Abstract
Comprendre les mécanismes par lesquels les moteurs moléculaires coordonnent leurs activités pour le transport de cargaisons vésiculaires dans les neurones nécessite l'analyse quantitative des associations moteur / de fret au niveau de la vésicule unique. Le but de ce protocole est d'utiliser la microscopie quantitative de fluorescence à corréler («carte»), la position et la directionnalité du mouvement de fret direct aux montants de composition et relatives des moteurs associés avec la même cargaison. "Cartographie Cargo» se compose de l'imagerie en direct de cargaisons marquées par fluorescence mobiles dans les axones cultivées sur des dispositifs microfluidiques, suivie par la fixation chimique lors de l'enregistrement de mouvement direct, et immunofluorescence ultérieure (IF) des mêmes régions axonales exactes avec des anticorps contre les moteurs. Colocalisation entre cargaisons et leurs moteurs est évaluée en affectant la position sous-pixel de coordonnées de canaux de moteur et de fret, par gaussiennes de montage à la diffraction-lifonctions d'étalement de point mited représentant sources ponctuelles fluorescentes individuelles. Images de fret et moteur fixe sont ensuite superposées à des parcelles de mouvement de la cargaison, à la «carte» à leurs trajectoires suivies. La force de ce protocole est la combinaison de vivre et si les données à enregistrer à la fois le transport de cargaisons vésiculaires dans des cellules vivantes et de déterminer les moteurs associés à ces mêmes vésicules exactes. Cette technique permet de surmonter les problèmes antérieurs qui utilisent des méthodes biochimiques pour déterminer la composition moyenne du moteur de populations purifiées de vésicules en vrac hétérogènes, car ces méthodes ne révèlent pas des compositions sur des cargaisons de mobiles simples. Par ailleurs, ce protocole peut être adapté à l'analyse d'autres voies de transport et / ou de traite dans d'autres types de cellules à mettre en corrélation le mouvement des structures intracellulaires individuels avec leur composition en protéines. Limitations de ce protocole sont le débit relativement faible en raison des faibles efficacités de transfection de cultureneurones primaires et un champ de vision limité disponible pour l'imagerie haute résolution. Les applications futures pourraient inclure des méthodes pour augmenter le nombre de neurones exprimant cargaisons marquées par fluorescence.
Introduction
Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines 1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines - deux grandes familles de protéines motrices moléculaires - qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérograde et rétrograde directions, respectivement. Alors que le mouvement rétrograde est principalement médiée par la dynéine, le mouvement dans le sens antérograde est facilitée par une grande famille, la diversité fonctionnelle de moteurs de kinésine. Par conséquent, le transport antérograde des cargaisons axonales pourrait être médiée par divers membres de la famille de la superfamille kinésine 1-5. Bien que certaines cargaisons se déplacent constamment dans les deux sens, ma plupart des cargaisons se déplacent de manière bidirectionnelle et inversent souvent sur leur chemin vers leurs destinations finales 1,5-13. En outre, il a été démontré que les moteurs d'opposition à directivité associé simultanément à cargaisons, ce qui soulève la question de savoir comment le mouvement réglementé de cargaisons est coordonné par des moteurs de polarité opposée 5-7. Ensemble, le transport de cargaisons axonales est un processus concerté qui est réglementée par la composition de moteurs et de leurs activités biochimiques spécifiques, qui sont à leur tour dépendent de divers adaptateurs et partenaires de liaison de réglementation 14.
Pour décrire fidèlement le mécanisme de transport axonal pour une marchandise spécifique et à découvrir la réglementation sous-jacente de ce transport, il est primordial de déterminer la composition des protéines de moteur et de leurs partenaires de liaison réglementaires inhérents aux cargaisons individuelles lors de leur transport direct. D'autres méthodes, par exemple des approches biochimiques, fournissent des estimations de mot moyenneou compositions sur les populations de vésicules hétérogènes purifiés, mais ces estimations ne révèlent pas le type ou la quantité de moteurs associés à des vésicules mobiles simples. En outre, la reconstitution de transport le long des microtubules vésicule préassemblés in vitro a permis de mesurer la quantité d'un type de moteur à un niveau de 15 vésicule unique. Toutefois, ces expériences ne sont pas corrélés directement la quantité de moteurs avec des caractéristiques de transport de ces vésicules, et le transport mesurées en l'absence de facteurs de régulation cellulaire.
Un protocole est présentée ici, qui détermine la composition de moteur (type et la quantité relative des moteurs) de vésicules mobiles individuels à partir d'immunofluorescence (IF) des données de mesure de manière endogène exprimé protéines motrices, et en corrélation de ces paramètres pour le transport direct des mêmes vésicules exactes dans les neurones 16. Cette méthode implique une cartographie précise des données SI-à-vivre mouvement de la cargaison. Ceci est accompli en growing neurones de l'hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques qui suit les protocoles établis, 17-19. Ces dispositifs permettent l'identification et la corrélation ("mapping") des axones et des cargaisons mobiles simples dans les modalités fixes et vivantes microscopie de lumière (Figure 1). Des neurones en culture sont transfectées avec des protéines par fluorescence de fret marqués dont le transport est imagée à une résolution spatiale et temporelle pour obtenir des informations détaillées mouvement qui est tracée dans kymographs. Au cours de l'imagerie, les neurones sont fixées avec du paraformaldéhyde, et ensuite colorées avec des anticorps dirigés contre des protéines endogènes à moteur. Images de fret et moteurs fixes sont superposées sur kymographs de déplacement en live à la «carte» (colocalisent) les à la cargaison vivante mouvement trajectoires 16. Pour corréler le mouvement des cargaisons en direct avec l'association de protéines motrices, colocalisation est analysée en utilisant un logiciel MATLAB sur mesure appelé «MoTor colocalisation "16,20. Cargaisons et les moteurs marqués par fluorescence génèrent caractéristiques ponctuées limitée par la diffraction qui peuvent se chevaucher partiellement. Pour résoudre la position de chevauchement points lacrymaux, le logiciel adapte automatiquement la première gaussiennes pour chaque fonction d'étalement de point, représentant puncta fluorescent individu, afin de déterminer leur position précise sous-pixel de coordonnées XY et l'intensité des amplitudes de 21-23. Les positions des moteurs et des cargaisons par la suite par rapport à l'autre afin de déterminer la colocalisation 16,20. Par conséquent, cette méthode attribue plus précisément entre les points lacrymaux colocalisation fluorescente par rapport à d'autres méthodes 24.
La force de cette méthode est la capacité d'évaluer la colocalisation des moteurs à cargaison individuelle dans des cellules fixées, pour qui les trajectoires de mouvement vivants (par exemple, la direction dans laquelle ils se déplaçaient au moment de la fixation) ont été recorded. Avec cette méthode, les kinésines et dynéines ont été trouvés à la fois pour associer les vésicules qui transportent la protéine prion normale (PrPc -cellular), une cargaison enrichi neuronale qui se déplace de façon bidirectionnelle ou reste stationnaire dans les axones 16. Cette analyse a permis l'élaboration d'un modèle de travail pour la réglementation de la PrP C mouvement des vésicules dans lequel antérograde (kinésine) et (dynéine) moteurs rétrogrades coordonnent leurs activités afin de passer les vésicules dans les deux sens ou rester stationnaire pendant associée à la cargaison . Un autre point fort de cette méthode est son large potentiel d'application pour la caractérisation de colocalisation / association de nombreuses marchandises marquées par fluorescence qui se déplacent dans pratiquement n'importe quel type de cellule, avec toute autre protéine (s) d'intérêt. Ainsi, la corrélation en temps réel / fixe pourrait potentiellement permettre la détection d'interactions protéine-cargo transitoires, comme beaucoup individu marqué par fluorescence des particules en mouvement peut être analysé sur une p désiréeériode de temps. Compte tenu de la large applicabilité et le type de questions que cette méthode peut résoudre, ce protocole sera d'intérêt pour un large public de biologistes cellulaires, y compris ceux qui étudient le trafic et le transport dans les neurones ou dans d'autres types de cellules.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées selon des protocoles approuvés et selon les directives institutionnelles pour les soins sans cruauté des animaux de recherche. Souris nouveau-nés ont été euthanasiés par décapitation.
1. Préparation de dispositifs microfluidiques pour la culture cellulaire
- Préparer polydiméthylsiloxane (PDMS) des dispositifs microfluidiques pour la croissance des neurones de l'hippocampe comme décrit par Harris et ses collègues 17-19. Voici quelques modifications qui ont été adaptés au protocole de mise en correspondance de la cargaison.
REMARQUE: Les dispositifs microfluidiques sont également disponibles dans le commerce (Liste des produits), ainsi accès à un centre de fabrication est pas nécessaire. - Préparation n ° 1 ½ couverture lunettes (24 x 40 mm) en les lavant trois fois avec de l'acétone, suivi par trois lavages avec 100% d'éthanol et trois lavages à l'eau. des lamelles de magasins dans l'eau à 4 ° C jusqu'à utilisation. Ces traitements permettent de garantir que les lamelles sont propres de débris qui pourraient interférer avec placage de cells, la contamination et la survie.
REMARQUE: L'acétone et l'éthanol sont inflammables et dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant), d'ingestion, d'inhalation. Eliminer conformément aux prescriptions légales. - Lorsque vous êtes prêt à utiliser, placez un couvercle en verre dans une boîte de 60 mm de culture cellulaire par dispositif microfluidique, et laisser sécher à l'air à découvert pendant 45 min dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination.
- Après dispositifs sont découpées dans les maîtres et coups de poing ont été coupés pour créer des réservoirs (figure 1A, B), placez-les avec le côté des canaux microfluidiques-up à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique équipé d'une lampe UV pendant 45 min pour la stérilisation.
REMARQUE: Les périphériques sous traitement UV Laissant pendant plus de 2 heures pourrait affecter l'intégrité du PDMS. - Assembler les appareils en plaçant un dispositif sur chaque couvercle en verre à l'intérieur du boîte de 60 mm de culture de cellules en plastique de sorte que les canaux microfluidiques face vers le bas. Appliquez une légère pression sur le joint hautf le dispositif (éviter de toucher les microcanaux) pour assurer une étanchéité non-permanent du dispositif de la lamelle. Couvrir chaque boîte de culture cellulaire de 60 mm avec un couvercle.
- Avec une micropipette, hydrater les dispositifs en ajoutant culture cellulaire eau de qualité pour les deux premiers réservoirs microfluidiques (1 et 2 de la figure 1A), permettant à l'eau de circuler à travers. Enlever l'eau avec une micropipette et ajouter 1 mg / ml de poly-L-lysine dans le réservoir 1 microfluidique (200 ul) et 2 (100 pi). La différence de volume pour permettre la poly-L-lysine à circuler à travers les micro-canaux (Figure 1A, B).
- Pour veiller à ce que les dispositifs à l'intérieur des boîtes de 60 mm de culture cellulaire ne basculent dans un incubateur à 37 °, placez trois boîtes de culture cellulaire de 60 mm contenant les dispositifs dans une boîte de culture de cellules de plastique de 150 mm et couvrir le plat avec un couvercle. Incuber O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Généralement plus de 90% des chaînes sont utilisables par appareil et fairepas contenir de bulles d'air ou de blocage physique.
- Le jour suivant, remplacer la poly-L-lysine avec de l'eau et laisser dispositif dans l'incubateur pendant au moins une heure. Répéter ce lavage trois fois. Retirer de l'eau et ajouter Neurobasal-un milieu de croissance (contenant 2% de B-27 supplément et 500 um GlutaMAX) pour chaque appareil. Laisser O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Le jour suivant, la plaque de cellules de l'hippocampe, comme décrit ci-dessous.
2. Dépôt de neurones de l'hippocampe de souris primaire en dispositifs microfluidiques
NOTE: La préparation des neurones de l'hippocampe de rats nouveau-nés en culture a été précédemment publié dans JoVE 25. Voici quelques modifications qui ont été adaptés aux neurones d'hippocampe de souris plaque dans des dispositifs microfluidiques, et qui étaient optimales pour les transfections.
- Avant souris dissection du cerveau, du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant du sérum pré-chaud de 10% de veau fœtal(FBS; sans antibiotiques), le mélange A (125 mg de DL-cystéine, 125 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) et de 3,125 g de D-glucose dans 500 ml de tampon phosphate salin (PBS); stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um) et la désoxyribonucléase I solution (DNase I: 50 mg de DNase I et 0,5 ml d'une 4 solution 1,2 M de sulfate de magnésium dans 100 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um) dans un bain d'eau à 37 °.
- Neurobasal-A milieu de pré-croissance chaud à l'intérieur d'un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 pour équilibrer le pH.
- Disséquer hippocampes de souris âgées de nouveau-né 1-3 jours selon les protocoles établis 26. Conserver hippocampes dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissection (HBSS contenant 10 mM d'HEPES pH 7,4, 50 mM de glucose, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine), sur de la glace. Mettre en place à 4 hippocampes par tube de 15 ml conique.
- Effectuer le protocole reste est dans des conditions stériless à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique.
- Diluer 45 unités de papaïne dans 5 ml de mélange A, vortex et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C jusqu'à ce que la poudre de la papaïne est dissous. Ajouter 1 ml de solution de DNase I. Filtrer le mélange à travers une unité de filtre à seringue de 0,22 um.
- Soigneusement aspirer HBSS »de 15 ml tube conique contenant hippocampes. Ajouter 10 ml froid (4 ° C) HBSS à hippocampes et laissez-les se déposent au fond du tube. Aspirer soigneusement HBSS de 15 ml tube conique.
- Ajouter 1 ml de la papaïne / DNase je mélange à jusqu'à 4 hippocampes et incuber pendant 20-30 min à 37 ° C. Inclinez tube conique toutes les 5 minutes pour se baigner hippocampes avec le mélange. Vous pouvez également placer des hippocampes dans un shaker C l'eau de bain à 37 ° avec agitation douce (~ 100 rpm).
- Aspirer la papaïne / DNase je mélange et laver deux fois avec du DMEM hippocampes préchauffé (37 ° C) contenant 10% de FBS.
- Après second lavage, ajouter 2 ml de pré-chauffé DMEM contenant 10% de FBS à hippocampes et hippocampes triturer manuellement par pipetagede haut en bas ~ 10-12 fois à l'aide d'une pipette de 1 ml de dissocier les neurones.
- Laissez triturer contenter de ~ 1 min ce qui permettra neurones non dissociés de se déposer au fond du tube conique. Transférer le surnageant contenant les neurones dissociés à un nouveau tube de 15 ml conique en évitant tout transfert de plus grand tissu qui est installé au fond du tube.
- Spin cellules à 1000 g pendant 2 min et retirez soigneusement surnageant sans déranger le culot cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 80 ul Neurobasal-A du milieu de croissance par un léger pipetage.
- Éliminer le milieu de réservoir microfluidique 1 et 1 '. Appliquer 20 pi de cellules (~ 275 000) à réservoir microfluidique 1, et de leur permettre de circuler à travers. Placez dispositif dans 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pendant 20 min.
- Regardez sous microscope pour s'assurer que les cellules ont adhéré à la lamelle. Ajouter Neurobasal-un milieu de croissance pour couronner tous les réservoirs. Un dispositif de rappel avec des cellules à un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO
- Vérifier les dispositifs de chaque évaporation ~ 2-3 jours et couronner les réservoirs avec Neurobasal-A contenant 2% de B-27 supplément (sans GlutaMAX) à éviter. Les neurones commencent à étendre leurs axones à travers des canaux microfluidiques ~ 2-3 jours après placage. Sous réserve de neurones transfection généralement 7-10 jours après placage.
3. La transfection de neurones de l'hippocampe Cultivé en dispositif microfluidique
- Par dispositif, préparer un mélange de 1,2 ul de Lipofectamine 2000 dans 30 ul Neurobasal-A, et un mélange de 0,5 ug fluorescent fusion de chargement plasmide dans 30 ul Neurobasal-A et incuber 5 minutes à température ambiante. Ajouter Lipofectamine mélange de l'ADN mélange et incuber pendant 20 min à température ambiante. Ajouter 60 ul de Neurobasal-A contenant 4% de B-27 supplément à l'ADN / Lipofectamine et mélanger à en tapotant le tube.
- Retirez tous les supports du réservoir microfluidique 2 et 2 'et remplissez soigneusement des puits avec Neurobasal-A contenant 2% de B-27 supplément sans déborder du milieu into les autres compartiments.
- Retirez le support du réservoir microfluidique 1 et 1 '. Ajouter 120 ul d'ADN / Lipofectamine mélanger à réservoir microfluidique 1 et laisser couler. Dispositif revenir à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pour 3-4 heures.
- Retirez tous les supports du réservoir microfluidique 1 et 1 'et le remplacer par Neurobasal-A 2% de B-27 supplément contenant pendant 24 heures (ou jusqu'au moment de l'image). Typiquement, 5-7 axones qui poussent à travers des microcanaux sont transfectées dans ces conditions, qui représentent environ 1-3% d'efficacité de transfection compatible avec l'efficacité publiées pour des cellules en culture de l'hippocampe 26.
4. Analyses "Cargo cartographie"
- Imagerie en temps réel des mouvements de marchandises
- Effectuer l'imagerie sur un microscope à lumière inversé à épifluorescence équipé d'un incubateur à 37 ° C et une chambre de commande de CO 2.
- Montez la lamelle avec des neurones d'hippocampe cultivées dans un MICRdispositif ofluidic sur la platine du microscope. Pour éviter la mort neuronale, travailler avec diligence pour maintenir les échantillons à la loupe pour plus de 1 h.
- L'utilisation d'un objectif à haute résolution (100X), trouver des axones des cellules transfectées qui se prolongent par des voies de chambres microfluidiques et enregistrent le nombre de canaux dans laquelle l'axone transfectées a été trouvé. Comptez le nombre de canaux à l'aide d'un compteur de pointage de la main.
- Pour l'enregistrement de mouvement optimale en direct et l'analyse de colocalisation ultérieure, choisir axones qui poussent relativement plat à travers les canaux de sorte que l'imagerie de la plupart des vésicules peut être effectuée au point.
- Éliminer la majeure partie du milieu de réservoirs 2 et 2 'avec un 1 ml de transfert pipette en plastique. Pour faciliter l'alignement ultérieur des images fixes avec des trajectoires de mouvement sur kymographs, alignez le bord droit de microcanaux avec le champ de vision lors de l'imagerie (figure 1B, C).
- Pour faciliter Fixing des échantillons lors de l'imagerie, effectuer l'imagerie en direct avec deux personnes. Par ailleurs, si l'imagerie en direct est effectuée par une seule personne, utiliser un système de microscope équipé d'une correction de la dérive.
- Lancer imagerie mouvement de fret direct avec les spécifications time-lapse spécifiques à la dynamique de transport de la cargaison en cours d'analyse (spécifications de microscope et les paramètres pour l'imagerie YFP-PrP C sont spécifiés dans la légende de la figure 2 et Matériaux liste).
- Une fois les données de mouvement en direct suffisantes ont été recueillies, avoir une personne remplir les réservoirs 2 et 2 'avec du paraformaldéhyde préchauffé 4% dans du PBS contenant 0,04 g / ml de saccharose à fixer les cellules. Évitez de toucher le dispositif microfluidique, car cela perturber la mise au point de l'imagerie en temps réel. Demandez à l'autre personne de l'ajuster en le fixateur est ajouté. La fixation est réussie lorsque l'arrêt immédiat du mouvement est observé. Ajouter fixateur au réservoir 1 et 1 'par la suite.
REMARQUE: photoblea temporaireching de la fluorescence de la cargaison pourrait également être observée, mais la fluorescence persiste après l'IF pour des protéines motrices est terminée (étape suivante).
REMARQUE: Paraformaldéhyde est nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau. Eliminer conformément aux prescriptions légales.
- SI coloration de protéines motrices pour l'analyse de colocalisation
Remarque: Pour la quantification des niveaux relatifs des protéines motrices (tel que déterminé par coloration d'anticorps), associés à des cargaisons mobiles individuels, valider et titrer les anticorps de sorte que la liaison anticorps-antigène est saturé. Cela se fait par la détermination de la spécificité de l'anticorps en utilisant des neurones dans lequel la protéine d'intérêt a été soit mis hors de combat ou assommé, et en effectuant une analyse SI avec l'augmentation des concentrations d'anticorps. Pour les contrôles négatifs, les neurones sont colorés avec des anticorps secondaires, en l'absence d'anticorps primaires. Plus détailléeDescription de validation d'anticorps peut être trouvé dans Encalada et al. 16, et Szpankowski et al., 20.- Enlever les lamelles de neurones hippocampiques cultivées en dispositif microfluidique à partir de la platine du microscope. Ne débranchez pas le dispositif microfluidique de la lamelle, comme les microcanaux doivent rester intacts pour superposer les images en direct et fixes. Effectuez les étapes suivantes dans une chambre humide.
- Pour assurer la circulation des solutions dans les micro-canaux, de maintenir un différentiel de volume tampon entre les réservoirs 1, 1 'et 2, 2' d'au moins 30 pi. dans toutes les étapes ultérieures. Par exemple, ajouter le volume de 100 ul à des médias réservoir microfluidique 2, 2 ', et le volume de 70 ul de milieux de réservoir microfluidique 1, 1'.
- Retirer fixateur de chambres du dispositif microfluidique et laver les cellules trois fois avec du PBS 10 min d'attente entre les lavages.
- Perméabiliser les cellules par addition de 0,1% de Triton X-100 diluted dans du PBS pendant 5 min à tous les réservoirs.
- Retirer solution de tous les réservoirs et laver avec du PBS. Répétez laver trois fois 10 min d'attente entre les lavages.
- Retirer solution de tous les réservoirs et appliquer un tampon de blocage contenant 10% de sérum normal âne et 3% de protéase libre et l'immunoglobuline G (IgG) exempt de BSA dans PBS et incuber pendant au moins 30 min à température ambiante.
- Spin solution anticorps boursier primaire à 20 000 g pendant 5 min pour éliminer les précipités. Diluer l'anticorps à une concentration appropriée dans du tampon de blocage. Remplacer le tampon de blocage de dispositif microfluidique avec une solution d'anticorps. Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
- Retirer solution de tous les réservoirs et laver trois fois avec du PBS, 10 min d'attente entre les lavages.
- Spin solution anticorps secondaire de l'action à 20 000 g pendant 5 min pour éliminer les précipités. Diluer l'anticorps à une concentration appropriée dans du tampon de blocage. Remplacer PBS avec une solution d'anticorps secondaire. Incuberles échantillons pendant 1 heure à température ambiante.
- Retirer solution de tous les réservoirs et laver trois fois avec du PBS, 10 min d'attente entre les lavages.
- Remplacer PBS avec ~ 10-20 ul de milieu de montage à la pipette directement milieu de montage dans l'ouverture des canaux reliant les réservoirs. Laisser sécher de milieu de montage pour ~ 20 min - 1 heure à température ambiante.
- dispositifs de conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière pour éviter photoblanchiment, et les axones d'image dans les deux jours (maximum une semaine) de coloration.
- Après coloration est terminée, avec lamelle neurones de l'hippocampe cultivées dans le dispositif microfluidique sur la platine du microscope monter. Localisez la région de l'axone transfectées imagé à l'étape 4.1.1-4.1.7.
- Acquérir des images Z-stack (300 marches nm) pour chacun des trois canaux: le fret, moteur 1, moteur 2, en utilisant un objectif à haute résolution (par exemple, un objectif de l'huile ou de l'eau d'ouverture numérique élevée).
REMARQUE: Acquisition de Z-piles est important que les axones souvent ne poussent pas parfaitement platdans des microcanaux, et donc pas tous points lacrymaux fluorescent sont dans le même plan focal.
- Cartographie de marchandises
- Générer un kymographe de mouvement de marchandises en utilisant un logiciel d'analyse d'images. Le plugin ImageJ développé par Rietdorf et Seitz (EMBL) est recommandé pour générer kymographs (à télécharger voir Liste des matériaux).
REMARQUE: ImageJ est un domaine public, basé sur Java programme de traitement d'image développé à l'Institut National de la Santé 27,28 (à télécharger voir la liste des matériaux). - Aligner les images fixes de la cargaison fluorescent (généré à l'étape 04/02/14) manuellement en les superposant sur la position des trajectoires de la kymographe au niveau du point de fixation (figure 2A, B), en utilisant un programme de logiciel disponible dans le commerce (graphiquement Matériaux Liste). Aligner manuellement par superposition de l'image fixe d'abord de la cargaison sur le kymographe et en choisissant manuellement les points lacrymaux de chargement qui correspond à une trajectoire spécifique surla kymographe. Pour obtenir les meilleurs résultats de l'alignement, utiliser la tranche de Z qui est en meilleure mise au point de la cargaison mappé. Plusieurs tranches de Z peuvent être utilisés.
- Pour chaque image de la Z-stack (fret, moteur 1 et moteur 2; généré à l'étape 4.2.14) déterminer la coordonnées XY et amplitudes d'intensité pour chaque puncta fluorescent à l'aide d'un algorithme mis en place pour adapter 2D gaussiennes à la fonction d'étalement de point qui représente chaque source ponctuelle dans chacun des trois canaux 16,20,21 (figure 2D).
REMARQUE: Pour obtenir le coordonnées XY, un logiciel MATLAB construit personnalisé appelé "moteur colocalisation» a été développé 16,20, qui intègre un algorithme d'ajustement gaussien développé par Jaqaman, Danuser et collègues 21-23. Le logiciel et des instructions détaillées pour l'utilisation peuvent être obtenues sur demande. - Pour chacun des points lacrymaux de marchandises qui ont été individuellement mis en correspondance avec les trajectoires mobiles ou fixes sur le kymographe, sélectionnez til coordonnées XY et amplitudes d'intensité à partir des résultats du programme «Motor colocalisation" (ces cargaisons sont étiquetés individuellement à la figure 2B). Utilisez plusieurs images Z-stack acquis à l'étape 4.2.14) pour cartographier plusieurs cargaisons qui se trouvent sur différents plans focaux.
- Comparer les coordonnées XY de l'individu pour le fret mis en correspondance avec celles obtenues pour chacun des canaux à moteur dans la tranche de Z correspondant (figure 2D). Déterminer et sélectionner les coordonnées de moteur XY qui sont dans un rayon de 300 nm de la cargaison. Pour les cargaisons et les moteurs qui ont signal dans le même plan focal, utiliser le logiciel "Moteur colocalisation" afin de déterminer les points lacrymaux qui sont situés dans un rayon de 300 nm.
- Générer un kymographe de mouvement de marchandises en utilisant un logiciel d'analyse d'images. Le plugin ImageJ développé par Rietdorf et Seitz (EMBL) est recommandé pour générer kymographs (à télécharger voir Liste des matériaux).
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Representative Results
La figure 1 montre une vue d'ensemble du dispositif microfluidique utilisé pour la culture des neurones de l'hippocampe (figure 1A, B). Les neurones sont étalées dans le réservoir 1. La taille des micro-canaux empêche la diffusion de corps cellulaires (soma) dans le compartiment axonal tandis que la longueur des canaux d'éviter les projections dendritiques de traverser tout le chemin vers le compartiment axonal. Après ~ 2-3 jours de culture, les neurones commencent à étendre leurs axones dans des microcanaux dans le compartiment axonal (figure 1B, C). Axones transfectées exprimant la protéine prion normale marqué par la protéine fluorescente jaune (YFP-PrP C) peuvent être identifiés par microscopie à fluorescence (figure 1C). L'expression des protéines marquées par fluorescence à l'aide de transfection plasmidique doit être vérifiée pour la localisation subcellulaire et la fonction que la surexpression pourrait introduire des artefacts expérimentaux en raison de conformations de protéines altérées. Ainsi, colocalizatdes expériences d'ions doit être à la fois avec complimenté études biochimiques co-précipitation, ainsi que pour la coloration avec SI protéines exprimées de manière endogène. Le comportement de la YFP-PrP C utilisée ici a été testé précédemment 16. L'expression de la YFP-PrP C dans des cellules de neuroblastome transfectées de manière transitoire (N2a) est faible, ce qui suggère que la transfection transitoire ne se traduit pas par des niveaux YFP-PrP C hautement surexprimés 16. En outre, si des cellules transfectées avec N2a YFP-PrP C en utilisant des anticorps dirigés contre la PrP C a indiqué que YFP-PrP C très colocalisé avec endogène PrP C, ce qui suggère que les deux transfectées et endogène PrP C montré un comportement similaire. Pour vérifier que la PrP C associée à des moteurs, immunoisolations vésicules ont été effectuées 16.
Pour optimales études de cartographie de la cargaison, le bord droit de microcanaux est aligné avec le champ de vision direct pendant et fixe imager pour l'image de la même région de l'axone (indiquée par un rectangle rouge sur la figure 1B, C). La figure 2 et la figure 3 montrent les résultats représentatifs pour le chargement des analyses de cartographie des neurones transfectées de manière transitoire avec la YFP-PrP C. Vésicules transportant YFP-PrP C sont transportés dans les axones de mammifères par les membres de la famille kinésine-1 et Dynein chaîne lourde 1 (DYNC1H1) 16, donc vésicules YFP-PrP C ont été cartographiés à la kinésine-1 sous-unité Kinésine chaîne légère 1 (KLC1) et à DYNC1H1 moteurs. YFP-PrP C mouvement des vésicules a été imagée et tracée dans un kymographe (figure 2A). Dans kymographs, antérograde et rétrograde mouvement de la YFP-PrP C vésicules est représenté par des trajectoires à pentes, respectivement négatives et positives, et les vésicules fixes sont représentés par des trajectoires verticales. Au fixation, tout mouvement a cessé indiqué par l'absence de lignes diagonales dans le kymographe(Figure 2A). Le signal IF de moteurs moléculaires et des cargaisons dans les axones, perméabilisées fixes est ponctuée 16 (figure 2B, C). L'objectif de «cartographie de fret" est de déterminer si lacrymaux dans le canal de chargement (figure 2B) colocalisent avec puncta du moteur (figure 2C) dans les deux autres canaux. Pour ce faire, des images fluorescentes de vésicules YFP-PrP C fixes, et les images si de KLC1 et DYNC1H1 associé à puncta vésiculaire correspondant ont été alignés sur le kymographe (Figure 2B, C). Gaussiennes ont été ajustées aux fonctions d'étalement de point de sources ponctuelles fluorescentes dans les trois canaux afin de cartographier les positions XY précis des moteurs à des trajectoires de fret obtenus par imagerie en temps réel (figure 2D). Exprimé de manière endogène KLC1 et DYNC1H1 moteurs apparaissent comme coloration ponctuée et colocalisés différemment avec des vésicules YFP-PrP C (figure 2D). Colocalisation a été définie par la présence de la PrP C-YFP et puncta moteur à une distance de 300 nm et quantifié par le niveau de co-localisation de la gaussienne de coordonnées XY des positions entre la YFP-PrP C et chacun des points lacrymaux et KLC1 DYNC1H1 (Figure 3A ). Cette distance a été choisie en fonction de l'optique, la limite de diffraction de la lumière, et la taille physique pertinentes des marchandises et moteur sous-unités. La quantité relative de KLC1 DYNC1H1 et associé avec la YFP-PrP C vésicules a été obtenu à partir des amplitudes de Gauss, qui représentent les intensités de chaque puncta (figure 3B). Ces données peuvent être analysées comme vous le souhaitez. Par exemple, l'intensité de moteurs colocalisent avec la YFP-PrP C puncta entre le contrôle (de type sauvage-- WT) neurones et ceux qui manquent d'autres Kinésine-1 sous-unités (KIF5C - / - neurones dans la figure 3A, KIF5C est un membre de la kinésine-1 famille), peuvent être comparés afin de déterminer si l'absence de KIF5C perturbe association de KLC1 et / ou DYNC1H1 à YFP-PrP C vésicules (KLC1 et DYNC1H1 intensités sont restés inchangés dans nos expériences 16). En outre, KLC1 et DYNC1H1 intensités peuvent être tracées à examiner les corrélations possibles entre les montants de moteur par rapport directivité et de mouvement (figure 3B). Par exemple, YFP-PrP C vésicules qui se déplacent et / ou fixes associés à la fois KLC1 et / ou DYNC1H1 (figure 3B).
Figure 1. neurones d'hippocampe en culture dans des dispositifs microfluidiques. (A) Image d'un dispositif microfluidique. Les contours des réservoirs sont visualisés par des colorants rouges et bleus. La numérotation se rapporte au nombre de réservoirs fluidiques utilisées dans le protocole. (B) Schéma d'un dispositif microfluidique. Les chiffres correspondent aux réservoirs in qui sont ajoutés médias et les neurones. Neurones transfectées sont indiquées en vert. Rectangle rouge et rouge flèches en pointillés indiquent la région recommandé pour l'imagerie en direct et fixe fluorescence. (C) Image de deux axones transfectées avec la YFP-PrP C de plus en plus par un seul micro-canal (un micro-canal et le bord du dispositif est décrit par des lignes blanches pointillées) . Déplacer individuellement vésicules YFP-PrP C peuvent être distingués comme puncta lumineux. La barre d'échelle est de 10 um. Figure adaptée de:.. Encalada et al 16 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. "de la cartographie de Cargo" de corréler YFP-PrP C le transport vésiculaire avecquantités relatives de kinésine et la dynéine moteurs. grand champ des images de fluorescence de mouvement en direct et des charges fixes ont été prises sur un microscope inversé équipé d'une platine motorisée et une caméra CCD et un objectif de 100 X / 1.4 NA. (A) kymographe de YFP -PrP C mouvement des vésicules des axones illustrés à la figure 1C. Mouvement a été enregistré en direct pour une durée totale allant de 30 à 60 secondes à 100 ms exposition (10 Hz). Les cellules ont été fixées après imagerie mouvement de la cargaison pendant au moins 15 secondes. La ligne pointillée indique le temps de fixation lors de l'imagerie en direct. Boîte rouge indique région de vésicules mis en évidence dans (B, C) et agrandie en (D). Pointes de flèches pointent du doigt trois vésicules présentés dans (D) correspondant à l'arrêt (bleu), rétrograde (rouge), et antérograde (vert) des trajectoires. ( B) Image de vésicules fixes YFP-PrP C alignés à la kymographe correspondant. Les nombres indiquent dans leindividu YFP-PrP C vésicules qui ont été mappés identifiables puncta sur la kymographe. Vésicules antérograde sont vertes, rétrograde sont rouges, et les fixes sont bleu. (C) fixe si les images de KLC1 et DYNC1H1 puncta correspondant à la même région montré en (B). La barre d'échelle (AC) est de 10 um. (D) L'élargissement de fixe, si les signaux de chacun des trois canaux 2D missions de la fonction gaussienne. Les points bleus représentent locales maxima d'intensité de pixels, les points rouges représentent des crises de Gauss, et points roses sont le chevauchement entre les deux. Les têtes de flèches indiquent les exemples des YFP-PrP C vésicules indiquées en (A), et leur co-localisation différentielle avec des protéines motrices et KLC1 DYNC1H1. La barre d'échelle est de 2 um. Figure adaptée de:.. Encalada et al 16 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de e est la figure.
Figure 3. Les analyses quantitatives de "cartographie de la cargaison" de la YFP-PrP C vésicules. (A) Quantification de colocalisation entre YFP-PrP C vésicules, KLC1 et DYNC1H1 dans le document WT et les neurones KIF5C huitièmes de finale (de KIF5C - / -). Nombre total de points lacrymaux analysé était N = 887 WT et N KIF5C - / -. = 1,629 16 chiffres à l'intérieur des barres représentent le nombre de vésicules par catégorie. Présentés sont des moyennes ± SEM. Non-paramétrique permutation test t a été utilisé pour la comparaison entre les génotypes 29. (B) Corrélation de composition et de moteur par rapport au mouvement directionnel des neurones de WT données analysées dans (A). Figure adaptée de: Encalada et al 16...jove.com / files / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici permet la corrélation de la directionnalité du mouvement des particules fluorescentes individuelles en mouvement sur la base de cargaison microtubules avec le type et la quantité de protéines motrices associées par rapport à des neurones vivants. Auparavant, la composition totale du moteur de cargaisons vésiculaires axonales a été dosée sur des populations hétérogènes de vésicules et des organites 9,15 biochimiquement purifiée. Cependant, la composition de moteur pour la caractérisation d'un seul type de cargaison à l'intérieur de cellules a été difficile en raison de la difficulté de purification de populations homogènes de vésicules. En outre, alors que les mesures de calage du moteur-forces ont fourni des estimations du nombre de moteurs actifs dans des embryons de drosophile, il était difficile de savoir si la directionnalité du mouvement corrélé à moteurs étant lié de façon stable aux cargaisons ou à la rapide association / dissociation des moteurs actifs à / de fret 12. Par conséquent, le protocole «cargaison cartographie" décrilit ici a été développé pour étudier plus avant la corrélation entre le type et le nombre relatif des moteurs associés à déplacer individuellement cargaison dans les neurones vivants.
Pour obtenir des données avec succès de "cartographie de la cargaison" il est essentiel de 1) réaliser une imagerie des mouvements de marchandises et FI fixes à une résolution spatiale et temporelle, 2) assurer la fixation immédiate de l'échantillon au cours de l'imagerie, 3) aligner la région d'intérêt dans les images en direct et fixes et la carte cargaison fixe et moteurs à kymographs de mouvement pour les mêmes images, et 4) de déterminer précisément les coordonnées XY de la cargaison et le moteur puncta fluorescent afin de déterminer le montant de colocalisation entre protéines cargos et moteur.
Bien que ce protocole est particulièrement bien adapté pour analyser les caractéristiques de transport dans les axones des neurones organisés régulièrement cultivés dans des dispositifs microfluidiques, il pourrait être adapté à un large éventail de questions de recherche. Par exemple, cette application pourrait être utilisée pour caractériser association de vésicules avec leurs adaptateurs impliqués dans endo / exocytose (par exemple, les analyses de trafic dans les fibroblastes), ou la croissance des microtubules marqués avec des protéines de liaison aux microtubules + pourboire. Pour ceux-ci, des dispositifs microfluidiques peuvent être substitués par des lamelles maillées pour faciliter la localisation des cellules imagées nécessaires pour vivre et corrélative des études d'imagerie fixes. Ce protocole peut également être utilisée pour caractériser des événements cellulaires pour lequel un paramètre changements dans le temps en fonction de l'environnement cellulaire spécifique. Par exemple, la libération d'une protéine virale marqué par fluorescence à partir de structures individuelles endosomes dans le cytoplasme peut être mise en corrélation avec l'expression et / ou d'une association de protéines de endosomes.
Une limitation possible de ce protocole est que la cartographie de cargaisons à haute densité peut être difficile. Cependant, l'attribution de fonctions gaussiennes contourne ce problème en grande partie en permettantdistinction de positions entre les points lacrymaux fluorescent au niveau des sous-pixels. En outre, la cartographie des moteurs de cargaisons axonales est faible débit: actuellement, la cartographie peut être fait pour 2 axones par dispositif microfluidique, étant donné le faible taux de transfection de neurones et le champ de vision limité lorsque vous utilisez le fort grossissement nécessaire pour haute Resolution Imaging avec notre caméra. Les développements futurs de cette méthode pourraient inclure l'utilisation de systèmes lentiviraux pour la transduction de neurones avec une plus grande efficacité, l'isolement des neurones de souris transgéniques exprimant des protéines par fluorescence marqués ou l'étiquetage des organites de petites colorants fluorescents tels que Lysotracker ou Mitotracker, qui va augmenter la nombre d'axones marqués avec des marqueurs fluorescents. En outre, la taille de la zone enregistrée est limitée par le grossissement, la taille des pixels et de la taille de la matrice de pixels de l'appareil utilisé pour l'imagerie. Les évolutions en cours dans le domaine des techniques d'imagerie permettront de grande surfaces à imager à l'avenir, et donc à augmenter la quantité de données obtenues par condition expérimentale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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