Abstract
आणविक मोटर्स न्यूरॉन्स के भीतर vesicular कार्गो परिवहन के लिए उनकी गतिविधियों का समन्वय तंत्र है जिसके द्वारा समझना एकल पुटिका स्तर पर मोटर / कार्गो संघों के मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक ही माल के साथ जुड़े मोटर्स की रचना और रिश्तेदार मात्रा को ("नक्शा") सहसंबंधी लाइव माल की आवाजाही की स्थिति और दिशात्मकता मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए है. "कार्गो मानचित्रण" जी लाइव आंदोलन की रिकॉर्डिंग के दौरान रासायनिक निर्धारण द्वारा पीछा microfluidic उपकरणों पर सुसंस्कृत axons में चलती fluorescently लेबल कार्गो की इमेजिंग, और मोटर्स के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ठीक उसी axonal क्षेत्रों के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) धुंधला के होते हैं. कार्गो और उनके संबद्ध मोटर्स के बीच colocalization उप पिक्सेल स्थिति बताए द्वारा मूल्यांकन किया है विवर्तन-ली को फिटिंग गाऊसी कार्यों द्वारा, मोटर और कार्गो चैनलों के लिए निर्देशांकव्यक्तिगत फ्लोरोसेंट बिंदु स्रोतों का प्रतिनिधित्व mited बात फैल कार्य करता है. फिक्स्ड कार्गो और मोटर छवियों बाद में उनकी नज़र रखी trajectories के लिए उन्हें "नक्शा" के लिए, कार्गो आंदोलन के भूखंडों को आरोपित कर रहे हैं. डेटा जीवित कोशिकाओं में vesicular कार्गो के परिवहन दोनों रिकॉर्ड करने के लिए और इन ठीक उसी पुटिकाओं के लिए जुड़े मोटर्स निर्धारित करने के लिए तो इस प्रोटोकॉल की ताकत लाइव का संयोजन है और. इस तकनीक को इन तरीकों ही चलती कार्गो पर रचनाओं प्रकट नहीं करते हैं, के रूप में शुद्ध विषम थोक पुटिका आबादी की औसत मोटर संरचना निर्धारित करने के लिए जैव रासायनिक विधियों का उपयोग करें कि पिछले चुनौतियों पर काबू. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल उनके प्रोटीन संरचना के साथ अलग-अलग intracellular संरचना के आंदोलन सहसंबंधी अन्य प्रकार की कोशिकाओं में अन्य परिवहन और / या तस्करी रास्ते के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता. इस प्रोटोकॉल की सीमाओं के कारण सुसंस्कृत की कम अभिकर्मक क्षमता को अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैंप्राथमिक न्यूरॉन्स और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उपलब्ध देखने का एक सीमित क्षेत्र. भविष्य अनुप्रयोगों fluorescently लेबल कार्गो व्यक्त न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि करने के तरीकों में शामिल कर सकता है.
Introduction
Intracellular परिवहन विभिन्न सेलुलर डोमेन 1 के लिए प्रोटीन, झिल्ली, अंगों, और संकेतन अणुओं के वितरण के लिए सभी प्रकार की कोशिकाओं में महत्वपूर्ण है. न्यूरॉन्स अत्यधिक गंभीर रूप से विभिन्न axonal microdomains को उनकी लंबी दूरी की डिलीवरी के लिए आवश्यक सामानों के intracellular परिवहन पर निर्भर है कि लंबे, ध्रुवीकृत अनुमानों के साथ कोशिकाओं को विशेष कर रहे हैं. दो बड़े आणविक मोटर प्रोटीन के परिवारों - - यह परिवहन kinesins और dyneins द्वारा मध्यस्थता है कार्गो के लिए कि बाँध और क्रमशः, अग्रगामी और प्रतिगामी दिशाओं में ध्रुवीकरण सूक्ष्मनलिकाएं साथ ट्रैक. प्रतिगामी आंदोलन मुख्य रूप से dynein द्वारा मध्यस्थता कर रहा है, अग्रगामी दिशा में आंदोलन kinesin मोटर्स के एक बड़े, कार्यात्मक विविध परिवार से मदद की है. नतीजतन, axonal कार्गो के अग्रगामी परिवहन kinesin superfamily 1-5 की विभिन्न परिवार के सदस्यों द्वारा मध्यस्थता जा सकता है. कुछ कार्गो या तो दिशा, मी में लगातार स्थानांतरित हालांकिOST कार्गो bidirectionally कदम है और उनकी अंतिम स्थलों 1,5-13 के लिए अपने रास्ते पर अक्सर रिवर्स. इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि, कार्गो के लिए एक साथ दिशात्मकता सहयोगी विरोध कार्गो के विनियमित आंदोलन विपरीत-ध्रुवता मोटर्स 5-7 से समन्वित है के रूप में कैसे सवाल उठा की मोटरों. साथ में, axonal कार्गो के परिवहन मोटर्स और बदले में विभिन्न एडेप्टर और विनियामक बाध्यकारी भागीदारों 14 पर निर्भर हैं जो उनकी विशिष्ट जैव रासायनिक गतिविधियों की रचना के द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि एक ठोस प्रक्रिया है.
ईमानदारी से एक विशिष्ट कार्गो के लिए axonal परिवहन की व्यवस्था का वर्णन करने के लिए और कहा कि परिवहन की अंतर्निहित विनियमन को उजागर करने के लिए, यह उनके रहते परिवहन के दौरान अलग-अलग कार्गो के साथ जुड़े मोटर प्रोटीन और उनके विनियामक बाध्यकारी भागीदारों की संरचना निर्धारित करने के लिए सर्वोपरि है. अन्य विधियों, उदाहरण के जैव रासायनिक दृष्टिकोण के लिए, औसत चुटकुला का अनुमान प्रदानया शुद्ध विषम पुटिका आबादी पर रचनाएं, लेकिन इन अनुमानों प्रकार या एकल चलती पुटिकाओं के लिए जुड़े मोटर्स की मात्रा का खुलासा नहीं करते. इसके अलावा, इन विट्रो में preassembled सूक्ष्मनलिकाएं साथ पुटिका परिवहन का पुनर्गठन एक भी पुटिका स्तर 15 पर मोटर का एक प्रकार की राशि को मापने के सक्षम होना चाहिए. हालांकि, इन प्रयोगों सीधे उन vesicles के परिवहन विशेषताओं के साथ मोटर्स की राशि सहसंबंधी, और सेलुलर नियामक कारकों के अभाव में परिवहन मापा नहीं था.
Endogenously मापने (यदि) डेटा मोटर प्रोटीन व्यक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस से व्यक्ति आगे बढ़ vesicles के मोटर रचना (प्रकार और मोटर्स के रिश्तेदार राशि) निर्धारित करता है, और न्यूरॉन्स में ठीक उसी vesicles के लाइव परिवहन करने के लिए इन मापदंडों संबद्ध जो यहाँ प्रस्तुत है एक प्रोटोकॉल, 16. इस विधि यदि करने वाली लाइव कार्गो आंदोलन डेटा की सटीक मानचित्रण जरूरत पर जोर देता. इस growin द्वारा पूरा किया हैmicrofluidic उपकरणों में जी हिप्पोकैम्पस माउस न्यूरॉन्स प्रोटोकॉल 17-19 स्थापित बाद. इन उपकरणों निश्चित और जीने प्रकाश माइक्रोस्कोपी तौर तरीकों में axons और एक चलती कार्गो की पहचान और सहसंबंध ("मानचित्रण") (चित्रा 1) के लिए अनुमति देते हैं. सभ्य न्यूरॉन्स जिसका परिवहन kymographs में साजिश रची है कि विस्तृत आंदोलन जानकारी प्राप्त करने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर imaged है fluorescently लेबल कार्गो प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. इमेजिंग के दौरान, न्यूरॉन्स paraformaldehyde के साथ तय कर रहे हैं, और बाद में अंतर्जात मोटर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग. फिक्स्ड कार्गो और मोटर छवियों आंदोलन 16 trajectories लाइव कार्गो के लिए उन्हें "नक्शा" (colocalize) को लाइव आंदोलन kymographs पर आरोपित कर रहे हैं. मोटर प्रोटीन की एसोसिएशन के साथ कार्गो के लाइव आंदोलन सहसंबंधी, colocalization "मो नामक एक कस्टम MATLAB सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर विश्लेषण किया हैटो colocalization "16,20. Fluorescently लेबल कार्गो और मोटर्स ओवरलैप आंशिक रूप से कर सकते हैं कि विवर्तन सीमित कबरा सुविधाओं उत्पन्न करते हैं. Puncta ओवरलैपिंग की स्थिति को हल करने के सॉफ्टवेयर पहले स्वतः उनके सटीक XY उप पिक्सेल स्थिति निर्धारित करने के लिए, व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट puncta का प्रतिनिधित्व करने, प्रत्येक बात फैल समारोह को गाऊसी कार्यों फिट बैठता है निर्देशांक और तीव्रता 21-23 आयाम. मोटर्स और कार्गो के पदों पर रहे हैं बाद में colocalization 16,20 निर्धारित करने के लिए एक दूसरे की तुलना में. इसलिए, इस विधि ज्यादा ठीक अन्य तरीकों 24 की तुलना में फ्लोरोसेंट puncta के बीच colocalization प्रदान करती है.
इस विधि की ताकत लाइव आंदोलन प्रक्षेप पथ (उदाहरण के लिए, जिस दिशा में वे निर्धारण के समय में चल रहे थे) आरईसी किया गया है जिसके लिए तय की कोशिकाओं में अलग-अलग कार्गो के साथ मोटर्स की colocalization का आकलन करने की क्षमता है,orded. इस विधि के साथ, kinesins और dyneins, (पीआरपी सी -cellular) bidirectionally चलता है या एक्सोन 16 में स्थिर बनी हुई है कि एक neuronally समृद्ध कार्गो सामान्य prion प्रोटीन ले कि पुटिकाओं को एक साथ सहयोगी पाए गए. इस विश्लेषण कार्गो के लिए जुड़े जबकि अग्रगामी (kinesin) और प्रतिगामी (dynein) मोटर्स या तो दिशा में पुटिकाओं स्थानांतरित करने या स्थिर रहने के क्रम में उनकी गतिविधियों का समन्वय जिसमें पीआरपी सी पुटिका आंदोलन के नियमन के लिए काम कर रहे एक मॉडल तैयार करने की अनुमति दी . इस पद्धति का एक और ताकत हित के किसी भी अन्य प्रोटीन (एस) के साथ, वास्तव में किसी भी प्रकार की कोशिका में स्थानांतरित कि कई fluorescently लेबल कार्गो के colocalization / संघ निस्र्पक के लिए अपने संभावित व्यापक प्रयोज्यता है. इस प्रकार, जी / तय सहसंबंध संभावित क्षणिक प्रोटीन कार्गो बातचीत का पता लगाने के लिए अनुमति दे सकता है, कणों चलती लेबल के रूप में कई अलग-अलग fluorescently एक वांछित पी से अधिक का विश्लेषण किया जा सकता हैसमय के eriod. व्यापक प्रयोज्यता और इस विधि पता कर सकते हैं कि प्रश्नों के प्रकार को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स में या अन्य प्रकार की कोशिकाओं में उन का अध्ययन कर के अवैध व्यापार और परिवहन सहित सेल जीव की एक व्यापक दर्शकों के लिए ब्याज की हो जाएगा.
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Protocol
सभी प्रयोगों अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन और अनुसंधान जानवरों की मानवीय देखभाल के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की गई. नवजात शिशु चूहों कत्ल द्वारा euthanized थे.
सेल संस्कृति के लिए microfluidic उपकरणों की 1. तैयारी
- हैरिस और उनके सहयोगियों ने 17-19 से वर्णित के रूप में hippocampal न्यूरॉन्स के विकास के लिए polydimethyl siloxane (PDMS) microfluidic उपकरणों तैयार करें. नीचे कार्गो मानचित्रण प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित कर रहे थे कि कुछ संशोधनों हैं.
नोट: Microfluidic उपकरणों भी (माल की सूची) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, एक निर्माण की सुविधा के लिए इस प्रकार पहुँच आवश्यक नहीं है. - उन्हें 100% इथेनॉल के साथ तीन washes और पानी की तीन washes के द्वारा पीछा एसीटोन के साथ तीन बार, धोने से नहीं, 1 आधा कवर चश्मा (24 x 40 मिमी) तैयार करें. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में स्टोर coverslips. इन उपचार coverslips के सेल की चढ़ाना के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि मलबे से साफ कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने में मददरास, संदूषण, और अस्तित्व.
नोट: एसीटोन और इथेनॉल साँस लेना के, घूस की, ज्वलनशील और नेत्र संपर्क (अड़चन) की त्वचा से संपर्क करें (अड़चन), के मामले में खतरनाक हैं. सरकारी नियमों के अनुसार फेकें. - जब, उपयोग microfluidic डिवाइस प्रति एक 60 मिमी सेल संस्कृति डिश में एक कांच कवर जगह है, और यह शुष्क हवा संक्रमण से बचने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर 45 मिनट के लिए खुला जाने के लिए तैयार है.
- उपकरणों मास्टर्स से बाहर काट रहे हैं और घूंसे जलाशयों बनाने के लिए कटौती की गई है, के बाद (चित्रा 1 ए, बी), नसबंदी के लिए 45 मिनट के लिए एक यूवी दीपक के साथ सुसज्जित एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर microfluidic चैनलों पक्ष-अप के साथ उन्हें जगह है.
नोट: अब से 2 घंटे के लिए यूवी उपचार के तहत उपकरणों छोड़कर PDMS की अखंडता को प्रभावित कर सकता है. - Microfluidic चैनलों नीचे का सामना करना इतना है कि 60 मिमी प्लास्टिक सेल संस्कृति पकवान अंदर प्रत्येक कवर कांच पर एक युक्ति रखकर उपकरणों को इकट्ठा करो. शीर्ष ओ कोमल दबाव लागू करेंडिवाइस च कांच कवर करने के लिए इस उपकरण के लिए एक गैर-स्थायी मुहर प्रदान करने के लिए (microchannels के छूने से बचें). एक ढक्कन के साथ प्रत्येक 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान कवर.
- एक micropipette का प्रयोग, पानी के माध्यम से प्रवाह करने की इजाजत दी, शीर्ष दो microfluidic जलाशयों (चित्रा 1 ए में 1 और 2) को सेल संस्कृति ग्रेड पानी जोड़कर उपकरणों हाइड्रेट. एक micropipette साथ पानी निकालें और microfluidic जलाशय 1 (200 μl) और 2 (100 μl) में 1 मिलीग्राम / एमएल पाली एल Lysine जोड़ें. मात्रा अंतर microchannels (चित्रा 1 ए, बी) के माध्यम से प्रवाह के लिए पाली एल Lysine के लिए अनुमति देगा.
- 60 मिमी सेल संस्कृति बर्तन के अंदर उपकरणों एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर से अधिक का तख्ता पलट नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए, एक 150 मिमी प्लास्टिक सेल संस्कृति डिश में उपकरणों से युक्त तीन 60 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन जगह और एक ढक्कन के साथ पकवान कवर. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन सेते हैं. आमतौर पर चैनलों का 90% से अधिक प्रति युक्ति प्रयोग करने योग्य हैं और करते हैंकिसी भी हवाई बुलबुले या शारीरिक रुकावट शामिल नहीं.
- अगले दिन, पानी के साथ पाली एल लाइसिन की जगह और कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में डिवाइस छोड़ दें. इस वाशिंग तीन बार दोहराएँ. पानी निकालें और प्रत्येक डिवाइस के लिए (2% बी -27 पूरक और 500 माइक्रोन GlutaMAX युक्त) Neurobasal-एक मध्यम विकास जोड़ें. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन छोड़ दो.
- नीचे वर्णित के रूप में अगले दिन, हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं थाली.
Microfluidic उपकरणों में माउस hippocampal प्राथमिक न्यूरॉन्स की 2. चढ़ाना
नोट: नवजात शिशु चूहों से सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स की तैयारी पहले से जौव 25 में प्रकाशित किया गया है. नीचे microfluidic उपकरणों में थाली माउस hippocampal न्यूरॉन्स के लिए अनुकूलित कर रहे थे कि कुछ संशोधनों के हैं, और कि transfections के लिए इष्टतम थे.
- माउस मस्तिष्क विच्छेदन से पहले, पूर्व गर्म Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम(एफ बी एस, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना), मिश्रण एक (125 मिलीग्राम डीएल-सिस्टीन, 125 मिलीग्राम गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 मिलीलीटर में ग्लूकोज़ की 3.125 जी, फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ) एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में:, और मैं समाधान (50 DNase मैं की मिलीग्राम और 100 मिलीग्राम हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) फिल्टर में एक 1.2 मीटर MgSO 4 समाधान के 0.5 मिलीलीटर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ मैं DNase) deoxyribonuclease.
- 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर प्री-गर्म Neurobasal-एक मध्यम विकास पीएच संतुलित करना.
- स्थापित प्रोटोकॉल 26 के अनुसार 1-3 दिन पुराने नवजात शिशु चूहों से हिप्पोकाम्पी काटना. बर्फ पर (10 मिमी HEPES 7.4 पीएच, 50 मिमी ग्लूकोज, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति युक्त HbSS) 10 मिलीलीटर विच्छेदन बफर, जिसमें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हिप्पोकाम्पी रखें. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब प्रति 4 हिप्पोकाम्पी करने के लिए डाल दिया.
- शेष प्रोटोकॉल प्रदर्शन बाँझ शर्त के तहत हैएक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर है.
- मिश्रण एक, भंवर के 5 मिलीलीटर में papain की 45 इकाइयों पतला, और papain पाउडर भंग कर रहा है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. DNase मैं समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर यूनिट के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर.
- 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त हिप्पोकाम्पी से ध्यान से महाप्राण HBSS '. जोड़ें 10 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS हिप्पोकाम्पी करने और उन्हें ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं. ध्यान से 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से HBSS महाप्राण.
- मैं करने के लिए 4 हिप्पोकाम्पी को मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए सेते 1 मिलीलीटर papain / DNase जोड़ें. शंक्वाकार ट्यूब मिश्रण के साथ हिप्पोकाम्पी स्नान करने के लिए हर 5 मिनट झुकाएँ. वैकल्पिक रूप से कोमल मिलाते (~ 100 आरपीएम) के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान प्रकार के बरतन में हिप्पोकाम्पी जगह है.
- महाप्राण papain / मैं मिश्रण और 10% FBS युक्त पूर्व गर्म DMEM (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ हिप्पोकाम्पी दो बार धोना DNase.
- दूसरा धोने के बाद, 2 हिप्पोकाम्पी 10% FBS युक्त पूर्व गर्म DMEM के मिलीलीटर और pipetting द्वारा मैन्युअल महीन चुर्ण बनाना हिप्पोकाम्पी जोड़नाअप और न्यूरॉन्स अलग कर देना करने के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग 10-12 बार ~ नीचे.
- इस गैर-अलग न्यूरॉन्स शंक्वाकार ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देगा महीन चुर्ण बनाना ~ 1 मिनट के लिए समझौता करते हैं. ट्यूब के नीचे बसे है कि बड़े ऊतक के हस्तांतरण से बचने के लिए एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को अलग न्यूरॉन्स युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- 2 मिनट के लिए 1000 XG पर कोशिकाओं स्पिन और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटायें. धीरे pipetting द्वारा 80 μl Neurobasal-एक मध्यम विकास में कोशिकाओं Resuspend.
- Microfluidic जलाशय 1 और 1 'से मध्यम निकालें. Microfluidic जलाशय 1 से कोशिकाओं के 20 μl (~ 275000) लागू करें, और उन के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति देते हैं. 20 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डिवाइस रखें.
- कोशिकाओं कवर कांच का पालन किया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे देखो. सभी जलाशयों ऊपर से Neurobasal-एक मध्यम विकास जोड़ें. 5% सीओ के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ डिवाइस लौटें
- उपकरणों हर ~ (GlutaMAX बिना) Neurobasal-ए युक्त 2% बी 27 के पूरक के साथ 2-3 दिन और ऊपर से जलाशयों से बचने के लिए वाष्पीकरण की जाँच करें. न्यूरॉन्स चढ़ाना के बाद ~ microfluidic चैनलों के माध्यम से 2-3 दिन उनके एक्सोन का विस्तार करना शुरू करते हैं. विषय न्यूरॉन्स चढ़ाना के बाद आम तौर पर 7-10 दिनों अभिकर्मक के लिए.
Microfluidic डिवाइस में बढ़ी hippocampal न्यूरॉन्स की 3. अभिकर्मक
- प्रति युक्ति, 30 μl Neurobasal-ए में 1.2 μl 2000 Lipofectamine का मिश्रण है, और 30 μl Neurobasal-ए में 0.5 माइक्रोग्राम प्रति फ्लोरोसेंट कार्गो संलयन प्लाज्मिड का मिश्रण तैयार करने और आरटी पर 5 मिनट सेते हैं. डीएनए मिश्रण करने के लिए Lipofectamine मिश्रण जोड़ें और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. डीएनए के लिए 4% बी -27 पूरक युक्त Neurobasal-ए के 60 μl जोड़ें / Lipofectamine मिश्रण और ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण.
- 'Microfluidic जलाशय 2 और 2 से सभी मीडिया निकालें और ध्यान से मध्यम पूर्णांक पर spilling के बिना 2% बी -27 पूरक युक्त Neurobasal-ए के साथ कुओं को भरनेअन्य डिब्बों ओ.
- Microfluidic जलाशय 1 और 1 'से मीडिया निकालें. डीएनए के 120 μl जोड़ें / Lipofectamine microfluidic जलाशय 1 के लिए मिश्रण है और यह प्रवाह करते हैं. 3-4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर डिवाइस लौटें.
- 'Microfluidic जलाशय 1 और 1 से सब मीडिया निकालें और 24 घंटे के लिए Neurobasal-ए युक्त 2% बी 27 के पूरक के साथ की जगह (या तैयार है जब तक छवि के लिए). आमतौर पर, microchannels के माध्यम से विकसित है कि 5-7 एक्सोन लगभग हिप्पोकैम्पस संवर्धित कोशिकाओं 26 के लिए प्रकाशित क्षमता के साथ संगत 1-3% अभिकर्मक दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं जो उन शर्तों के तहत ट्रांसफ़ेक्ट हैं.
4. "कार्गो मानचित्रण" विश्लेषण
- कार्गो आंदोलन की लाइव इमेजिंग
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और एक सीओ 2 नियंत्रण कक्ष से लैस एक औंधा epifluorescence प्रकाश माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग प्रदर्शन.
- एक माइकर में उगाई hippocampal न्यूरॉन्स के साथ coverslip माउंटखुर्दबीन मंच पर ofluidic डिवाइस. Neuronal मौत से बचने के लिए, अब से 1 घंटे के लिए माइक्रोस्कोप में नमूने बनाए रखने के लिए शीघ्र काम करते हैं.
- एक उच्च संकल्प उद्देश्य (100x) का प्रयोग, microfluidic कक्षों के चैनलों के माध्यम से विस्तार और ट्रांसफ़ेक्ट अक्षतंतु पाया गया था जिसमें चैनलों की संख्या रिकॉर्ड कि ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के axons हैं. एक हाथ मिलान काउंटर का उपयोग चैनलों की संख्या की गणना.
- लाइव आंदोलन और बाद colocalization विश्लेषण के इष्टतम रिकॉर्डिंग के लिए, सबसे पुटिकाओं की कि इमेजिंग ध्यान में प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि चैनलों के माध्यम से अपेक्षाकृत सपाट हो जाना कि axons के लिए चुनते हैं.
- एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ जलाशयों 2 और 2 'से मध्यम के सबसे निकालें. Kymographs पर आंदोलन trajectories के साथ तय की छवियों के बाद संरेखण की सुविधा, इमेजिंग (चित्रा 1 बी, सी) के दौरान देखने के क्षेत्र के साथ microchannels के ठीक किनारे संरेखित.
- Fixin की सुविधा के लिएइमेजिंग के दौरान नमूनों की जी, दो लोगों के साथ रहते इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं. लाइव इमेजिंग एक ही व्यक्ति द्वारा किया जाता है तो वैकल्पिक रूप से, बहाव सुधार से लैस एक माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करें.
- (चित्रा 2 और माल सूची की कथा में निर्दिष्ट हैं YFP-पीआरपी सी इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप विनिर्देशों और सेटिंग) समय चूक विश्लेषण किया जा रहा माल के परिवहन की गतिशीलता के लिए विशिष्ट विशेषताओं के साथ इमेजिंग लाइव कार्गो आंदोलन शुरू करो.
- पर्याप्त लाइव आंदोलन डेटा एकत्र किया गया है, के बाद एक व्यक्ति पीबीएस में पूर्व गर्म 4% paraformaldehyde कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 0.04 ग्राम / मिलीलीटर सुक्रोज को रोकने के साथ 'जलाशयों 2 और 2 को भरने है. इस लाइव इमेजिंग का ध्यान केंद्रित को बाधित करेगा के रूप में, microfluidic डिवाइस को छूने से बचें. लगानेवाला जोड़ा जाता है, जबकि दूसरे व्यक्ति को ध्यान समायोजित किया है. आंदोलन के तत्काल रोक मनाया जाता है जब फिक्सेशन सफल है. बाद में 1 और 1 'जलाशय लगानेवाला जोड़ें.
नोट: अस्थाई photobleaकार्गो प्रतिदीप्ति की चिंग भी मनाया जा सकता है, लेकिन मोटर प्रोटीन के लिए यदि धुंधला (अगले चरण) पूर्ण होने के बाद प्रतिदीप्ति बनी रहती है.
नोट: Paraformaldehyde त्वचा के संपर्क में, साँस लेना द्वारा हानिकारक है, और अगर निगल लिया. आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा के लिए परेशान. सरकारी नियमों के अनुसार फेकें.
- यदि colocalization विश्लेषण के लिए मोटर प्रोटीन का धुंधला
नोट: अलग-अलग चलती कार्गो के लिए जुड़े मोटर प्रोटीन के सापेक्ष स्तरों (एंटीबॉडी धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में), के quantitation के लिए, मान्य है और एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी संतृप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एंटीबॉडी टाइट्रेट. यह ब्याज की प्रोटीन या तो खटखटाया बाहर कर दिया गया है, जिसमें न्यूरॉन्स या खटखटाया नीचे का उपयोग एंटीबॉडी की विशिष्टता का निर्धारण द्वारा किया जाता है, और प्रदर्शन से यदि एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ाने के साथ विश्लेषण. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, न्यूरॉन्स प्राथमिक एंटीबॉडी के अभाव में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं. अधिक विस्तृतएंटीबॉडी सत्यापन का वर्णन Encalada एट अल. 16, और Szpankowski एट अल. 20 में पाया जा सकता है.- खुर्दबीन मंच से microfluidic डिवाइस में उगाई hippocampal न्यूरॉन्स के साथ coverslip निकालें. Microchannels रहते हैं और तय छवियों मिलाना के क्रम में बरकरार रहने की जरूरत है, के रूप में coverslip से microfluidic डिवाइस को अलग न करें. एक आर्द्रता चैम्बर में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.
- Microchannels में समाधान के प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए, कम से कम 30 μl की ', 2, और 2' जलाशयों 1, 1 के बीच एक बफर मात्रा अंतर बनाए रखें. बाद के सभी चरणों में. उदाहरण के लिए, 'microfluidic जलाशय 1, 1, और 70 μl मीडिया मात्रा' microfluidic जलाशय 2, 2 को 100 μl मीडिया मात्रा में जोड़ें.
- Microfluidic डिवाइस के कक्षों से लगानेवाला निकालें और पीबीएस washes के बीच 10 मिनट के इंतज़ार के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
- 0.1% ट्राइटन X-100 dilu जोड़कर कोशिकाओं permeabilizeसभी जलाशयों को 5 मिनट के लिए पीबीएस में टेड.
- सभी जलाशयों से समाधान निकालें और पीबीएस के साथ धो लो. धोने washes के बीच 10 मिनट इंतज़ार तीन बार दोहराएँ.
- सभी जलाशयों से समाधान निकालें और पीबीएस में 10% सामान्य गधा सीरम और 3% प्रोटीज मुक्त और इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) मुक्त बीएसए युक्त बफर अवरुद्ध लागू करते हैं और आरटी पर कम से कम 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- 5 मिनट के अवक्षेप को दूर करने के लिए 20,000 XG पर प्राथमिक एंटीबॉडी शेयर समाधान स्पिन. बफर अवरुद्ध में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी पतला. एंटीबॉडी समाधान के साथ microfluidic डिवाइस से अवरुद्ध बफर बदलें. 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या ओ / एन में 2 घंटे के लिए नमूने सेते हैं.
- सभी जलाशयों से समाधान निकालें और washes के बीच 10 मिनट इंतज़ार, पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- 5 मिनट के अवक्षेप को दूर करने के लिए 20,000 XG पर माध्यमिक एंटीबॉडी शेयर समाधान स्पिन. बफर अवरुद्ध में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी पतला. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ पीबीएस बदलें. सेनाआरटी पर 1 घंटे के लिए नमूने हैं.
- सभी जलाशयों से समाधान निकालें और washes के बीच 10 मिनट इंतज़ार, पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- सीधे जलाशयों को जोड़ने चैनल के उद्घाटन में बढ़ते मध्यम pipetting द्वारा 10-20 μl बढ़ते मध्यम ~ साथ पीबीएस बदलें. आरटी पर 1 घंटा - ~ 20 मिनट के लिए मीडिया शुष्क बढ़ते चलो.
- धुंधला के दो दिन (अधिकतम एक सप्ताह) के भीतर photobleaching से बचने के लिए प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर उपकरणों, और छवि एक्सोन.
- धुंधला पूरा हो जाने के बाद, खुर्दबीन मंच पर microfluidic डिवाइस में उगाई hippocampal न्यूरॉन्स के साथ coverslip माउंट. कदम 4.1.1-4.1.7 में imaged ट्रांसफ़ेक्ट अक्षतंतु के क्षेत्र का पता लगाएँ.
- एक उच्च संकल्प उद्देश्य (जैसे, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल या पानी उद्देश्य) का उपयोग, कार्गो, मोटर 1, मोटर 2: तीन चैनलों में से प्रत्येक के लिए जेड ढेर छवियों (300 एनएम कदम) मोल.
नोट: एक्सोन अक्सर पूरी तरह से फ्लैट हो जाना नहीं है के रूप में जेड के ढेर के अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण हैसभी फ्लोरोसेंट puncta microchannels में है और इसलिए नहीं एक ही फोकल हवाई जहाज़ में हैं.
- कार्गो मैपिंग
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कार्गो आंदोलन के एक kymograph उत्पन्न करता है. Rietdorf और Seitz (EMBL) द्वारा विकसित ImageJ प्लगइन kymographs पैदा करने के लिए सिफारिश की है (डाउनलोड के लिए देख माल की सूची).
नोट: ImageJ स्वास्थ्य 27,28 के राष्ट्रीय संस्थान में विकसित एक सार्वजनिक डोमेन, जावा आधारित इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम है (डाउनलोड के लिए सामग्री की सूची देखें). - (सामग्री, निर्धारण की बात (चित्रा 2A, बी) में kymograph में trajectories के स्थिति पर उन्हें superimposing एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेखांकन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर स्वयं (कदम 4.2.14 में उत्पन्न) फ्लोरोसेंट कार्गो की अचल छवियों को संरेखित सूची). मैन्युअल पहले kymograph पर तय कार्गो छवि superimposing और मैन्युअल पर एक विशिष्ट पथ से मेल खाती है कि कार्गो puncta चुनकर संरेखितkymograph. सबसे अच्छा संरेखण परिणामों के लिए, मैप किए गए माल के लिए सबसे अच्छा ध्यान में है कि जेड टुकड़ा का उपयोग करें. कई जेड स्लाइस इस्तेमाल किया जा सकता है.
- XY निर्देशांक और एक स्थापित कलन विधि का उपयोग कर प्रत्येक फ्लोरोसेंट puncta के लिए तीव्रता आयाम का प्रतिनिधित्व करता है कि बात फैल समारोह के लिए 2 डी Gaussians फिट करने के लिए निर्धारित, प्रत्येक z ढेर में छवि (कदम 4.2.14 में उत्पन्न कार्गो, मोटर 1 और मोटर 2) तीन चैनलों 16,20,21 (चित्रा 2 डी) में से प्रत्येक में प्रत्येक बिंदु स्रोत.
नोट: Jaqaman, Danuser और उनके सहयोगियों ने 21-23 से विकसित एक गाऊसी फिटिंग कलन विधि को शामिल किया जो XY निर्देशांक, 16,20 विकसित किया गया था "मोटर colocalization" नामक एक कस्टम बनाया MATLAB सॉफ्टवेयर पैकेज प्राप्त करने के लिए. इसके उपयोग के लिए सॉफ्टवेयर पैकेज और विस्तृत निर्देश अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है. - Kymograph पर मोबाइल या स्थिर प्रक्षेप पथ पर मैप किया गया है कि व्यक्तिगत रूप से कार्गो puncta के प्रत्येक के लिए, टी चयनउन्होंने कहा, "मोटर colocalization" कार्यक्रम के परिणामों से निर्देशांक और तीव्रता आयाम (इन कार्गो व्यक्तिगत रूप चित्रा 2B में चिह्नित कर रहे हैं) XY. विभिन्न फोकल विमानों पर पाए जाते हैं कि अधिक कार्गो नक्शा करने के लिए कदम 4.2.14 में अधिग्रहीत कई जेड ढेर छवियों) का प्रयोग करें.
- व्यक्तिगत XY इसी जेड टुकड़ा (चित्रा 2 डी) में मोटर चैनलों में से प्रत्येक के लिए प्राप्त उन लोगों के लिए मैप कार्गो के लिए निर्देशांक की तुलना करें. निर्धारित और कार्गो की एक 300 एनएम के दायरे में हैं कि XY मोटर निर्देशांक का चयन करें. कार्गो और एक ही फोकल हवाई जहाज़ के भीतर संकेत है कि मोटर्स के लिए, एक 300 एनएम के दायरे में स्थित हैं कि puncta निर्धारित करने के लिए "मोटर colocalization" सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करें.
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कार्गो आंदोलन के एक kymograph उत्पन्न करता है. Rietdorf और Seitz (EMBL) द्वारा विकसित ImageJ प्लगइन kymographs पैदा करने के लिए सिफारिश की है (डाउनलोड के लिए देख माल की सूची).
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Representative Results
चित्रा 1 hippocampal न्यूरॉन्स विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया microfluidic डिवाइस का अवलोकन से पता चलता है (चित्रा 1 ए, बी). न्यूरॉन्स चैनलों की लंबाई axonal डिब्बे के लिए सभी रास्ते को पार करने से वृक्ष के समान अनुमानों को रोकता है, जबकि microchannels के आकार axonal डिब्बे में सेल निकायों (सोम) के प्रसार को रोकता जलाशय 1 में चढ़ाया जाता है. संस्कृति में ~ 2-3 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स axonal कम्पार्टमेंट (चित्रा 1 बी, सी) में microchannels भर में उनके एक्सोन विस्तार शुरू. पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP-पीआरपी सी) के साथ लेबल सामान्य prion प्रोटीन व्यक्त ट्रांसफ़ेक्ट एक्सोन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1C) द्वारा पहचाना जा सकता है. प्लाज्मिड अभिकर्मक का उपयोग fluorescently लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण बदल प्रोटीन रचना करने के लिए प्रयोगात्मक कलाकृतियों को पेश हो सकता है overexpression के रूप में उचित subcellular स्थानीयकरण और समारोह के लिए जाँच की जानी चाहिए. इस प्रकार, colocalizatआयन प्रयोगों जैव रासायनिक सह वर्षा पढ़ाई के साथ, साथ ही endogenously व्यक्त प्रोटीन के लिए यदि धुंधला के साथ दोनों को बधाई दी जानी चाहिए. यहां इस्तेमाल YFP-पीआरपी सी का व्यवहार पहले 16 परीक्षण किया गया था. क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट neuroblastoma कोशिकाओं (N2a) में YFP-पीआरपी सी की अभिव्यक्ति क्षणिक अभिकर्मक अत्यधिक overexpressed YFP-पीआरपी सी का स्तर 16 में परिणाम नहीं करता है, सुझाव है कि कम था. इसके अलावा, YFP-पीआरपी सी पीआरपी सी खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट N2a कोशिकाओं की अगर YFP-पीआरपी सी अत्यधिक दोनों ट्रांसफ़ेक्ट और अंतर्जात पीआरपी सी इसी प्रकार व्यवहार किया, सुझाव है कि अंतर्जात पीआरपी सी के साथ colocalized कि संकेत दिया. पीआरपी सी मोटर्स के साथ जुड़ा हुआ है कि पता लगाने के लिए, पुटिका immunoisolations 16 प्रदर्शन किया गया.
इष्टतम कार्गो मानचित्रण अध्ययन के लिए, microchannels के ठीक किनारे रहते हैं और तय आईएमए के दौरान देखने के क्षेत्र के साथ गठबंधन किया हैछवि के क्रम में अक्षतंतु के एक ही क्षेत्र ging 2 चित्रा. (चित्रा 1 बी, सी में लाल आयत ने संकेत दिया) और चित्रा 3 मानचित्रण क्षणिक YFP-पीआरपी सी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स का विश्लेषण करती है कार्गो के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. YFP-पीआरपी सी ले जाने vesicles kinesin-1 परिवार और dynein भारी चेन 1 (DYNC1H1) 16 के सदस्यों द्वारा स्तनधारी axons में ले जाया जाता है, इसलिए YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं kinesin-1 सबयूनिट kinesin प्रकाश श्रृंखला 1 को (KLC1) मैप किया गया , और मोटर्स DYNC1H1 लिए. YFP-पीआरपी सी पुटिका आंदोलन imaged और एक kymograph (2A चित्रा) में साजिश रची गई थी. Kymographs में, अग्रगामी और YFP-पीआरपी सी vesicles के प्रतिगामी आंदोलन क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक ढलानों, साथ प्रक्षेप पथ का प्रतिनिधित्व करती है, और स्थिर पुटिकाओं खड़ी trajectories के द्वारा चित्रित कर रहे हैं. निर्धारण में, सभी आंदोलन kymograph में विकर्ण लाइनों के अभाव ने संकेत दिया बंद(2A चित्रा). तय, permeabilized axons में आणविक मोटर्स और कार्गो के संकेत अगर कबरा 16 (चित्रा 2 बी, सी) है. "कार्गो मानचित्रण" का लक्ष्य कार्गो चैनल (चित्रा 2B) में puncta अन्य दो चैनलों में मोटर puncta (चित्रा -2) के साथ colocalize निर्धारित करने के लिए है. ऐसा करने के लिए, तय YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं, और vesicular puncta के लिए जुड़े KLC1 और DYNC1H1 इसी की अगर छवियों के फ्लोरोसेंट छवियों kymograph (चित्रा 2 बी, सी) के लिए गठबंधन किया गया. गाऊसी कार्यों लाइव इमेजिंग (चित्रा 2 डी) से प्राप्त कार्गो trajectories के लिए मोटर्स की सटीक XY पदों नक्शा करने के क्रम में सभी तीन चैनलों में फ्लोरोसेंट बिंदु सूत्रों की बात फैल कार्य करने लगे थे. Endogenously KLC1 और DYNC1H1 मोटर्स कबरा धुंधला के रूप में दिखाई देते हैं और YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं (चित्रा 2 डी) के साथ विभिन्न colocalized व्यक्त किया. Colocalization गाऊसी XY की colocalization YFP-पीआरपी सी और KLC1 और DYNC1H1 puncta के प्रत्येक के बीच पदों के समन्वय का स्तर (चित्रा 3 ए से 300 एनएम की दूरी के भीतर YFP-पीआरपी सी की मौजूदगी और मोटर puncta द्वारा परिभाषित और मात्रा निर्धारित किया गया था ). इस दूरी प्रकाशिकी, प्रकाश के विवर्तन सीमा, और कार्गो और मोटर सब यूनिटों के प्रासंगिक शारीरिक आकार के आधार पर चुना गया था. YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं के साथ जुड़े KLC1 और DYNC1H1 के रिश्तेदार राशि प्रत्येक puncta (3B चित्रा) की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं जो गाऊसी आयाम, से प्राप्त हुई थी. वांछित के रूप में इन आंकड़ों आगे का विश्लेषण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मोटर्स की तीव्रता नियंत्रण के बीच YFP-पीआरपी सी puncta (जंगली प्रकार - गुम्मट) के साथ colocalizing न्यूरॉन्स और उन अन्य kinesin-1 सब यूनिटों की कमी (KIF5C - / - चित्रा 3 ए में न्यूरॉन्स, KIF5C kinesin-1 का सदस्य है परिवार), तो यह निर्धारित करने के लिए तुलना की जा सकती KIF5 का अभावसी (KLC1 और DYNC1H1 तीव्रता हमारे प्रयोगों 16 में अपरिवर्तित थे) YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं को KLC1 और / या DYNC1H1 के सहयोग से बाधित. इसके अलावा, KLC1 और DYNC1H1 तीव्रता रिश्तेदार मोटर मात्रा में और आंदोलन की दिशात्मकता (3B चित्रा) के बीच संभव सहसंबंध की जांच करने के लिए साजिश रची जा सकता है. उदाहरण के लिए, YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं आगे बढ़ रहे हैं और / या स्थिर KLC1 और / या DYNC1H1 (3B चित्रा) दोनों के साथ जुड़े.
Microfluidic उपकरणों में सुसंस्कृत चित्रा 1 hippocampal न्यूरॉन्स. एक microfluidic डिवाइस के (ए) चित्र. जलाशयों की रूपरेखा लाल और नीले रंगों से कल्पना कर रहे हैं. नंबरिंग प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल microfluidic जलाशयों की संख्या दर्शाता है. एक microfluidic डिवाइस (बी) आरेख. नंबर जलाशयों के अनुरूप मैंमीडिया और न्यूरॉन्स जोड़ रहे हैं जो एन. ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स हरे रंग में दिखाया गया है. लाल आयत और लाल बिंदीदार तीर रहते हैं और निश्चित प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए सिफारिश क्षेत्र से संकेत मिलता है. YFP-पीआरपी सी एक भी microchannel के माध्यम से बढ़ के साथ ट्रांसफ़ेक्ट दो axons की (सी) छवि (एक microchannel और डिवाइस के किनारे बिंदीदार सफेद लाइनों द्वारा उल्लिखित है) . व्यक्तिगत रूप से चलती YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं उज्जवल puncta के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है. स्केल बार 10 माइक्रोन है. . चित्रा से अनुकूलित है. Encalada एट अल 16 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. "कार्गो मानचित्रण" के साथ YFP-पीआरपी सी पुटिका परिवहन सहसंबंधीYFP के kinesin और dynein मोटर्स के रिश्तेदार मात्रा. लाइव आंदोलन की और एक मोटर चालित मंच और एक सीसीडी कैमरा और एक 100X / 1.4 एनए तेल उद्देश्य से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया तय कार्गो के व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति छवियों. (ए) kymograph चित्रा 1C में दिखाया axons की -PrP सी पुटिका आंदोलन. लाइव आंदोलन 30 से 100 एमएस जोखिम (10 हर्ट्ज) पर 60 सेकंड से लेकर कुल समय के लिए दर्ज किया गया था. कोशिकाओं में कम से कम 15 सेकंड के लिए कार्गो आंदोलन इमेजिंग के बाद तय किया गया. बिंदीदार रेखा लाइव इमेजिंग के दौरान निर्धारण के समय को इंगित करता है. लाल बॉक्स (बी, सी) में प्रकाश डाला और में बढ़े vesicles के क्षेत्र से पता चलता है (डी). Arrowheads (डी) स्थिर (नीला) के लिए इसी प्रतिगामी (लाल), और अग्रगामी (हरा) प्रक्षेप पथ में दिखाया तीन पुटिकाओं को इंगित. ( इसी kymograph के लिए गठबंधन तय YFP-पीआरपी सी vesicles के बी) छवि. संख्या में संकेत मिलता हैkymograph पर puncta रूप से पहचान करने के लिए मैप किया गया कि जुदा YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं. अग्रगामी पुटिकाओं प्रतिगामी लाल कर रहे हैं, और स्थिर वाले नीले, हरे हैं. KLC1 और DYNC1H1 puncta के छवियों (बी) में दिखाया गया है एक ही क्षेत्र के लिए इसी अगर फिक्स्ड (सी). स्केल बार (एसी) 10 माइक्रोन है. तय अगर (डी) वृद्धि 2D गाऊसी समारोह कार्य के साथ तीन चैनलों में से प्रत्येक का संकेत है. ब्लू डॉट्स लाल डॉट्स गाऊसी फिट बैठता है का प्रतिनिधित्व करते हैं, स्थानीय तीव्रता Maxima पिक्सल का प्रतिनिधित्व करते हैं, और गुलाबी डॉट्स दोनों के बीच ओवरलैप कर रहे हैं. तीर (ए) में दिखाया गया YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं के उदाहरण से संकेत मिलता है, और KLC1 और DYNC1H1 मोटर प्रोटीन के साथ उनके अंतर colocalization. स्केल बार 2 माइक्रोन है. . चित्रा से अनुकूलित है. Encalada एट अल 16 वीं का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा है.
चित्रा 3. मात्रात्मक YFP-पीआरपी सी vesicles के "कार्गो मानचित्रण" का विश्लेषण करती है. YFP-पीआरपी सी पुटिकाओं, गुम्मट में KLC1 और DYNC1H1 और KIF5C पीटकर न्यूरॉन्स के बीच colocalization की (ए) मात्रा (KIF5C - / -). / - -. = 1629 16 सलाखों के अंदर नंबर वर्ग प्रति पुटिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व विश्लेषण किया puncta के कुल संख्या एन गुम्मट = 887 और एन KIF5C था. SEM के ± औसत हैं दिखाया गया है. गैर पैरामीट्रिक क्रमचय टी परीक्षण. जीनोटाइप 29 के बीच तुलना के लिए इस्तेमाल किया (ए) में डेटा का विश्लेषण के गुम्मट न्यूरॉन्स में रिश्तेदार मोटर रचना और आंदोलन की दिशात्मकता (बी) सहसंबंध गया था. Encalada एट अल 16:. चित्रा से अनुकूलित है..jove.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाइव न्यूरॉन्स में रिश्तेदार के प्रकार और जुड़े मोटर प्रोटीन की मात्रा के साथ व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट सूक्ष्मनलिका आधारित चलती कार्गो कणों के आंदोलन के दिशात्मकता के संबंध में सक्षम बनाता है. इससे पहले, axonal vesicular कार्गो की कुल मोटर रचना biochemically शुद्ध पुटिकाओं और organelles के 9,15 की विषम आबादी पर assayed किया गया था. हालांकि, कोशिकाओं के अंदर कार्गो की एक ही प्रकार के लिए निस्र्पक मोटर रचना क्योंकि सजातीय पुटिका आबादी को शुद्ध करने में कठिनाई का चुनौतीपूर्ण हो गया है. मोटर स्टाल-बलों की माप ड्रोसोफिला भ्रूण में सक्रिय मोटर संख्या का अनुमान प्रदान की है, जबकि आंदोलन के दिशात्मकता मोटर्स स्थिरतापूर्वक कार्गो के लिए या कार्गो 12 से / सक्रिय मोटर्स की तेजी संघ / हदबंदी करने के लिए बाध्य किया जा रहा करने के लिए सहसंबद्ध चाहे इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं था. इसलिए "कार्गो मानचित्रण" प्रोटोकॉल descriयहाँ बिस्तर आगे प्रकार और अलग-अलग रहते न्यूरॉन्स में कार्गो चलती करने के लिए जुड़े मोटर्स के सापेक्ष संख्या के बीच संबंध की जांच करने के लिए विकसित किया गया था.
सफलतापूर्वक "कार्गो मानचित्रण" से डेटा प्राप्त करने के लिए यह एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प पर कार्गो आंदोलन की इमेजिंग और तय आईएफएस प्रदर्शन) 1 के लिए महत्वपूर्ण है, 2) 3) क्षेत्र संरेखित, इमेजिंग के दौरान नमूना की तत्काल फिक्सिंग सुनिश्चित और रहते हैं और तय छवियों में ब्याज की एक ही छवियों के लिए आंदोलन kymographs को तय कार्गो और मोटर्स नक्शे, और 4) ठीक XY कार्गो और मोटर प्रोटीन के बीच colocalization की राशि निर्धारित करने के क्रम में माल और मोटर फ्लोरोसेंट puncta के निर्देशांक निर्धारित करते हैं.
इस प्रोटोकॉल microfluidic उपकरणों में उगाई न्यूरॉन्स की समान रूप से आयोजित axons में परिवहन विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट अनुकूल है, यह अनुसंधान सवालों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस आवेदनtion के एंडो / एक्सोसाइटोसिस में शामिल उनके एडाप्टर के साथ vesicles के सहयोग से चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, तस्करी fibroblasts में assays के), या सूक्ष्मनलिका + टिप बंधनकारी प्रोटीन के साथ लेबल सूक्ष्मनलिकाएं का विकास. इन के लिए, microfluidic उपकरणों correlative लाइव के लिए आवश्यक imaged कोशिकाओं और तय इमेजिंग अध्ययन के स्थानीयकरण की सुविधा के लिए gridded coverslips के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल भी समय में एक पैरामीटर परिवर्तन विशिष्ट सेलुलर वातावरण पर निर्भर करता है जिसके लिए सेलुलर घटनाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कोशिका द्रव्य में व्यक्तिगत endosomal संरचनाओं से एक fluorescently लेबल वायरल प्रोटीन की रिहाई endosomal प्रोटीन की अभिव्यक्ति और / या संघ के साथ जोड़ा जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में से एक संभव सीमा उच्च घनत्व कार्गो के मानचित्रण मुश्किल हो सकता है. हालांकि, गाऊसी कार्यों के काम की अनुमति देकर काफी हद तक इस मुद्दे पर गतिरोध उत्पन्नउप-पिक्सेल स्तर पर फ्लोरोसेंट puncta के बीच पदों का गौरव. इसके अलावा, axonal कार्गो मोटर्स के मानचित्रण कम throughput है: वर्तमान में, मानचित्रण न्यूरॉन्स के अभिकर्मक की कम दर और देखने के सीमित क्षेत्र उच्च के लिए आवश्यक उच्च वृद्धि का उपयोग करते समय दी, microfluidic डिवाइस प्रति 2 axons के लिए किया जा सकता है हमारे कैमरे के साथ संकल्प इमेजिंग. इस विधि के भविष्य के घटनाक्रम उच्च दक्षता, fluorescently टैग प्रोटीन या ऐसी वृद्धि होगी जो सभी के Lysotracker या Mitotracker, के रूप में छोटे फ्लोरोसेंट रंगों के साथ organelles के लेबलिंग व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों से न्यूरॉन्स के अलगाव के साथ न्यूरॉन्स transduce को lentiviral प्रणाली का उपयोग शामिल हो सकता है फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल axons की संख्या. इसके अलावा, दर्ज क्षेत्र का आकार बढ़ाई, पिक्सेल आकार और इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया कैमरा के पिक्सेल सरणी के आकार के द्वारा सीमित है. इमेजिंग तकनीक के क्षेत्र में चल रहे घटनाक्रम बड़े क्षेत्र के लिए अनुमति देगाभविष्य में imaged और इसलिए प्रयोगात्मक हालत प्रति प्राप्त आंकड़ों की मात्रा में वृद्धि किया जाना है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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