Abstract
Inzicht in de mechanismen waarmee moleculaire motoren hun activiteiten coördineren om vesiculaire ladingen binnen neuronen vervoeren vereist de kwantitatieve analyse van motor / vracht verenigingen bij de enkele blaasje niveau. Het doel van dit protocol kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebruiken correlatie ("kaart") de positie en richting van de beweging van levende lading van de samenstelling en relatieve hoeveelheden van motoren verbonden met dezelfde lading. "Cargo mapping" bestaat uit levend beeldvorming van fluorescent gelabelde ladingen bewegen axons gekweekt op microfluïdische inrichtingen, gevolgd door chemische fixatie tijdens de opname van levende beweging en daaropvolgende immunofluorescentie (IF) kleuring van exact dezelfde axonale gebieden met antilichamen tegen motoren. Colokalisatie tussen ladingen en hun bijbehorende motoren wordt beoordeeld door het toewijzen van sub-pixel positie coördinaten naar motor en vracht kanalen, door het aanbrengen van Gaussische functies om de diffractie-limited puntspreidingsfuncties vertegenwoordigen individuele fluorescerende puntbronnen. Vaste lading en motorische beelden worden vervolgens gelegd op percelen van vracht-verkeer, tot "kaart" om hun bijgehouden trajecten. De sterkte van dit protocol is de combinatie van levende en IF gegevens aan voor het transport van vesiculaire ladingen in levende cellen opgetekend en motoren gekoppeld aan deze exact dezelfde vesicles te bepalen. Deze techniek overwint eerdere uitdagingen die biochemische methoden gebruiken om de gemiddelde motor samenstelling van gezuiverd heterogene bulk blaasje populatie te bepalen, omdat deze methoden niet composities op enkele bewegende lading onthullen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van andere transport- en / of handel trajecten in andere celtypes om de beweging van afzonderlijke intracellulaire structuren correleren met hun eiwitsamenstelling. Beperkingen van dit protocol zijn de relatief lage omzet hebben vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van gekweekteprimaire neuronen en een beperkt gezichtsveld beschikbaar voor hoge-resolutie imaging. Toekomstige toepassingen kan werkwijzen omvatten het aantal neuronen tot expressie fluorescent gelabelde lading verhogen.
Introduction
Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen 1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins - twee grote families van de moleculaire motor eiwitten - die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wordt voornamelijk gemedieerd door dynein, wordt beweging in de anterograde richting vergemakkelijkt door een groot, functioneel diverse familie van kinesine motors. Bijgevolg kunnen anterograde transport van axonale ladingen worden gemedieerd door verschillende familieleden van de kinesine superfamilie 1-5. Hoewel sommige ladingen bewegen voortdurend in beide richtingen, most ladingen bewegen bidirectioneel en reverse vaak op hun weg naar hun eindbestemming 1,5-13. Verder is aangetoond dat de motoren van de tegengestelde gerichtheid associate gelijktijdig tot lading, het verhogen van de vraag hoe gereglementeerde beweging van ladingen wordt gecoördineerd door tegenovergestelde polariteit motoren 5-7. Samen axonale transport van lading is een gecoördineerde proces dat wordt gereguleerd door de samenstelling van motoren en hun specifieke biochemische activiteiten, die op hun beurt afhankelijk van diverse adapters en regelgevende bindingspartners 14.
Trouw beschrijven mechanisme van axonaal transport voor een bepaalde lading en de onderliggende regulering van dat transport ontdekken, is het noodzakelijk dat de samenstelling van motorische eiwitten en hun regulatorische bindingspartners geassocieerd met individuele goederen tijdens het vervoer van levende bepalen. Andere methoden, zoals biochemische benaderingen schattingen over gemiddelde motof samenstellingen op gezuiverd heterogene blaasje populatie, maar deze schattingen niet het type of de bedragen van de motoren gekoppeld aan enkele bewegende blaasjes onthullen. Ook reconstitutie van vesicle transport langs voorgemonteerde microtubules in vitro geactiveerd meten van de hoeveelheid van een type motor op een vesicle level 15. Echter, deze experimenten niet direct correleren het aantal motoren van de transporteigenschappen van deze vesicles en transport gemeten in afwezigheid van cellulaire regulerende factoren.
Een protocol wordt hier gepresenteerd, waarvan de motor samenstelling (type en de relatieve hoeveelheid van de motoren) van de afzonderlijke bewegende blaasjes uit immunofluorescentie (IF): gegevens die endogeen tot expressie motor eiwitten bepaalt, en correleert deze parameters om het vervoer van levende exact dezelfde blaasjes in neuronen 16. Deze methode is gebaseerd op een nauwkeurige kartering van IF-to-live-beweging vracht gegevens. Dit wordt bereikt door growing hippocampus muis neuronen in microfluïdische systemen, volgens vastgestelde protocollen 17-19. Deze apparaten zorgen voor de identificatie en correlatie ("mapping") van axonen en enkele bewegende lading in vaste en live lichtmicroscopie modaliteiten (Figuur 1). Gekweekte neuronen worden getransfecteerd met fluorescent gelabelde lading eiwitten waarvan het transport wordt afgebeeld op een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te gedetailleerde informatie beweging die is uitgezet in kymographs verkrijgen. Tijdens beeldvorming wordt neuronen gefixeerd met paraformaldehyde, en vervolgens gekleurd met antilichamen tegen endogene eiwitten motor. Vaste lading en motorische beelden worden gelegd op live-beweging kymographs naar "kaart" (colocaliseren) hen naar de live-beweging vracht trajecten 16. Om de live-beweging van ladingen met de vereniging van motorische eiwitten correleren, is colocalization geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie "16,20. Fluorescent gelabelde ladingen en motoren genereren buigingsbegrensd punctate functies die gedeeltelijk kunnen overlappen. Om de positie van overlappende puncta lossen, eerst de software past automatisch Gaussische functies aan elke puntspreidingsfunctie, wat neerkomt op individuele fluorescerende puncta, om hun precieze XY sub-pixel-positie te bepalen coördineert en intensiteit amplitudes 21-23. De posities van motoren en ladingen zijn vervolgens vergeleken met elkaar colocalization 16,20 bepalen. Daarom is deze werkwijze nader kent colocalization tussen fluorescente puncta vergelijking met andere methoden 24.
De kracht van deze methode is het vermogen om de colocalization motoren met individuele lading beoordelen gefixeerde cellen, waarvoor levende beweging trajecten (bijvoorbeeld de richting waarin zij bewegen bij de fixatie) zijn rec geweestorded. Met deze methode werden kinesins en dyneins vond gelijktijdig koppelen aan blaasjes die het normale prioneiwit dragen (PrP C -cellular), een neuronaal verrijkt lading die in twee richtingen beweegt of stilstaat in axonen 16. Deze analyse liet de formulering van een werkmodel voor de regulering van PrP C blaasje beweging waarin anterograde (kinesine) en retrograde (dynein) motoren hun activiteiten coördineren om de blaasjes te verplaatsen in beide richtingen of stationair te blijven, terwijl in verband met de lading . Een ander sterk punt van deze methode is het potentieel brede toepasbaarheid voor het karakteriseren van colocalization / vereniging van vele fluorescent gelabelde ladingen die in bewegen vrijwel elk type cel, met een andere proteïne (s) van belang. Zo zou levende / vaste correlatie mogelijk maakt detectie van voorbijgaande proteïne-lading interacties kan zoveel afzonderlijke fluorescent gelabelde bewegende deeltjes worden geanalyseerd over een gewenst period van tijd. Gezien de brede toepasbaarheid en de aard van de vragen die deze methode kan pakken, zal dit protocol van belang zijn voor een breed publiek van cel biologen waaronder die studeert handel en transport in neuronen of in andere celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgende goedgekeurde protocollen en volgens de institutionele richtlijnen voor de humane zorg van proefdieren. Pasgeborene muizen werden gedood door onthoofding.
1. Voorbereiding van Microfluïdische Inrichtingen voor Cell Culture
- Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen voor het kweken van hippocampale neuronen zoals beschreven door Harris en collega's 17-19. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de lading mapping protocol.
OPMERKING: microfluïdische inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar (Materials List), waardoor toegang tot een fabricage faciliteit niet noodzakelijk. - Bereid No. 1½ dekglaasjes (24 x 40 mm) door wassen driemaal met aceton, gevolgd door driemaal wassen met 100% ethanol en drie wassingen van water. WINKEL dekglaasjes in water bij 4 ° C tot gebruik. Deze behandelingen helpen ervoor te zorgen dat coverslips schoon zijn van puin die kunnen interfereren met plating van CELls, vervuiling, en overleving.
LET OP: aceton en ethanol zijn brandbaar en gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), van contact met de ogen (irriterend), van inslikken, van inademing. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen. - Als u klaar bent om te gebruiken, plaatst u een dekking van glas in een 60 mm celkweekschaaltje per microfluïdische apparaat, en laat het aan de lucht drogen zonder deksel gedurende 45 min in een bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen.
- Na apparaten zijn geknipt uit de meesters en stoten zijn gesneden om de reservoirs te creëren (Figuur 1A, B), leg ze met de microfluïdische kanalen side-up in een bioveiligheid kast voorzien van een UV-lamp voor 45 min voor sterilisatie.
OPMERKING: Leaving apparaten onder UV behandeling langer dan 2 uur kan de integriteit van de PDMS beïnvloeden. - Monteer de apparaten door het plaatsen van één apparaat op elke dekking van glas in de 60 mm plastic celkweekschaaltje zodat de microfluïdische kanalen naar beneden. Druk zachtjes op de top of het apparaat (raak het microkanalen) een niet-permanente verbinding van de inrichting aan het dekglas. Bedek elk 60 mm celkweek schaal met deksel.
- Met een micropipet, hydrateren de inrichtingen door toevoeging celkweekniveau water boven twee microfluïdische reservoirs (1 en 2 in figuur 1A), waardoor water doorstromen. Verwijder water met een micropipet en voeg 1 mg / ml poly-L-lysine in microfluïdische reservoir 1 (200 ui) en 2 (100 pl). Het volume verschil zal voor de poly-L-lysine te stromen door de microkanalen (Figuur 1A, B).
- Om de apparaten in de 60 mm celcultuurschalen niet omvallen in een 37 ° C incubator, nog drie 60 mm celkweek schalen met de hulpmiddelen in een 150 mm kunststof celkweekschaal en bedek de schaal met een deksel. Incubeer O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Meestal meer dan 90% van de kanalen bruikbaar per apparaat en doeneventuele luchtbellen of fysieke blokkade niet bevatten.
- Op de volgende dag vervangen poly-L-lysine met water en laat inrichting incubator gedurende ten minste 1 uur. Herhaal dit drie keer wassen. Verwijder water en voeg Neurobasal-A groeimedium (die 2% B-27 supplement en 500 uM GlutaMAX) aan elk apparaat. Laat O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Op de volgende dag, plaat hippocampale cellen zoals hierna beschreven.
2. Plating van Mouse hippocampus primaire neuronen in Microfluïdische Devices
OPMERKING: De voorbereiding van gekweekte hippocampale neuronen van pasgeborene ratten is eerder gepubliceerd in Jupiter 25. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de plaat muis hippocampale neuronen in microfluïdische apparaten, en die optimaal zijn voor transfecties waren.
- Voor muizenhersenen dissectie, voorverwarmen Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum(FBS; zonder antibiotica), Mengsel A (125 mg DL-cysteïne, 125 mg runderserumalbumine (BSA) en 3.125 g D-glucose in 500 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), filter gesteriliseerd door een 0,22 um filter) en deoxyribonuclease I oplossing (DNase I: 50 mg DNase I en 0,5 ml van een 1,2 M MgSO4 oplossing in 100 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) filter gesteriliseerd door een 0,22 urn filter) in een 37 ° C waterbad.
- Voorverwarmen Neurobasal-A groeimedium in een 37 ° C incubator met 5% CO2 om de pH in evenwicht.
- Ontleden hippocampus 1-3 dagen oude pasgeboren muizen volgens vastgestelde protocollen 26. Houd hippocampus in een 15 ml conische buis met 10 ml dissectie buffer (HBSS bevattende 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glucose, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine), op ijs. Zet maximaal 4 zeepaardjes per 15 ml conische buis.
- Voer de resterende protocol is onder steriele toestands in een bioveiligheid kast.
- Verdun 45 eenheden van papaïne in 5 ml van mengsel A, vortex en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C totdat papaïne poeder wordt opgelost. Voeg 1 ml DNase I oplossing. Filter de mix door een 0,22 pm spuitfilter unit.
- Zorgvuldig aspireren HBSS 'van 15 ml conische buis met hippocampus. Voeg 10 ml koude (4 ° C) HBSS tot hippocampus en laten bezinken naar de bodem van de buis. Aspireren HBSS voorzichtig van 15 ml conische buis.
- Voeg 1 ml papaïne / DNase I mix tot 4 hippocampus en incubeer gedurende 20-30 min bij 37 ° C. Kantel conische buis om de 5 min naar hippocampus baden met mix. Als alternatief plaatst hippocampus in een 37 ° C waterbad shaker met zachtjes schudden (~ 100 rpm).
- Zuig papaïne / DNase I mengen en wassen hippocampus tweemaal met voorverwarmd DMEM (37 ° C) bevattende 10% FBS.
- Na de tweede wasbeurt, voeg 2 ml voorverwarmde DMEM met 10% FBS aan hippocampus en handmatig vermaal hippocampus door pipetterenop en neer ~ 10-12 keer met behulp van een 1 ml pipet tip om neuronen te distantiëren.
- Laat trituraat regelen voor ~ 1 min, omdat dit zal toelaten niet-gesplitste neuronen te vestigen op de bodem van de conische buis. Breng supernatant dat gedissocieerd neuronen in nieuw 15 ml conische buis vermeden Transmissie van grote weefsel dat zich op de bodem van de buis.
- Spin cellen bij 1000 xg gedurende 2 min en supernatant voorzichtig verwijderen zonder de cel pellet. Resuspendeer cellen in 80 ul Neurobasal-A groeimedium door pipetteren voorzichtig.
- Verwijder medium uit microfluidic reservoir 1 en 1 '. Solliciteer 20 ul van cellen (~ 275.000) naar microfluïdisch reservoir 1, en hen in staat stellen om door stromen. Plaats inrichting 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 20 minuten.
- Kijk onder de microscoop om ervoor te zorgen dat cellen hebben gehandeld op grond van de dekking van glas. Voeg Neurobasal-A groeimedium naar boven uit alle reservoirs. Terug inrichting met cellen tot een 37 ° C incubator met 5% CO
- Controleer apparaten elke verdamping ~ 2-3 dagen en top off reservoirs met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement (zonder GlutaMAX) te vermijden. Neuronen beginnen hun axons uitstrekken door microkanalen ~ 2-3 dagen na uitplaten. Onderwerp neuronen meestal 7-10 dagen na transfectie plating.
3. Transfectie van hippocampale neuronen Grown in Microfluïdische Device
- Per apparaat, bereid een mengsel van 1,2 ul Lipofectamine 2000 in 30 ui Neurobasal-A en een mengsel van 0,5 ug fluorescerende lading fusieplasmide in 30 ui Neurobasal-A en incubeer 5 min bij RT. Voeg Lipofectamine mengsel DNA mix en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 60 ul van Neurobasal-A met 4% B-27 supplement aan het DNA / Lipofectamine mix en meng door flicking de buis.
- Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 2 en 2 'en zorgvuldig opvullen putten met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement zonder te morsen op de middellange into de andere compartimenten.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit microfluidische reservoir 1 en 1 '. Voeg 120 ul van DNA / Lipofectamine mix aan microfluïdische reservoir 1 en laat het stromen. Terug apparaat 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 3-4 uur.
- Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 1 en 1 'en te vervangen door Neurobasal-A met 2% B-27 supplement voor 24 uur (of tot het moment van afbeelding). Typisch, 5-7 axonen die groeien door microkanalen worden getransfecteerd in die omstandigheden, die ongeveer 1-3% transfectie-efficiëntie in overeenstemming met efficiëntie gepubliceerd voor de hippocampus gekweekte cellen 26 vertegenwoordigen.
4. "Cargo Mapping" Analyses
- Live-Imaging van vracht-verkeer
- Voer de beeldvorming over een omgekeerde epifluorescente lichtmicroscoop uitgerust met een 37 ° C incubator en een CO 2 regelkamer.
- Monteer het dekglaasje met hippocampale neuronen gekweekt in een microfluidic apparaat op de microscoop podium. Tot neuronale dood te voorkomen, werken vlot naar de monsters bij de microscoop gedurende niet langer dan 1 uur.
- Met een doelstelling hoge resolutie (100X), vind axonen van getransfecteerde cellen die zich door kanalen microfluidic kamers en noteer het aantal kanalen waarin de getransfecteerde axon gevonden. Tel het aantal kanalen met behulp van een hand tally teller.
- Voor optimale opnamen van live-beweging en de daaropvolgende colocalization analyse, kiest axonen die relatief vlak te groeien door de kanalen zodat de beeldvorming van de meeste blaasjes in focus kan worden uitgevoerd.
- Verwijder het grootste deel van het medium uit reservoirs 2 en 2 'met een 1 ml plastic transferpipet. Latere aanpassing van vaste beelden met beweging trajecten op kymographs vergemakkelijken lijn de rechterrand van de microkanalen met het gezichtsveld tijdens beeldvorming (Figuur 1B, C).
- Om fixin vergemakkelijkeng van de monsters tijdens de beeldvorming, live beeldvorming met twee mensen. Als alternatief, als levende beeldvorming wordt uitgevoerd door één persoon, gebruikt een microscoop systeem voorzien drift correctie.
- Start imaging live-beweging vracht met time-lapse specificaties die specifiek zijn voor de dynamiek vervoer van de vracht die wordt geanalyseerd (microscoop specificaties en instellingen voor beeldvorming YFP- PrP C zijn gespecificeerd in de legenda van figuur 2 en Materials List).
- Na voldoende levende beweging zijn verzameld, één persoon vullen reservoirs 2 en 2 'met voorverwarmd 4% paraformaldehyde in PBS dat 0,04 g / ml sucrose aan de cellen vast. Vermijd het aanraken van de microfluïdische apparaat, aangezien dit de focus van de live beeldvorming zal verstoren. Hebben de andere persoon pas de scherpstelling, terwijl het fixatief wordt toegevoegd. Fixatie is succesvol wanneer onmiddellijke stop van de beweging wordt waargenomen. Fixatief Naar 1 en 1 'daarna reservoir.
OPMERKING: Tijdelijke photobleaching van de lading fluorescentie kunnen ook worden waargenomen, maar de fluorescentie aanhoudt nadat IF kleuring voor motor-eiwitten is afgerond (volgende stap).
OPMERKING: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing, bij aanraking met de huid en opname door de mond. Irriterend voor de ogen, de ademhalingswegen en de huid. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen.
- IF kleuring van motorische eiwitten voor colocalization analyse
OPMERKING: kwantificering van relatieve niveaus van motorische eiwitten (zoals bepaald door antilichaam kleuring), met betrekking tot individuele bewegende ladingen, valideren en titreer antilichamen zodat het antilichaam-antigeen-bindende verzadigd. Dit wordt gedaan door het bepalen van de specificiteit van het antilichaam met neuronen waarin het eiwit van belang is of knock-out of aangereden, en door het uitvoeren IF analyse met toenemende concentraties antilichaam. Voor negatieve controles, worden neuronen gekleurd met secundaire antilichamen in de afwezigheid van primaire antilichamen. Meer gedetailleerdeBeschrijving van antilichaam validatie vindt in Encalada et al. 16 en Szpankowski et al. 20.- Verwijder het dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat uit de microscoop podium. Gebruik het microfluïdische apparaat niet los van het dekglaasje, zoals de microkanalen nodig om de fase en vaste beelden af intact blijven. Voer de volgende stappen in een vochtige kamer.
- Om de stroom van oplossingen in de microkanalen garanderen handhaven buffervolume verschil tussen reservoirs 1, 1 'en 2, 2' ten minste 30 ui. in alle daaropvolgende stappen. Bijvoorbeeld, voeg 100 ul medium volume microfluïdische reservoir 2, 2 ', en 70 pl media volume microfluïdische reservoir 1, 1'.
- Verwijderen fixatief van de kamers van het microfluïdische apparaat en wassen cellen driemaal met PBS 10 min wachten tussen wasbeurten.
- Permeabilize cellen door 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS gedurende 5 min alle reservoirs.
- Verwijder oplossing uit alle reservoirs en wassen met PBS. Herhaal dit drie keer wassen wachten 10 min tussen de wasbeurten.
- Verwijder oplossing uit alle reservoirs en toepassing blokkerende buffer bevattende 10% Normaal Ezel Serum en 3% protease vrij en immunoglobuline G (IgG) vrij BSA in PBS en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Spin primair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang de blokkerende buffer van microfluïdische apparaat met antilichaam oplossing. Incubeer monsters gedurende 2 uur bij KT of O / N bij 4 ° C.
- Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten.
- Spin secundair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang PBS met secundair antilichaam oplossing. Broedenmonsters gedurende 1 uur bij KT.
- Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten.
- Vervang PBS met ~ 10-20 ul fixeermiddel door direct pipetteren fixeermiddel in de opening van de kanalen verbinden de reservoirs. Laat de montage media drogen ~ 20 min - 1 uur bij kamertemperatuur.
- Opslag apparaten op 4 ° C beschermd tegen licht te vermijden fotobleken en beeld axonen binnen twee dagen (maximaal één week) van kleuring.
- Na het kleuren is voltooid, monteren dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat op de microscoop podium. Zoek het gebied van de getransfecteerde axon afgebeeld in stap 4.1.1-4.1.7.
- Verwerven Z-stack afbeeldingen (300 nm treden) voor elk van de drie kanalen: lading, motor 1, motor 2, met een objectief met hoge resolutie (bijvoorbeeld een hoge numerieke apertuur olie of water objectief).
OPMERKING: Verwerving van Z-stacks is belangrijk als axonen vaak niet perfect vlak groeienin microkanalen en dus niet alle fluorescerende puncta in hetzelfde focal plane.
- Cargo Mapping
- Genereer een kymograaf van vracht-verkeer met behulp van software voor beeldanalyse. De ImageJ plugin ontwikkeld door Rietdorf en Seitz (EMBL) wordt aanbevolen voor het genereren kymographs (te downloaden zie Materials List).
OPMERKING: ImageJ is een publiek domein, Java-gebaseerde beeldverwerking programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health 27,28 (te downloaden zie Materials List). - Lijn de stilstaande beelden van de fluorescerende lading (opgewekt in stap 4.2.14) handmatig door superpositie ze op de positie van de banen in de kymograaf op het fixatiepunt (figuur 2A, B), met een algemeen verkrijgbare grafische software (Materials lijst). Handmatig uitlijnen door eerste afbeelding van de vaste lading superpositie op de kymograaf en handmatig kiezen van de lading puncta die overeenkomt met een specifiek traject opde kymograaf. Voor de beste uitlijning resultaten gebruikt de Z slice dat is in het beste focus voor de lading in kaart gebracht. Verscheidene Z segmenten worden gebruikt.
- Voor elk beeld in de Z-stack (cargo, motor 1 en motor 2, gegenereerd in stap 4.2.14) bepalen de XY-coördinaten en intensiteit amplitudes voor elke fluorescerende puncta via een vastgestelde algoritme voor 2D Gaussische passen bij de puntspreidingsfunctie dat vertegenwoordigt elke puntbron in elk van de drie kanalen 16,20,21 (figuur 2D).
OPMERKING: Om de XY coördinaten, een op maat gebouwde MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie" werd ontwikkeld 16,20, wat een Gauss fitting algoritme ontwikkeld door Jaqaman, Danuser en collega's 21-23 bevat verkrijgen. Het softwarepakket en gedetailleerde instructies voor het gebruik ervan kan worden verkregen op aanvraag. - Voor elk van de individuele lading puncta die werden in kaart gebracht op de mobiele of vaste trajecten op de kymograaf, selecteert tHij XY coördinaten en intensiteit amplitudes van de resultaten van het programma "Motor colocalization" (deze ladingen individueel geëtiketteerd in figuur 2B). Gebruik meerdere Z-stack beelden verkregen in stap 4.2.14) om meer ladingen die zijn gevonden op verschillende brandpunten vliegtuigen in kaart.
- Vergelijk de individuele XY coördinaten voor de toegewezen lading die verkregen voor elk van de motor kanalen in de overeenkomstige Z-segment (Figuur 2D). Bepaal en selecteer de XY motor coördinaten die binnen een straal van 300 nm van de lading. Voor ladingen en motoren dat signaal binnen dezelfde focal plane hebben, gebruik dan de "Motor colokalisatie" softwarepakket om de puncta die zich bevinden binnen een straal van 300 nm te bepalen.
- Genereer een kymograaf van vracht-verkeer met behulp van software voor beeldanalyse. De ImageJ plugin ontwikkeld door Rietdorf en Seitz (EMBL) wordt aanbevolen voor het genereren kymographs (te downloaden zie Materials List).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een overzicht van de microfluïdische inrichting waarmee hippocampale neuronen groeien (Figuur 1A, B). Neuronen worden uitgeplaat in reservoir 1. De grootte van de microkanalen voorkomt de diffusie van cellichamen (soma) in het axonale compartiment terwijl de lengte van de kanalen voorkomt dendritische uitsteeksels vanaf kruising tot aan het axonale compartiment. Na ~ 2-3 dagen in cultuur, beginnen de neuronen een verlenging van hun axonen over microkanalen in het axonale compartiment (Figuur 1B, C). Getransfecteerde axonen expressie normale prioneiwit gelabeld met geel fluorescerend eiwit (YFP-PrP C) kan worden geïdentificeerd door fluorescentie microscopie (figuur 1C). Expressie van fluorescent gelabelde eiwitten met behulp van plasmide transfectie moeten worden gecontroleerd op juiste subcellulaire lokalisatie en functie als overexpressie zou experimentele artefacten te introduceren als gevolg van veranderde eiwitconformaties. Aldus colocalization experimenten moeten worden aangevuld met zowel biochemische co-precipitatie studies, en met IF kleuring voor endogeen tot expressie gebrachte eiwitten. Het gedrag van de YFP-PrP C hier gebruikt is eerder 16 getest. Expressie van YFP-PrP C in transient getransfecteerde cellen neuroblastoma (N2a) laag was, suggereert dat transiënte transfectie niet tot overexpressie YFP-PrP C spiegels 16. Bovendien IF N2a cellen getransfecteerd met YFP-PrP C met behulp van antilichamen tegen PrP C aangegeven dat YFP-PrP C zeer colocalized met endogene PrP C, wat suggereert dat zowel getransfecteerde en endogene PrP C gedragen eveneens. Om vast te stellen dat PrP C samenhangen met motoren, werden blaasje immunoisolations uitgevoerd 16.
Voor een optimale lading mapping studies, wordt de rechterrand van de microkanalen uitgelijnd met het gezichtsveld bij live en vaste imaGing teneinde beeld hetzelfde gebied van de axon (aangegeven met rode rechthoek in figuur 1B, C). Figuur 2 en Figuur 3 tonen representatieve resultaten van de lading mapping analyse van neuronen tijdelijk met YFP-PrP C. Blaasjes dragen YFP- PrP C worden in zoogdieren axonen getransporteerd door leden van de Kinesin-1 familie en Dynein Heavy Chain 1 (DYNC1H1) 16, werden daarom YFP- PrP C blaasjes toegewezen aan de Kinesin-1 subunit Kinesin Light Chain 1 (KLC1) en motoren DYNC1H1. YFP-PrP C blaasje beweging werd afgebeeld en uitgezet in een kymograaf (Figuur 2A). In kymographs wordt anterograde en retrograde beweging van YFP-PrP C vesicles vertegenwoordigers trajecten met negatieve en positieve hellingen respectievelijk en stationaire vesicles worden weergegeven door verticale trajecten. Bij fixatie, stopte beweging aangeduid door de afwezigheid van diagonale lijnen in de kymograaf(Figuur 2A). De IF signaal van moleculaire motoren en lading in vaste, gepermeabiliseerde axonen is punctate 16 (figuur 2B, C). Het doel van "lading mapping" is te bepalen of puncta in de laadruimte (figuur 2B) colocaliseren met motor puncta (figuur 2C) in de andere twee kanalen. Om dit te doen, werden fluorescerende beelden van vaste YFP- PrP C blaasjes, en de IF beelden van overeenkomstige KLC1 en DYNC1H1 geassocieerd met vesiculaire puncta afgestemd op de kymograaf (Figuur 2B, C). Gaussische functies werden de puntspreidingsfuncties fluorescerende puntbronnen drie kanalen aangebracht om de exacte XY posities van motoren lading trajecten verkregen live beeldvorming (figuur 2D) kaart. Endogeen tot expressie KLC1 en DYNC1H1 motoren verschijnen punctata kleuring en differentieel colocalized met YFP-PrP C vesicles (figuur 2D). Colocalisatie werd gedefinieerd door de aanwezigheid van YFP-PrP C en motor puncta binnen een afstand van 300 nm en gekwantificeerd door het niveau van colokalisatie van de Gauss XY posities tussen de YFP-PrP C en elk van de KLC1 en DYNC1H1 puncta coördinaat (figuur 3A ). Deze afstand werd gekozen op basis van de optica, diffractie limiet van het licht, en de relevante fysieke grootte van de lading en de motor subeenheden. De relatieve hoeveelheid KLC1 en DYNC1H1 verbonden YFP-PrP C vesicles werd verkregen van de Gauss amplitudes, die de intensiteiten van elke puncta (figuur 3B) te vertegenwoordigen. Deze gegevens kunnen verder worden geanalyseerd als gewenst. Bijvoorbeeld, intensiteiten van motoren colocalizing met YFP-PrP C puncta tussen controle (wildtype - WT) neuronen en patiënten zonder andere kinesine-1 subeenheden (KIF5C - / - neuronen in figuur 3A, KIF5C is een lid van de kinesine-1 familie), worden vergeleken om te bepalen of de afwezigheid van KIF5C verstoort vereniging van KLC1 en / of DYNC1H1 om YFP- PrP C blaasjes (KLC1 en DYNC1H1 intensiteiten waren onveranderd in onze experimenten 16). Bovendien kan KLC1 en DYNC1H1 intensiteiten worden uitgezet om mogelijke correlaties tussen relatieve motor hoeveelheden en richting van de beweging (Figuur 3B) te onderzoeken. Bijvoorbeeld YFP-PrP C blaasjes die bewegen en / of vast verbonden met zowel KLC1 en / of DYNC1H1 (Figuur 3B).
Figuur 1. hippocampus neuronen gekweekt in microfluïdische inrichtingen. (A) Foto van een microfluïdische apparaat. De contouren van reservoirs worden gevisualiseerd door de rode en blauwe kleurstoffen. Nummering verwijst naar het aantal microfluïdische reservoirs gebruikt in het protocol. (B) Diagram van een microfluïdische inrichting. Komen overeen met reservoirs in die media en neuronen worden toegevoegd. Getransfecteerde neuronen worden in het groen weergegeven. Rode rechthoek en rode gestippelde pijlen geven de regio aanbevolen voor levende en vaste fluorescentie beeldvorming. (C) Beeld van twee axonen getransfecteerd met YFP-PrP C groeien door één microkanaal (één microkanaal en de rand van het apparaat wordt aangegeven door gestippelde witte lijnen) . Individueel bewegen YFP- PrP C blaasjes kan onderscheiden als helderder puncta zijn. Schaal bar is 10 micrometer. Figuur is een bewerking van:.. Encalada et al 16 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. "Cargo mapping" om YFP- PrP C blaasje vervoer met correlerenrelatieve hoeveelheden van kinesine en dynein motoren. Wide-field fluorescentie beelden van live-beweging en van vaste ladingen werden genomen op een omgekeerde microscoop uitgerust met een gemotoriseerde podium en een CCD-camera en een 100X / 1.4 NA olie doelstelling. (A) kymograaf van YFP -PrP C vesicle verkeer van axonen in figuur 1C. Levende beweging werd geconstateerd gedurende een totale tijd van 30 tot 60 seconden bij 100 ms belichting (10 Hz). Cellen werden gefixeerd na beeldvorming vracht verkeer van tenminste 15 sec. Stippellijn geeft het moment van fixatie tijdens live beeldvorming. Rode doos staat regio vesicles gemarkeerd (B, C) en uitgebreid in (D). De pijlpunten wijzen naar drie vesicles getoond in (D) gevonden stationaire (blauw), retrograde (rood) en anterograde (groen) trajecten. ( B) Afbeelding van vaste YFP-PrP C vesicles uitgelijnd overeenkomstige kymograaf. Getallen geven de inindividuele YFP- PrP C blaasjes die werden toegewezen aan puncta identificeerbare op de kymograaf. Anterograde blaasjes zijn groen, retrograde zijn rood, en stationaire degenen zijn blauw. (C) Vaste IF beelden van KLC1 en DYNC1H1 puncta corresponderen met dezelfde regio weergegeven in (B). Schaal bar (AC) 10 urn. (D) Uitbreiding van vaste MF-signalen van elk van de drie kanalen met 2D Gaussische functie opdrachten. Blauwe stippen vertegenwoordigen lokale intensiteit maxima pixels, rode stippen vertegenwoordigen Gauss past, en roze stippen zijn de overlap tussen de twee. Pijlpunten geven voorbeelden van YFP-PrP C vesicles getoond in (A) en de differentiële colocalization met KLC1 en DYNC1H1 motor eiwitten. Schaal bar is 2 micrometer. Figuur is een bewerking van:.. Encalada et al 16 Klik hier om een grotere versie van th bekijken is figuur.
Figuur 3. Kwantitatieve analyses van "lading mapping" van YFP-PrP C vesicles. (A) Kwantificering van colocalization tussen YFP-PrP C vesicles, KLC1 en DYNC1H1 in WT en KIF5C knockout neuronen (KIF5C - / -). Totaal aantal puncta geanalyseerd was N WT = 887 en N KIF5C - / -. = 1629 16 Aantallen binnenkant balken geven het aantal blaasjes per categorie. Getoond zijn gemiddelden ± SEM. Niet-parametrische permutatie t test werd gebruikt voor vergelijking tussen genotypen. 29 (B) Correlatie van relatieve motor samenstelling en richting van beweging WT neuronen aan data in (A) geanalyseerd. Figuur is een bewerking van: Encalada et al 16...jove.com / files / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol kan de correlatie van gerichtheid verkeer van individuele fluorescerende microtubule gebaseerde bewegende lading deeltjes met het type en de relatieve hoeveelheid geassocieerde motor eiwitten in levende neuronen. Eerder, de totale motor samenstelling van axonale vesiculaire lading werd getest op heterogene populaties van biochemisch gezuiverd blaasjes en organellen 9,15. Echter kenmerkend motor samenstelling voor één soort lading in cellen uitdagend vanwege de moeilijkheid bij het zuiveren homogene vesicle populaties. Bovendien, terwijl de metingen van de motor kraam-krachten raamden actieve motor nummers in Drosophila embryo's, het was onduidelijk of gerichtheid van beweging gecorreleerd aan motoren wordt stabiel gehouden tot lading of de snelle associatie / dissociatie van actieve motoren naar / van de lading 12. Daarom is de "lading mapping" protocol described hier werd ontwikkeld om de correlatie tussen de aard en relatieve aantal motoren gekoppeld individueel bewegende lading in levende neuronen verder te onderzoeken.
Succesvol gegevens "cargo mapping" verkrijgen is het essentieel om 1) voeren beeldvorming lading bewegen en vaste IF op een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, 2) zorgen onmiddellijke vaststelling van het monster tijdens beeldvorming, 3) sluiten de regio interesse in levende en vaste beelden en in kaart vaste lading en motoren om beweging kymographs voor dezelfde beelden, en 4) nauwkeurig bepalen de XY coördinaten van lading en motor fluorescerende puncta om de hoeveelheid colocalization tussen lading en motorische eiwitten te bepalen.
Hoewel dit protocol is bij uitstek geschikt om transporteigenschappen analyseren uniform georganiseerde axonen van neuronen gekweekt in microfluïdische inrichtingen, kan worden aangepast aan een breed onderzoeksgebied vragen. Bijvoorbeeld, deze toepassingentie kunnen worden gebruikt om associatie van vesicles karakteriseren de betrokken endo / exocytose adapters (bijvoorbeeld handel assays fibroblasten) of de groei van microtubuli gelabeld met microtubule + tip eiwitten. Hiervoor kan microfluïdische inrichtingen zijn gesubstitueerd met gerasterde dekglaasjes naar de lokalisatie van afgebeelde cellen nodig correlatieve levende en vaste imaging studies te vergemakkelijken. Dit protocol kan ook gebruikt worden om te karakteriseren cellulaire gebeurtenissen waarvoor een parameter verandert in de tijd afhankelijk van de specifieke cellulaire omgeving. Zo kan de vrijgave van een fluorescent gemerkte viraal eiwit individueel endosomale structuren in het cytoplasma worden gecorreleerd met de expressie en / of associatie van endosomale eiwitten.
Een mogelijke beperking van dit protocol is dat mapping hoge dichtheid ladingen moeilijk zijn. De toewijzing van Gaussische functies omzeilt dit probleem grotendeels doordatonderscheid van posities tussen fluorescerende puncta op sub-pixel niveau. Bovendien is het in kaart brengen van de motoren om axonale cargo is low-throughput: op dit moment, kan mapping worden gedaan voor 2 axonen per microfluïdische apparaat, gezien de lage snelheid van de transfectie van neuronen en het beperkte gezichtsveld bij gebruik van de hoge vergroting nodig is voor high- resolutie beeldvorming met onze camera. Toekomstige ontwikkelingen van deze werkwijze kunnen zijn het gebruik van lentivirale systemen neuronen met hogere efficiëntie, isolatie van neuronen van transgene muizen die fluorescent gemerkte eiwitten of etikettering van organellen met kleine fluorescente kleurstoffen zoals Lysotracker of Mitotracker, die zal verhogen transduceren aantal axonen gelabeld met fluorescente merkers. Bovendien is de grootte van het opgenomen gebied begrensd door de vergroting, de pixelgrootte en de grootte van de pixel matrix van de camera voor beeldvorming. Lopende ontwikkelingen op het gebied van beeldvormende technieken zal zorgen voor groter gebiedom te worden afgebeeld in de toekomst en daardoor stijgt de hoeveelheid gegevens verkregen per experimentele conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
