적인 유형 및 연관된 모터 단백질의 양 개별 형광 미세 소관 기반 이동화물 입자의 이동 방향성의 상관을 가능하게한다. 이전 축삭 기공화물의 총 모터 조성물은 생화학 적 정제 소포와 세포 기관 9,15의 이기종 인구에 측정 하였다. 그러나, 전지 내부의화물 단일 유형 특성화 모터 조성물 때문에 균질 소포 개체군을 정제에 어려움 도전왔다. 모터 스톨 힘의 측정은 초파리 배아에서 활성 모터 번호의 추정치를 제공하면서 운동의 방향성 모터가 안정적으로화물 또는화물 12에 / 활성 모터의 빠른 연결 / 분리에 결합되는 상관 관계가 있는지 여부 또한 불분명했다. 따라서 "화물 매핑"프로토콜은 descri여기 베드는 상기 유형 개별적 라이브 뉴런화물 이동하도록 연관된 모터 상대적인 수 간의 상관 관계를 조사하기 위해 개발되었다.
성공적 "화물 맵핑"로부터 데이터를 획득하기 위해서는 높은 공간적 해상도화물 이동의 이미징 및 고정 IF를 수행) 한 중요하다, 2) 3) 영역을 정렬, 이미징 과정에서 시료의 바로 고정을 보장 라이브 및 정착 화상의 관심은 동일한 이미지 이동 kymographs에 고정화물 및 모터를 매핑하고, 4) 정밀 XY화물과 모터 단백질 사이 colocalization을 양을 결정하기 위해화물 및 모터 형광 눈물 점의 좌표를 결정한다.
이 프로토콜은 마이크로 유체 장치에서 재배 뉴런의 균일 조직 축삭에서 전송 특성을 분석하는 것이 유일하게 적합하지만,이 연구 과제의 넓은 범위로 구성 될 수있다. 예를 들어,이되는 응용 프로그램기가 엔도 / 엑소 시토 시스에 관련된 자신의 어댑터와 소포의 관계를 특성화하기 위해 사용될 수있다 (예를 들어, 인신 매매 섬유 아세포에서 분석), 또는 미세 소관 (microtubule) + 팁 결합 단백질로 표지 미세 소관의 성장. 이러한 경우, 미세 유체 장치는 상관 라이브에 필요한 몇 군데 세포와 고정 영상 검사의 현지화를 촉진하기 위해 격자로 된 커버로 치환 될 수있다. 이 프로토콜은 또한 시간에 매개 변수 변경은 특정 셀룰러 환경에 의존하는 셀룰러 이벤트를 특성화하기 위해 사용될 수있다. 예를 들면, 세포질 내로 개별 엔도 솜 구조로부터 형광 표지 된 바이러스 단백질의 방출은 엔도 솜 단백질의 발현 및 / 또는과 상호 연관 될 수있다.
이 프로토콜의 한 가지 제한은 고밀도화물의 매핑이 어려울 수 있다는 것입니다. 그러나, 가우스 함수의 할당은 허용함으로써 크게이 문제를 우회서브 픽셀 레벨에서 형광 눈물 점 간의 위치의 차이. 또한, 축삭화물에 모터의 매핑은 낮은 처리량은 다음과 같습니다 현재, 매핑이 신경 세포의 형질의 낮은 속도와보기의 제한된 분야 고에 필요한 높은 배율을 사용하여 주어, 미세 유체 소자 당 2 축삭을 위해 수행 할 수 있습니다 우리의 카메라 해상도 영상. 이 방법의 미래 발전은 높은 효율, 형광 태그 단백질 또는 증가합니다 모두 Lysotracker 또는 Mitotracker, 작은 형광 염료와 세포 기관의 라벨을 표현하는 유전자 변형 쥐에서 신경 세포의 분리와 신경 세포를 형질 도입하는 렌티 바이러스 시스템의 사용을 포함 할 수 있습니다 형광 마커로 표지 축삭의 수. 또한, 기록 된 영역의 크기는 배율, 픽셀 크기 및 이미징에 사용되는 카메라의 화소 배열의 크기에 의해 제한된다. 이미징 기술 분야의 지속적인 발전은보다 큰 영역에 대해 허용s는 미래에 이미징 따라서 실험 조건별로 획득 된 데이터의 양이 증가한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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