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Neuroscience

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis "Mapeo de carga"

Published: October 30, 2014 doi: 10.3791/52029
* These authors contributed equally

Abstract

La comprensión de los mecanismos por los cuales los motores moleculares coordinan sus actividades para el transporte de cargas vesiculares dentro de las neuronas requiere el análisis cuantitativo de las asociaciones de motor / carga a nivel de la vesícula sola. El objetivo de este protocolo es el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa para correlacionar ("mapa") la posición y la direccionalidad del movimiento de la carga en vivo a las cantidades relativas de composición y motores asociados con la misma carga. "Mapeo de carga" se compone de imágenes en vivo de las cargas marcados con fluorescencia que se mueven en los axones cultivadas en dispositivos de microfluidos, seguido por fijación química durante la grabación de movimiento en vivo, y la posterior inmunofluorescencia (IF) tinción de las mismas regiones axonal exactas con anticuerpos contra los motores. Colocalización entre las cargas y los correspondientes motores se evalúa mediante la asignación de la posición de sub-píxel coordina a los canales de motor y de carga, por las funciones de ajuste de Gauss a la difracción de lifunciones de dispersión de punto mited representan fuentes puntuales fluorescentes individuales. De carga y de motor imágenes fijas se superponen posteriormente a parcelas de movimiento de carga, al "mapa" a sus trayectorias seguidas. La fuerza de este protocolo es la combinación de datos en vivo y SI para grabar tanto en el transporte de cargas vesiculares en células vivas y para determinar los motores asociados a estas mismas vesículas exactas. Esta técnica supera los desafíos anteriores que utilizan métodos bioquímicos para determinar la composición media del motor de las poblaciones de vesículas purificadas a granel heterogéneos, ya que estos métodos no revelan composiciones sobre cargas móviles individuales. Además, este protocolo se puede adaptar para el análisis de otras vías de transporte y / o trata de personas en otros tipos de células para correlacionar el movimiento de las estructuras intracelulares individuales con su composición de proteínas. Las limitaciones de este protocolo son el relativamente bajo rendimiento debido a las bajas eficiencias de transfección de cultaneuronas primarias y un campo de visión limitado disponible para imágenes de alta resolución. Las aplicaciones futuras podrían incluir métodos para aumentar el número de neuronas que expresan cargas marcados con fluorescencia.

Introduction

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Transporte intracelular es crítico en todos los tipos de células para el suministro de proteínas, membranas, orgánulos, y moléculas de señalización a varios dominios celulares 1. Las neuronas son células altamente especializadas con proyecciones largas y polarizadas que dependen críticamente de transporte intracelular de las cargas esenciales para su entrega a larga distancia a diferentes microdominios axonal. Este transporte está mediado por kinesins y dyneins - dos grandes familias de proteínas motoras moleculares - que se unen a las cargas y realizar un seguimiento a lo largo de los microtúbulos polarizados en direcciones anterógrada y retrógrada, respectivamente. Mientras movimiento retrógrado está mediada principalmente por la dineína, el movimiento en la dirección anterógrada se ve facilitada por una gran familia, diversidad funcional de los motores de quinesina. En consecuencia, el transporte axonal anterógrado de cargas podría estar mediado por diversos miembros de la familia de la superfamilia kinesin 1-5. Aunque algunas cargas se mueven persistentemente en cualquier dirección, ma mayoría de las cargas se mueven de forma bidireccional y revertir con frecuencia en su camino a su destino final 1,5-13. Además, se ha demostrado que los motores de oponerse a la direccionalidad asociado simultáneamente a las cargas, planteando la cuestión de cómo el movimiento regulado de cargas está coordinado por motores de polaridad opuesta 5-7. En conjunto, el transporte de cargas axonal es un proceso concertado que está regulada por la composición de los motores y sus actividades bioquímicas específicas, las cuales a su vez dependen de diversos adaptadores y parejas de unión de regulación 14.

Para describir fielmente el mecanismo de transporte axonal para una carga específica y para descubrir la regulación subyacente de que el transporte, es de suma importancia para determinar la composición de las proteínas de motor y de sus compañeros de unión regulatorios asociados con cargas individuales durante su transporte en vivo. Otros métodos, como por ejemplo los enfoques bioquímicos, proporcionan estimaciones de mot promedioo composiciones en las poblaciones heterogéneas de vesículas purificadas, pero estas estimaciones no revelan el tipo o la cantidad de motores asociados a vesículas móviles individuales. Además, la reconstitución de transporte de vesículas a lo largo de los microtúbulos premontados in vitro permitió medir la cantidad de un tipo de motor en un solo nivel de la vesícula 15. Sin embargo, estos experimentos no se correlacionaron directamente la cantidad de motores con las características de transporte de estas vesículas, y se midió el transporte en ausencia de factores reguladores celulares.

Un protocolo es presentado aquí, que determina la composición de motor (tipo y cantidad relativa de motores) de las vesículas móviles individuales de inmunofluorescencia (IF) de datos de medición de forma endógena expresaron proteínas motoras, y correlaciona estos parámetros para el transporte directo de las mismas vesículas exactas en las neuronas 16. Este método implica el mapeo preciso de los datos de movimiento de carga SI-a-live. Esto se logra mediante growing neuronas del hipocampo de ratones en los dispositivos de microfluidos siguientes establecieron protocolos 17-19. Estos dispositivos permiten la identificación y correlación ("mapeo") de los axones y las cargas móviles individuales en las modalidades de microscopía de luz fijas y en directo (Figura 1). Neuronas cultivadas se transfectaron con proteínas marcadas con fluorescencia de carga cuyo transporte está fotografiado en la alta resolución espacial y temporal para obtener información detallada movimiento que se traza en kymographs. Durante el curso de formación de imágenes, las neuronas se fijaron con paraformaldehído, y posteriormente se tiñeron con anticuerpos contra las proteínas motoras endógenos. De carga y de motor imágenes fijas se superponen en kymographs movimiento vivo de "mapa" (colocalize) a la carga viva movimiento trayectorias 16. Para correlacionar el movimiento vivo de las cargas con la asociación de proteínas motoras, colocalización se analiza el uso de un paquete de software MATLAB encargo llamado "Motor Colocalización "16,20. Cargas y motores marcados con fluorescencia generan características puntiformes de difracción limitada que pueden superponerse parcialmente. Para resolver la situación de los puntos lagrimales se superponen, el software se adapta automáticamente primero las funciones de Gauss para cada función de dispersión, lo que representa puncta fluorescente individuo, para determinar su posición exacta XY sub-píxel coordina e intensidad amplitudes 21-23. Las posiciones de los motores y las cargas son posteriormente se comparan entre sí para determinar colocalización 16,20. Por lo tanto, este método asigna más precisamente colocalización entre puncta fluorescente en comparación con otros métodos 24.

La fuerza de este método es la capacidad de evaluar la colocalización de los motores con carga individual en células fijadas, para el que las trayectorias de movimiento en vivo (por ejemplo, la dirección en la que se movían en el momento de la fijación) han sido recorded. Con este método, se encontraron kinesins y dyneins para asociar simultáneamente a vesículas que llevan la proteína priónica normal (PrP C -Celular), una carga neuronalmente enriquecido que se mueve bidireccionalmente o permanece estacionario en los axones 16. Este análisis permitió la formulación de un modelo de trabajo para la regulación de la PrP C en la que el movimiento de vesículas anterógrada (kinesina) y (dineína) motores retrógradas coordinan sus actividades con el fin de mover las vesículas en cualquier dirección o permanecer estacionario mientras asociada a la carga . Otro punto fuerte de este método es su aplicabilidad potencial amplio para la caracterización de colocalización / asociación de muchas cargas marcados con fluorescencia que se mueven en virtualmente cualquier tipo de célula, con cualquier otra proteína (s) de interés. Por lo tanto, la correlación en vivo / fijo potencialmente podría permitir la detección de transitorios interacciones proteína-carga, como muchos fluorescentemente marcado individuo partículas en movimiento puede ser analizada sobre un p deseadaeriodo de tiempo. Dada la amplia aplicabilidad y el tipo de preguntas que este método puede abordar, este protocolo será de interés para una amplia audiencia de los biólogos celulares, incluyendo los que estudian el tráfico y el transporte en las neuronas o en otros tipos de células.

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Protocol

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Se llevaron a cabo todos los experimentos siguientes protocolos aprobados y de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado humanitario de los animales de investigación. Neonato ratones fueron sacrificados por decapitación.

1. Preparación de dispositivos de microfluidos para Cultivo Celular

  1. Preparar polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos de microfluidos para el crecimiento de las neuronas del hipocampo como se describe por Harris y sus colegas 17-19. A continuación se presentan algunas modificaciones que se adaptaron al protocolo de asignación de carga.
    NOTA: Los dispositivos de microfluidos también están disponibles comercialmente (Lista de Materiales), así el acceso a una instalación de fabricación no es necesario.
  2. Preparar No. 1 ½ cubreobjetos (24 x 40 mm) lavándolas tres veces con acetona, seguido por tres lavados con etanol al 100% y tres lavados de agua. Tienda cubreobjetos en agua a 4 ° C hasta su uso. Estos tratamientos ayudan a garantizar que los cubreobjetos son limpios de escombros que podrían interferir con el chapado de cells, la contaminación, y la supervivencia.
    NOTA: La acetona y el etanol son inflamables y peligrosos en caso de contacto cutáneo (irritante), del contacto con los ojos (irritante), de ingestión, de inhalación. Deseche de acuerdo a las disposiciones oficiales.
  3. Cuando esté listo para usar, coloque una cubierta de vidrio en un 60 mm plato de cultivo celular por dispositivo de microfluidos, y dejar secar al aire sin tapar por 45 minutos en el interior de una cabina de bioseguridad para evitar la contaminación.
  4. Después de los dispositivos son un recorte de los maestros y los punzones se han recortado para crear los embalses (Figura 1A, B), colocarlos con el lado de los canales de microfluidos en marcha dentro de un gabinete de bioseguridad equipado con una lámpara UV durante 45 minutos para la esterilización.
    NOTA: Dejar los dispositivos en tratamiento UV durante más de 2 horas podría afectar a la integridad de los PDMS.
  5. Montar los dispositivos mediante la colocación de un dispositivo en cada vidrio de cubierta 60 mm dentro de la placa de cultivo celular de plástico de modo que los canales de microfluidos boca abajo. Aplique una leve presión a la parte superior of el dispositivo (evitar tocar los microcanales) para proporcionar un sellado no permanente del dispositivo para el vidrio de cubierta. Cubrir cada 60 mm placa de cultivo celular con una tapa.
  6. Usando una micropipeta, hidratar los dispositivos mediante la adición de agua de calidad de cultivo celular para los dos primeros depósitos de microfluidos (1 y 2 en la Figura 1A), permitiendo que el agua fluya a través. Eliminar el agua con una micropipeta y se añade 1 mg / ml de poli-L-lisina en el depósito de microfluidos 1 (200 l) y 2 (100 l). El diferencial de volumen permitirá la poli-L-lisina para fluir a través de los microcanales (Figura 1A, B).
  7. Para asegurarse de que los dispositivos dentro de los 60 mm placas de cultivo celular no se caiga sobre el interior de una incubadora a 37 °, coloque tres placas de cultivo celular de 60 mm que contienen los dispositivos en un 150 mm de células de plástico placa de cultivo y cubrir el plato con una tapa. Incubar O / N en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Típicamente más del 90% de los canales están disponibles por dispositivo y hacerno contener las burbujas de aire o bloqueo físico.
  8. Al día siguiente, reemplace poli-L-lisina con agua y dejar el dispositivo en la incubadora durante al menos 1 h. Repita este lavado tres veces. Retire el agua y añadir Neurobasal-Un medio de crecimiento (que contiene 2% de B-27 suplementos y 500 M GlutaMAX) para cada dispositivo. Deja O / N en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
  9. Al día siguiente, la placa de las células del hipocampo como se describe a continuación.

2. Revestimiento del ratón de las neuronas del hipocampo primaria en dispositivos de microfluidos

NOTA: La preparación de las neuronas del hipocampo cultivadas de ratas neonatas se ha publicado previamente en JoVE 25. A continuación se presentan algunas modificaciones que se adaptaron a las neuronas del hipocampo de ratones placa en dispositivos de microfluidos, y que eran óptimas para transfecciones.

  1. Antes de la disección de cerebro de ratón, que contenía suero bovino fetal al 10% Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) pre-cálida(FBS; sin antibióticos), la Mezcla A (125 mg DL-cisteína, 125 mg de albúmina de suero bovino (BSA) y 3,125 g de D-glucosa en 500 ml de tampón fosfato salino (PBS); esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 micras) , y desoxirribonucleasa I solución (DNasa I: 50 mg de DNasa I y 0,5 ml de una 4 solución 1,2 M MgSO en ml solución salina equilibrada de Hank (HBSS) filtro de 100 esterilizar a través de un filtro de 0,22 micras) en un baño de agua a 37 ° C.
    1. Pre-caliente-A Neurobasal medio de crecimiento dentro de una incubadora a 37ºC con 5% de CO 2 para equilibrar el pH.
  2. Diseccionar hipocampos 1-3 días de edad ratones recién nacidos de acuerdo con los protocolos establecidos 26. Mantenga hipocampos en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de tampón de disección (HBSS que contiene 10 mM HEPES pH 7,4, glucosa 50 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina), en hielo. Ponga hasta 4 hipocampos por cada 15 ml tubo cónico.
  3. Realizar el protocolo restante es en condiciones estériless dentro de una cabina de bioseguridad.
  4. Diluir 45 unidades de papaína en 5 ml de la mezcla A, vórtice, y se incuba durante 5 min a 37 ° C hasta que se disuelva el polvo papaína. Añadir 1 ml de solución de DNasa I. Se filtra la mezcla a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,22 micras.
  5. Cuidadosamente aspirado de HBSS 'de 15 ml tubo que contiene hipocampos cónicos. Añadir 10 ml de frío (4 ° C) HBSS para hipocampos y dejar que se depositan en el fondo del tubo. Aspirar con cuidado 15 ml de HBSS tubo cónico.
  6. Añadir 1 ml de papaína / DNasa mezclo para hasta 4 hipocampos y se incuba durante 20-30 minutos a 37 ° C. Incline tubo cónico de cada 5 min a bañar con la mezcla de hipocampos. Alternativamente colocar hipocampos en un 37 ° C agua agitador baño con agitación suave (~ 100 rpm).
  7. Aspirar la papaína / DNasa mezclo y lavo dos veces con DMEM hipocampos pre-calentado (37 ° C) que contiene 10% de SFB.
  8. Después de segundo lavado, añadir 2 ml de pre-calentado DMEM que contiene 10% de SFB a hipocampos y hipocampos se tritura manualmente mediante pipeteoarriba y abajo ~ 10-12 veces usando una punta de pipeta 1 ml de disociar las neuronas.
  9. Vamos triturado se conforman con ~ 1 min, ya que esto permitirá que las neuronas no disociadas a asentarse en el fondo del tubo cónico. Transferir el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a un nuevo tubo cónico de 15 ml evitando la transferencia de tejido más grande que se ha asentado en la parte inferior del tubo.
  10. Girar las células a 1.000 xg durante 2 min y retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Resuspender las células en 80 l Neurobasal-Un medio de crecimiento con la pipeta suavemente.
  11. Retire medio desde el depósito de microfluidos 1 y 1 '. Aplique 20 l de células (~ 275.000) para el depósito de microfluidos 1, y permitir que fluyan a través. Coloque dispositivo en incubadora a 37ºC con 5% de CO2 durante 20 min.
  12. Busque bajo microscopio para asegurar que las células se han adherido a la cubierta de vidrio. Añadir Neurobasal-Un medio de crecimiento para rematar todos los embalses. Dispositivo de retorno con las células a una incubadora a 37 ° C con 5% de CO
  13. Revise todos los dispositivos de evaporación ~ 2-3 días y rematar embalses con Neurobasal-A 2% de B-27 suplemento que contiene (sin GlutaMAX) que deben evitarse. Las neuronas comienzan a extender sus axones a través de canales de microfluidos ~ 2-3 días después de la siembra. Neuronas reservamos el derecho de transfección típicamente 7-10 días después de la siembra.

3. La transfección de las neuronas del hipocampo Crecido en dispositivos de microfluidos

  1. Por dispositivo, preparar una mezcla de 1,2 l Lipofectamine 2000 en 30 l Neurobasal-A, y una mezcla de 0,5 g plásmido de fusión de carga fluorescente en 30 l Neurobasal-A e incubar 5 min a TA. Añadir la mezcla de Lipofectamine a la mezcla de ADN y se incuba durante 20 min a TA. Añadir 60 l de Neurobasal-A que contiene un 4% de B-27 suplemento del ADN / Lipofectamina mezclar y mezclar con un movimiento rápido del tubo.
  2. Retire todos los medios de comunicación desde el depósito de microfluidos 2 y 2 'y llenar cuidadosamente pozos con Neurobasal-A que contienen 2% de B-27 suplemento sin derramar en el mediano into los otros compartimientos.
  3. Retire el medio de depósito de microfluidos 1 y 1 '. Añadir 120 l de ADN / Lipofectamina mezclar al depósito de microfluidos 1 y dejar que fluya. Dispositivo Regreso a 37 ° C incubadora con 5% de CO2 durante 3-4 horas.
  4. Retire todos los medios de comunicación desde el depósito de microfluidos 1 y 1 'y reemplazar con Neurobasal-A que contiene 2% de B-27 suplemento durante 24 horas (o hasta que esté listo para la imagen). Por lo general, 5-7 axones que crecen a través de microcanales se transfectaron en esas condiciones, que representan aproximadamente el 1-3% de eficiencia de transfección en consonancia con las eficiencias publicadas por células cultivadas de hipocampo 26.

4. Los análisis "Asignación de Carga"

  1. Imágenes en vivo de movimiento de carga
    1. Realizar la formación de imágenes en un microscopio de epifluorescencia luz invertido equipado con una incubadora a 37 ° C y una cámara de control de CO 2.
    2. Montar el cubreobjetos con las neuronas del hipocampo cultivadas en un micrdispositivo ofluidic en la platina del microscopio. Para evitar la muerte neuronal, trabajar con rapidez para mantener las muestras en el microscopio durante no más de 1 hora.
    3. El uso de un objetivo de alta resolución (100X), encontrar los axones de las células transfectadas que se extienden a través de los canales de cámaras de microfluidos y registrar el número de los canales en los que se encontró el axón transfectadas. Cuente el número de canales usando un contador de recuento mano.
      1. Para la grabación óptima de movimiento en vivo y análisis de colocalización posterior, elija axones que crecen relativamente plana a través de los canales de manera que la imagen de la mayoría de las vesículas se puede realizar en el foco.
    4. Eliminar la mayor parte del medio de los depósitos 2 y 2 'con una pipeta de transferencia de plástico de 1 ml. Para facilitar la posterior alineación de las imágenes fijas con las trayectorias de movimiento en kymographs, alinee el borde derecho de los microcanales con el campo de visión durante la proyección de imagen (Figura 1B, C).
    5. Para facilitar fixing de las muestras durante la formación de imágenes, realizar imágenes en vivo con dos personas. Alternativamente, si la imagen en vivo se lleva a cabo por una sola persona, utilizar un sistema de microscopio equipado con corrección de deriva.
    6. Iniciar el movimiento de carga de imágenes en vivo con las especificaciones de lapso de tiempo específicos para la dinámica de transporte de la carga que se analizan (las especificaciones y ajustes del microscopio para obtener imágenes de YFP-PrP C se especifica en la leyenda de la Figura 2 y la Lista de Materiales).
    7. Después se han recogido suficientes datos de movimiento en vivo, tener una persona llenar los embalses 2 y 2 'con paraformaldehído pre-calentado 4% en PBS que contenía 0,04 g / ml de sacarosa al fijar las células. Evite tocar el dispositivo de microfluidos, ya que esto alterará el enfoque de la imagen en vivo. Haga que la otra persona ajustar el enfoque mientras se añade el fijador. La fijación se realiza correctamente cuando se observa la parada inmediata del movimiento. Añadir fijador al depósito 1 y 1 'después.
      NOTA: photoblea Temporalching de la fluorescencia de carga también puede ser observado, pero la fluorescencia persiste después de la tinción SI para proteínas motoras se completa (paso siguiente).
      NOTA: El paraformaldehído es nocivo por inhalación, contacto con la piel y por ingestión. Irrita los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Deseche de acuerdo a las disposiciones oficiales.
  2. SI tinción de proteínas motoras para el análisis de colocalización
    NOTA: Para la cuantificación de los niveles relativos de proteínas motoras (como se determina por tinción de anticuerpos), asociados a las cargas móviles individuales, validar y titular anticuerpos para asegurarse de que la unión antígeno-anticuerpo está saturado. Esto se realiza mediante la determinación de la especificidad del anticuerpo usando las neuronas en el que la proteína de interés ha sido noqueado o sea derribado, y mediante la realización de análisis de SI con el aumento de las concentraciones de anticuerpos. Para los controles negativos, las neuronas se tiñen con anticuerpos secundarios en ausencia de anticuerpos primarios. Más detalladaDescripción de la validación de anticuerpo se puede encontrar en Encalada et al. 16, y Szpankowski et al. 20.
    1. Quite el cubreobjetos con las neuronas del hipocampo cultivadas en dispositivo de microfluidos de la platina del microscopio. No desconecte el dispositivo de microfluidos del cubreobjetos, como los microcanales tienen que permanecer intacto con el fin de superponer las imágenes en directo y fijas. Lleve a cabo los siguientes pasos en una cámara de humedad.
    2. Para asegurar el flujo de soluciones en los microcanales, mantener un diferencial de volumen de tampón entre los embalses 1, 1 'y 2, 2' de al menos 30 l. en todas las etapas posteriores. Por ejemplo, aumentar el volumen de 100 medios de comunicación mu l de depósito de microfluidos 2, 2 ', y el volumen de los medios de comunicación de 70 l de depósito de microfluidos 1, 1'.
    3. Quite el fijador de cámaras del dispositivo de microfluidos y lavar las células tres veces con PBS de espera de 10 minutos entre lavados.
    4. Permeabilizar las células mediante la adición de 0,1% de Triton X-100 Diluted en PBS durante 5 min a todos los embalses.
    5. Retire la solución de todos los tanques y lavar con PBS. Repita el lavado tres veces esperando 10 minutos entre lavados.
    6. Retire la solución de todos los tanques y aplicar el amortiguador de bloqueo que contiene 10% de suero normal de burro y el 3% de la proteasa libre y la inmunoglobulina G (IgG) exento de BSA en PBS y se incuba durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
    7. Haga girar solución de anticuerpos de la primaria a 20.000 xg durante 5 min para eliminar precipitados. Diluir el anticuerpo a una concentración apropiada en tampón de bloqueo. Vuelva a colocar el tampón de bloqueo de dispositivo de microfluidos con una solución de anticuerpo. Incubar las muestras durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
    8. Retire la solución de todos los tanques y lavar tres veces con PBS, a la espera de 10 minutos entre lavados.
    9. Girar solución de anticuerpo secundario de valores a 20.000 xg durante 5 min para eliminar precipitados. Diluir el anticuerpo a una concentración apropiada en tampón de bloqueo. Reemplazar con PBS solución de anticuerpo secundario. Incubarmuestras durante 1 hora a RT.
    10. Retire la solución de todos los tanques y lavar tres veces con PBS, a la espera de 10 minutos entre lavados.
    11. Reemplazar con PBS ~ medio de montaje 10-20 l pipeteando directamente medio de montaje en la abertura de los canales que conectan los depósitos. Deje de montaje en seco de medios para ~ 20 min - 1 hora a temperatura ambiente.
    12. Dispositivos se almacenan a 4 ° C protegido de la luz para evitar photobleaching y axones de imagen dentro de dos días (máximo una semana) de tinción.
    13. Una vez finalizada la tinción, montar cubreobjetos con las neuronas del hipocampo cultivadas en dispositivo de microfluidos en la platina del microscopio. Localice la región del axón transfectadas reflejado en el paso 4.1.1-4.1.7.
    14. Adquirir imágenes Z-Stack (300 nm) pasos para cada uno de los tres canales: carga, motor 1, motor 2, utilizando un objetivo de alta resolución (por ejemplo, un alto objetivo numérico de aceite abertura o agua).
      NOTA: Adquisición de Z-pilas es importante ya que los axones a menudo no crecen perfectamente planaen microcanales y por lo tanto no todos los puntos lagrimales fluorescente están en el mismo plano focal.
  3. Mapeo de carga
    1. Generar un quimógrafo de movimiento de carga utilizando el software de análisis de imágenes. Se recomienda el plugin de ImageJ desarrollado por Rietdorf y Seitz (EMBL) para generar kymographs (para descargar ver Lista de Materiales).
      NOTA: ImageJ es un dominio público, el programa de procesamiento de imágenes basado en Java desarrollado en los Institutos Nacionales de la Salud 27,28 (para descargar ver Lista de Materiales).
    2. Alinear las imágenes fijas de la carga fluorescente (generada en el paso 4.2.14) manualmente mediante la superposición de ellos en la posición de las trayectorias en el quimógrafo en el punto de fijación (Figura 2A, B), usando un programa de software de gráficos comercialmente disponible (Materiales Lista). Alinear manualmente por primera superposición de la imagen de carga fija en el quimógrafo y elegir manualmente los puntos lagrimales de carga que corresponde a una trayectoria específica enla quimógrafo. Para obtener los mejores resultados de la alineación, utilice la rebanada Z que es en el mejor enfoque para la carga asignada. Varias rebanadas Z pueden ser utilizados.
    3. Para cada imagen en el Z-pila (carga, los motores 1 y 2; generada en el paso 4.2.14) determinar las coordenadas XY y amplitudes de intensidad para cada puncta fluorescente utilizando un algoritmo establecido para encajar gaussianas 2D a la función de dispersión de punto que representa cada fuente de punto en cada uno de los tres canales 16,20,21 (Figura 2D).
      NOTA: Para obtener las coordenadas XY, una hecha a la medida del paquete de software MATLAB llamada "Motor Colocalización" fue desarrollado 16,20, que incorpora un algoritmo de ajuste de Gauss desarrollado por Jaqaman, Danuser y colegas 21-23. El paquete de software y las instrucciones detalladas para su uso se pueden obtener a petición.
    4. Para cada uno de los puntos lagrimales carga individual que se proyecta sobre las trayectorias de móviles o estacionarias en el quimógrafo, seleccione tél coordenadas XY y amplitudes de intensidad de los resultados del programa "Motor Colocalización" (estas cargas están etiquetados individualmente en la figura 2B). Utilice varias imágenes Z-pila adquiridos en el paso 4.2.14) para asignar más cargas que se encuentran en diferentes planos focales.
    5. Comparar el individuo coordenadas XY para la carga asignada a los obtenidos para cada uno de los canales de motor en la correspondiente rebanada Z (Figura 2D). Determinar y seleccionar las coordenadas XY de motor que se encuentran dentro de un radio de 300 nm de la carga. Para cargas y motores que tienen señal en el mismo plano focal, utilice el paquete de software "Motor Colocalización" para determinar los puntos lagrimales que se encuentra dentro de un radio de 300 nm.

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Representative Results

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La Figura 1 muestra una visión general del dispositivo de microfluidos utilizadas para el cultivo de neuronas del hipocampo (Figura 1A, B). Las neuronas se sembraron en el depósito 1. El tamaño de los microcanales impide la difusión de los cuerpos celulares (soma) en el compartimiento axonal, mientras que la longitud de los canales impide proyecciones dendríticas de cruzar todo el camino hasta el compartimiento axonal. Después de ~ 2-3 días en cultivo, las neuronas comienzan a extender sus axones a través de microcanales en el compartimiento axonal (Figura 1B, C). Axones transfectadas que expresan la proteína del prión normal de marcado con la proteína fluorescente amarilla (YFP-PrP C) pueden ser identificados por microscopía de fluorescencia (Figura 1C). La expresión de proteínas marcadas con fluorescencia utilizando plásmido transfección se debe comprobar para la localización subcelular y la función como la sobreexpresión podría introducir artefactos experimentales debido a las conformaciones de proteínas alteradas. Por lo tanto, colocalizatexperimentos de iones debe ser complementado tanto con los estudios de co-precipitación bioquímicas, así como con la tinción de IF para las proteínas expresadas endógenamente. El comportamiento de la YFP-PrP C se utiliza aquí se probó previamente 16. La expresión de YFP-PrP C en células de neuroblastoma transfectadas transitoriamente (N2a) fue baja, lo que sugiere que la transfección transitoria no resulta en niveles altamente sobreexpresados ​​YFP-PrP C 16. Es más, si las células N2a transfectadas con YFP-PrP C utilizando anticuerpos contra PrP C indicó que YFP-PrP C altamente colocalized con PrP C endógena, lo que sugiere que tanto transfectadas y endógeno PrP C se comportaron de manera similar. Para cerciorarse de que la PrP C asociada a motores, se realizaron 16 immunoisolations vesícula.

Para los estudios de mapeo de carga óptimas, el borde derecho de los microcanales se alinea con el campo de visión durante vivo y fija imabio de imagen con el fin de la misma región del axón (indicado por el rectángulo rojo en la Figura 1B, C). Figura 2 y Figura 3 muestran resultados representativos para el análisis de la cartografía de carga de las neuronas transfectadas transitoriamente con YFP-PrP C. Las vesículas que transportan YFP-PrP C se transportan en los axones de mamíferos por los miembros de la familia Kinesin-1 y Dynein cadena pesada 1 (DYNC1H1) 16, por lo tanto, vesículas YFP-PrP C se asignan a la Kinesin-1 subunidad Kinesin Luz Cadena 1 (KLC1) , y para DYNC1H1 motores. YFP-PrP C movimiento de vesículas fue fotografiada y se representó en un quimógrafo (Figura 2A). En kymographs, anterógrada y retrógrada movimiento de YFP-PrP C vesículas está representado por las trayectorias con pendientes negativas y positivas, respectivamente, y las vesículas estacionarias se representan por las trayectorias verticales. En la fijación, todo movimiento dejó indicado por la ausencia de líneas diagonales en el quimógrafo(Figura 2A). La señal de FI de motores moleculares y cargas en los axones, permeabilizadas fijas es puntiforme 16 (Figura 2B, C). El objetivo de "mapeo de carga" es para determinar si puncta en el canal de carga (Figura 2B) colocalize con puncta motor (Figura 2C) en los otros dos canales. Para ello, las imágenes fluorescentes de vesículas YFP-PrP C fijos, y las imágenes si de KLC1 y DYNC1H1 asociado a puntos lagrimales vesicular correspondiente se suman a la quimógrafo (Figura 2B, C). Funciones de Gauss se ajustaron a las funciones de dispersión puntual de fuentes puntuales fluorescentes en los tres canales con el fin de asignar las posiciones XY precisas de motores a las trayectorias de carga obtenidos mediante imágenes en directo (Figura 2D). Endógena expresó motores KLC1 y DYNC1H1 aparecen como tinción puntiforme y colocalized diferencialmente con vesículas YFP-PrP C (Figura 2D). Colocalición se definió por la presencia de YFP-PrP C y puncta motor dentro de una distancia de 300 nm y se cuantifica por el nivel de colocalización de la gaussiana XY coordinar posiciones entre la YFP-PrP C y cada uno de los puntos lagrimales KLC1 y DYNC1H1 (Figura 3A ). Esta distancia fue elegido sobre la base de la óptica, límite de difracción de la luz, y el tamaño físico relevante de las subunidades de carga y del motor. La cantidad relativa de KLC1 y DYNC1H1 asociado con YFP-PrP C vesículas se obtuvo de las amplitudes de Gauss, que representan las intensidades de cada puncta (Figura 3B). Estos datos pueden ser analizados adicionalmente si se desea. Por ejemplo, las intensidades de los motores colocalizing con YFP-PrP C puncta entre el control (de tipo salvaje - WT) neuronas y los que carecen de otros Kinesin-1 subunidades (KIF5C - / - las neuronas en la Figura 3A, KIF5C es un miembro de la Kinesin-1 familia), se puede comparar para determinar si la ausencia de KIF5C interrumpe asociación de KLC1 y / o DYNC1H1 a YFP-PrP C vesículas (KLC1 y DYNC1H1 intensidades se mantuvieron sin cambios en nuestros experimentos 16). Por otra parte, KLC1 y DYNC1H1 intensidades se pueden trazar a escudriñar posibles correlaciones entre cantidades de motor relativos y direccionalidad del movimiento (Figura 3B). Por ejemplo, YFP-PrP C vesículas que se mueven y / o estacionario asociados tanto con KLC1 y / o DYNC1H1 (Figura 3B).

Figura 1
Figura 1. Las neuronas del hipocampo cultivadas en dispositivos de microfluidos. (A) Imagen de un dispositivo de microfluidos. Los contornos de los embalses son visualizados por los tintes rojos y azules. Numeración se refiere al número de depósitos de microfluidos utilizados en todo el protocolo. (B) Diagrama de un dispositivo de microfluidos. Los números corresponden a los depósitos in la que se añaden medios de comunicación y las neuronas. Neuronas transfectadas se muestran en verde. Rectángulo rojo y rojo flechas de puntos indican la región recomendado para imágenes de fluorescencia en vivo y fija. (C) Imagen de dos axones transfectadas con YFP-PrP C crece a través de un único microcanal (un microcanal y el borde del dispositivo se describe por líneas blancas punteadas) . Móviles Individualmente vesículas YFP-PrP C se pueden distinguir como puncta más brillante. La barra de escala es de 10 micras. La figura es una adaptación de:.. Encalada et al 16 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2
Figura 2. "mapeo de carga" para correlacionar el transporte de vesículas YFP-PrP C concantidades relativas de los motores de quinesina y dineína. Ancho-campo imágenes de fluorescencia de movimiento en vivo y de cargas fijas fueron tomadas en un microscopio invertido equipado con una platina motorizada y una cámara CCD y un objetivo de aceite de 100X / 1.4 NA. (A) quimógrafo de YFP C-PrP movimiento de vesículas de los axones que se muestran en la Figura 1C. Movimiento vivo se registró durante un tiempo total de 30 a 60 segundos de exposición a 100 ms (10 Hz). Las células fueron fijadas después de la formación de imágenes el movimiento de carga durante al menos 15 segundos. La línea punteada indica el tiempo de fijación durante la formación de imágenes en directo. Cuadro rojo muestra la región de vesículas resaltados en (B, C) ​​y ampliado en ((D). Las puntas de flecha apuntan a tres vesículas que se muestran en (D) correspondiente a estacionaria (azul), retrógrada (rojo), y anterógrada (verde) trayectorias. B) Imagen de vesículas YFP-PrP C fijos alineados a la quimógrafo correspondiente. Los números indican el envesículas individual YFP-PrP C que fueron asignadas a identificables puntos lagrimales en el quimógrafo. Vesículas anterógrada son verdes, retrógrada son rojos, y los estacionarios son azules. (C) fija si las imágenes de KLC1 y DYNC1H1 puncta correspondiente a la misma región se muestra en (B). Barra de escala (AC) es de 10 m. (D) Ampliación de IF fija señales de cada uno de los tres canales con asignaciones de función gaussiana 2D. Los puntos azules representan locales píxeles maxima intensidad, puntos rojos representan ataques de Gauss, y puntos rosados ​​son la superposición entre los dos. Las puntas de flecha indican ejemplos de vesículas YFP-PrP C se muestran en (A), y su colocalización diferencial con proteínas motoras KLC1 y DYNC1H1. La barra de escala es de 2 micras. La figura es una adaptación de:.. Encalada et al 16 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de l es figura.

Figura 3
Figura 3. Análisis cuantitativos de "asignación de la carga" de YFP-PrP C vesículas. (A) La cuantificación de colocalización entre vesículas YFP-PrP C, KLC1 y DYNC1H1 en WT y neuronas knockout KIF5C (KIF5C - / -). Número total de puntos lagrimales analizado era N WT = 887 y N KIF5C - / -. = 1629 16 Los números dentro de las barras representan el número de vesículas por categoría. Se muestran las medias ± SEM. No paramétrico de permutación de prueba t se utilizó para la comparación entre los genotipos 29. (B) Correlación de la composición de motor relativa y direccionalidad de movimiento en las neuronas WT de datos analizados en (A). La figura es una adaptación de: Encalada et al 16...jove.com / archivos / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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El protocolo que aquí se presenta permite la correlación de direccionalidad del movimiento de las partículas de carga en movimiento basado en microtúbulos fluorescentes individuales con el tipo de relación y la cantidad de proteínas motoras asociadas en las neuronas vivas. Anteriormente, la composición total de cargas del motor axonal vesiculares fue ensayada en poblaciones heterogéneas de vesículas y orgánulos 9,15 bioquímicamente purificados. Sin embargo, la caracterización de la composición de motor para un solo tipo de carga dentro de las células ha sido difícil debido a la dificultad en la purificación de las poblaciones de vesículas homogéneas. Por otra parte, mientras que las mediciones de motor de puesto-fuerzas proporcionaron estimaciones de los números de motor activos en embriones de Drosophila, no estaba claro si la direccionalidad del movimiento correlacionado con motores está unido de forma estable a las cargas o para la rápida asociación / disociación de los motores activos a / de carga 12. Por lo tanto el protocolo de "carga la cartografía" descricama aquí fue desarrollado para investigar más a fondo la correlación entre el tipo y el número relativo de los motores asociados al movimiento individual de carga en las neuronas vivas.

Para recabar datos de "mapeo de carga" que es fundamental para 1) realizar de imágenes de movimiento de carga y las FI fijas con una resolución temporal y espacial alta, 2) asegurar la fijación inmediata de la muestra durante el curso de formación de imágenes, 3) alinear la región de interés en imágenes en directo y fijas y mapa de carga fija y motores para kymographs movimiento de las mismas imágenes, y 4) determinar con precisión las coordenadas XY de carga y puntos lagrimales fluorescente del motor con el fin de determinar la cantidad de colocalización entre las proteínas de carga y del motor.

Mientras que este protocolo es especialmente adecuado para analizar las características de transporte en los axones de las neuronas organizadas uniformemente cultivadas en dispositivos de microfluidos, podría ser adaptado a una amplia gama de preguntas de investigación. Por ejemplo, este Applicación podría ser utilizado para caracterizar la asociación de vesículas con sus adaptadores involucrados en endo / exocitosis (por ejemplo, ensayos de tráfico en los fibroblastos), o el crecimiento de los microtúbulos marcados con las proteínas de microtúbulos + punta de unión. Para estos, dispositivos de microfluidos pueden ser sustituidos por cubreobjetos en rejilla para facilitar la localización de las células fotografiadas necesarios para vivo correlativa y estudios de imágenes fijas. Este protocolo también podría ser utilizado para caracterizar los eventos celulares para los que un parámetro de cambios en el tiempo en función del entorno celular específica. Por ejemplo, la liberación de una proteína viral marcado con fluorescencia a partir de estructuras individuales endosomal en el citoplasma podría estar correlacionada con la expresión y / o la asociación de proteínas endosomal.

Una posible limitación de este protocolo es que la cartografía de cargas de alta densidad puede ser difícil. Sin embargo, la asignación de funciones gaussianas evita este problema en gran medida, al permitirdistinción de posiciones entre puncta fluorescentes a nivel sub-pixel. Además, el mapeo de los motores a las cargas axonales es de bajo rendimiento: Actualmente, la cartografía se puede hacer por los axones 2 por dispositivo de microfluidos, dada la baja tasa de transfección de las neuronas y el campo de visión limitado cuando se utiliza la alta ampliación necesaria para alto resolución de imagen con nuestra cámara. Futuros desarrollos de este método pueden incluir el uso de sistemas de lentivirus para la transducción de las neuronas con mayor eficiencia, el aislamiento de las neuronas de ratones transgénicos que expresan las proteínas etiquetadas con fluorescencia o el etiquetado de los orgánulos con pequeñas colorantes fluorescentes tales como Lysotracker o Mitotracker, todo lo cual aumentará la número de axones marcados con marcadores fluorescentes. Además, el tamaño de la zona de grabado está limitado por el aumento, el tamaño de píxel y el tamaño de la matriz de píxeles de la cámara utilizada para la formación de imágenes. Desarrollos en curso en el campo de las técnicas de imagen permitirán área más grandes para formar una imagen en el futuro y, por lo tanto aumentar la cantidad de datos obtenidos por condición experimental.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
poly-L-lysine Sigma P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) Life Technologies 11965092
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10082147
Neurobasal-A Medium (1x) Life Technologies 10888022
B-27 Serum Free Supplement Life Technologies 10888022
GlutaMAX I Supplement (100x) Life Technologies 35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) Life Technologies 24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) Life Technologies 14190250
Penicillin/Streptomycin (100x) Life Technologies 15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture  Fisher Scientific MT46000CM
Papain USB Corporation 19925
DL-cysteine HCl Sigma-Aldrich C9768
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
D-glucose Sigma-Aldrich G6152
DNAse I grade II Roche Applied Sciences 10104159001
Lipofectamine 2000 Life Technologies  11668027
Formaldehyde Solution 16% EM Grade Fisher Scientific 50980487 Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
Sucrose Fisher Scientific S5-500
HEPES Sigma H-3375
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-0121
BSA fatty acid and IgG free Jackson Immuno Research 001-000-162
Acetone Fisher Scientific BP2403-4
Ethanol Fisher Scientific BP2818-100
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm Corning 2980-244
Axis microfluidic device, 450 µm Millipore AX450
Adobe Photoshop Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U  Nikon
Coolsnap HQ camera  Roper Scientific
60 mm cell culture dish Fisher Scientific 12-565-95
150 mm cell culture dish Fisher Scientific 12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17 Santa Cruz  sc-13362 specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 Santa Cruz  sc-9115 specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody Life Technologies A10042  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies A31573  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody Life Technologies A11057  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody Life Technologies A21447  recommended dilution 1:200.
Plugins and Macros
ImageJ  http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Plugin http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

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References

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La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis "Mapeo de carga"
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Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029, doi:10.3791/52029 (2014).More

Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029, doi:10.3791/52029 (2014).

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